Vurdering af terapeutisk angiogenese i en murine model af baglemmer iskæmi
Summary
Her præsenteres en kritisk baglemmer iskæmi eksperimentel model efterfulgt af et batteri af funktionelle, histologiske og molekylære tests for at vurdere effektiviteten af angiogene terapier.
Abstract
Kritisk ekstremitet iskæmi (CLI) er en alvorlig tilstand, der indebærer en høj risiko for lavere lemmer amputation. Trods revaskularisering er den guld-standard terapi, et betydeligt antal CLI patienter er ikke egnet til enten kirurgisk eller endovaskulær revaskularisering. Angiogene terapier er ved at dukke op som en mulighed for disse patienter, men er i øjeblikket stadig under efterforskning. Før påføring hos mennesker skal disse terapier testes i dyremodeller, og dets mekanismer skal være klart forstået. En dyremodel af baglemmer iskæmi (HLI) er blevet udviklet ved ligering og excision af den distale eksterne bækkenbens og femorale arterier og vener i mus. Et omfattende panel af tests blev samlet for at vurdere virkningerne af iskæmi og formodede angiogene behandlinger på funktionelle, histologiske og molekylære niveauer. Laser Doppler blev brugt til flowmåling og funktionel vurdering af perfusion. Vævs respons blev evalueret ved en analyse af kapillær densitet efter farvning med anti-CD31 antistof på histologiske sektioner af gastrocnemius-musklen og ved måling af sikkerhed fartøjs tæthed efter diaphonization. Udtryk for angiogene gener blev kvantificeret ved RT-PCR rettet mod udvalgte angiogene faktorer udelukkende i endotelceller (ECs) efter laser opsamling microdissection fra mus gastrocnemius muskler. Disse metoder var følsomme med at identificere forskelle mellem iskæmiske og ikke-iskæmiske lemmer og mellem behandlede og ikke-behandlede lemmer. Denne protokol giver en reproducerbar model af CLI og en ramme for afprøvning af angiogene terapier.
Introduction
Perifer arteriel sygdom (PAD) påvirker overvejende de nedre lemmer. PAD er forårsaget af åreforkalkning, en arterie obstruktion, der kan forårsage alvorlig begrænsning af blodgennemstrømningen i underekstremiteterne1. Intermitterende intermittens er den første manifestation af pad og refererer til muskelsmerter, når du går. CLI er den mest alvorlige fase af PAD, der diagnosticeres hos patienter, der viser iskæmisk hvile smerter, sår eller koldbrand2. Patienter med CLI har en høj risiko for amputation, især hvis ubehandlet3. Lavere lemmer revaskularisering (enten ved åben kirurgi eller en endovaskulær procedure) er i øjeblikket den eneste måde at opnå ekstremiteter bjærgning. Men, omkring 30% af CLI patienter er ikke egnet til disse procedurer, af årsager, der omfatter placeringen af læsioner, mønsteret af arteriel okklusion og omfattende comorbiditet4,5. Derfor er der behov for nye terapier for disse ellers uhelbredelig patienter, med fremme af angiogenese er strategien under mere intens undersøgelse.
Inden testning hos mennesker skal effektiviteten og sikkerheden af nye terapier in vivo overvejes i dyremodeller. Flere modeller er blevet udviklet til studiet af CLI, for det meste ved inducerende hindlem iskæmi (HLI) i mus6,7,8,9,10. Men disse modeller adskiller sig i flere aspekter, herunder arten af arterierne, der er ligerede og/eller exciseret, og om vener og nerver omgivende er dissekeret samt6,7,8, 9,10. Tilsammen vil disse aspekter påvirke sværhedsgraden af skade på iskæmi-reperfusion i hvert enkelt dyr, hvilket gør resultaterne vanskelige at sammenlignes. Derfor er det afgørende at udvikle en effektiv protokol, hvor proceduren for at inducere iskæmi og evaluering af forskellige mål bør være standardiseret til at vurdere, om en given angiogen behandling vil være effektiv. En forsøgsprotokol, der skal dække alle disse aspekter, vil give en omfattende forståelse af de mekanismer, hvormed angiogene terapier udøver deres virkninger, og et mål for deres effektivitet ved hvert af deres resultater. To særskilte værker for nylig offentliggjort af vores team er et godt eksempel11,12, hvor forskellige tilgange til at inducere terapeutisk angiogenese blev vurderet ved hjælp af den samme protokol, der vil blive beskrevet med flere detaljer i denne Protokollen.
Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive en reproducerbar eksperimentel model, der kan efterligne virkningerne af CLI og lægge det eksperimentelle fundament for en omfattende vurdering af de funktionelle, histologiske og molekylære virkninger af formodede angiogene Agenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine modeller af CLI har for det meste bestået i ligering af femoral arterien bare distale til oprindelsen af den profunda rectus 4,5,6,7,8,9. Dette har vist sig at lade det meste af sikkerhedsstillelse cirkulation intakt, som genskaber blodtilførslen til lemmer inden 7 dag 9. Fjernelse af sikkerhe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker José Rino og Tânia Carvalho, lederne af bioimaging Facility og histologi og komparativ patologisk laboratorium for henholdsvis Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Vi takker også Vyacheslav Sushchyk fra Institut for anatomi af Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Finansierings reference: projekt finansieret af UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira støttes af et stipendium (SFRH/BD/80483/2011) fra Fundação para a Ciência e tecnologia.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
