Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Vurdering af terapeutisk angiogenese i en murine model af baglemmer iskæmi

Published: June 8, 2019 doi: 10.3791/59582
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centro Cardiovascular da Universidade de Lisboa, Lisbon School of Medicine of the Universidade de Lisboa, 2Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, 3Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa

Summary

Her præsenteres en kritisk baglemmer iskæmi eksperimentel model efterfulgt af et batteri af funktionelle, histologiske og molekylære tests for at vurdere effektiviteten af angiogene terapier.

Abstract

Kritisk ekstremitet iskæmi (CLI) er en alvorlig tilstand, der indebærer en høj risiko for lavere lemmer amputation. Trods revaskularisering er den guld-standard terapi, et betydeligt antal CLI patienter er ikke egnet til enten kirurgisk eller endovaskulær revaskularisering. Angiogene terapier er ved at dukke op som en mulighed for disse patienter, men er i øjeblikket stadig under efterforskning. Før påføring hos mennesker skal disse terapier testes i dyremodeller, og dets mekanismer skal være klart forstået. En dyremodel af baglemmer iskæmi (HLI) er blevet udviklet ved ligering og excision af den distale eksterne bækkenbens og femorale arterier og vener i mus. Et omfattende panel af tests blev samlet for at vurdere virkningerne af iskæmi og formodede angiogene behandlinger på funktionelle, histologiske og molekylære niveauer. Laser Doppler blev brugt til flowmåling og funktionel vurdering af perfusion. Vævs respons blev evalueret ved en analyse af kapillær densitet efter farvning med anti-CD31 antistof på histologiske sektioner af gastrocnemius-musklen og ved måling af sikkerhed fartøjs tæthed efter diaphonization. Udtryk for angiogene gener blev kvantificeret ved RT-PCR rettet mod udvalgte angiogene faktorer udelukkende i endotelceller (ECs) efter laser opsamling microdissection fra mus gastrocnemius muskler. Disse metoder var følsomme med at identificere forskelle mellem iskæmiske og ikke-iskæmiske lemmer og mellem behandlede og ikke-behandlede lemmer. Denne protokol giver en reproducerbar model af CLI og en ramme for afprøvning af angiogene terapier.

Introduction

Perifer arteriel sygdom (PAD) påvirker overvejende de nedre lemmer. PAD er forårsaget af åreforkalkning, en arterie obstruktion, der kan forårsage alvorlig begrænsning af blodgennemstrømningen i underekstremiteterne1. Intermitterende intermittens er den første manifestation af pad og refererer til muskelsmerter, når du går. CLI er den mest alvorlige fase af PAD, der diagnosticeres hos patienter, der viser iskæmisk hvile smerter, sår eller koldbrand2. Patienter med CLI har en høj risiko for amputation, især hvis ubehandlet3. Lavere lemmer revaskularisering (enten ved åben kirurgi eller en endovaskulær procedure) er i øjeblikket den eneste måde at opnå ekstremiteter bjærgning. Men, omkring 30% af CLI patienter er ikke egnet til disse procedurer, af årsager, der omfatter placeringen af læsioner, mønsteret af arteriel okklusion og omfattende comorbiditet4,5. Derfor er der behov for nye terapier for disse ellers uhelbredelig patienter, med fremme af angiogenese er strategien under mere intens undersøgelse.

Inden testning hos mennesker skal effektiviteten og sikkerheden af nye terapier in vivo overvejes i dyremodeller. Flere modeller er blevet udviklet til studiet af CLI, for det meste ved inducerende hindlem iskæmi (HLI) i mus6,7,8,9,10. Men disse modeller adskiller sig i flere aspekter, herunder arten af arterierne, der er ligerede og/eller exciseret, og om vener og nerver omgivende er dissekeret samt6,7,8, 9,10. Tilsammen vil disse aspekter påvirke sværhedsgraden af skade på iskæmi-reperfusion i hvert enkelt dyr, hvilket gør resultaterne vanskelige at sammenlignes. Derfor er det afgørende at udvikle en effektiv protokol, hvor proceduren for at inducere iskæmi og evaluering af forskellige mål bør være standardiseret til at vurdere, om en given angiogen behandling vil være effektiv. En forsøgsprotokol, der skal dække alle disse aspekter, vil give en omfattende forståelse af de mekanismer, hvormed angiogene terapier udøver deres virkninger, og et mål for deres effektivitet ved hvert af deres resultater. To særskilte værker for nylig offentliggjort af vores team er et godt eksempel11,12, hvor forskellige tilgange til at inducere terapeutisk angiogenese blev vurderet ved hjælp af den samme protokol, der vil blive beskrevet med flere detaljer i denne Protokollen.

Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive en reproducerbar eksperimentel model, der kan efterligne virkningerne af CLI og lægge det eksperimentelle fundament for en omfattende vurdering af de funktionelle, histologiske og molekylære virkninger af formodede angiogene Agenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg er i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU og er godkendt af det institutionelle Dyrevelfærdsorgan og licenseret af DGAV, den portugisiske kompetente myndighed for dyrebeskyttelse (licensnummer 023861/2013)

Forsigtig: flere af de kemikalier, der anvendes i protokollerne er giftige og skadelige. Brug venligst alle relevante sikkerhedspraksisser og personlige værnemidler (handsker, lab coat, fuld længde bukser, og lukkede tå sko)

1. murine model af baglemmer iskæmi

Bemærk: alle eksperimenter udføres på 22-ugers-gamle C57BL/6 hunmus.

  1. Forberedelse af løsninger
    1. Klargøring af anæstesi opløsningen
      Bemærk: denne bedøvelses kombination (medetomidin og ketamin) giver op til 30 min immobilisering og et kirurgisk vindue på 15 min. Effekten kan være vendt af administrationen af atipamezole.
      1. Med en ren 1cc sprøjte trækkes 1 mL medetomidin (1 mg/kg legemsvægt), Eliminer luftbobler for nøjagtige målinger, og tilsæt den til en 15 mL Falcon tube.
      2. Med en ren, 1 CC sprøjte, trække 0,75 mL ketamin (75 mg/kg legemsvægt), fjerne luftbobler for nøjagtige målinger og tilføje det til en 15 mL Falcon tube indeholdende medetomidin.
      3. Tilsæt 8,25 mL sterilt saltvand (0,9% NaCl) for at få 10 mL bedøvelsesmiddel opløsning.
      4. Identificer røret med navnet på forbindelserne, datoen blandet og udløbsdatoen.
      5. Opbevares i mørke ved 4 °C.
    2. Klargøring af den anti-sedative opløsning
      1. Med en ren, 1 CC sprøjte, trække 1 ml Atipamezol (5 mg/kg legemsvægt), fjerne luftbobler for nøjagtige målinger, og tilføje det til en 15 ml Falcon tube.
      2. Tilsæt 9 mL sterilt saltvand (0,9% NaCl) for at opnå 10 mL reversions opløsning.
      3. Identificer røret med navnet på forbindelserne, datoen blandet og udløbsdatoen.
      4. Opbevares i mørke ved 4 °C.
    3. Klargøring af den postoperative analgesi opløsning
      1. Med en ren, 1 CC sprøjte, trække 0,5 mL buprenorphin (100 μL/15-30 g kropsvægt), fjerne luftbobler for nøjagtige målinger, og tilsæt den til en 15 mL Falcon tube.
      2. Tilsæt 9,5 ml sterilt saltvand (0,9% NaCl) for at opnå 10 ml analgesi opløsning.
      3. Identificer røret med navnet på forbindelserne, datoen blandet og udløbsdatoen.
      4. Opbevares i mørke ved 4 °C.
  2. Kirurgisk induktion af baglemmer iskæmi
    1. Kirurgiske værktøjer, der er nødvendige for denne intervention: spidde pincet, fjeder saks, oftalmisk nåle holder, kirurgisk saks og en kanyle holder. Steriliser alle kirurgiske værktøjer i en autoklave før brug. Brug vatpinde til dissektion af subkutant fedt.
    2. Læg sprøjten med anæstesi opløsningen, før du holder musen.
    3. Begrænse dyret ved at anvende kraft bag ørerne mod Buens gitter, holde så meget hud som muligt for at holde musen immobile.
    4. Hold dyret vippes med hovedet sænket og udføre en intraperitoneal injektion af anæstesi opløsningen, holde sprøjten i en 45 ° vinkel med musens krop.
    5. Check for fraværet af pedal tilbagetrækning reflekser, at evaluere dybden af anæstesi.
    6. Fjern håret fra den rigtige bagled ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Brug en chlorhexidin desinficerende sæbe skrubbe til hudtilberedning. Brug et rent papirhåndklæde til at fjerne SUDS. Påfør en chlorhexidin kirurgisk scrub og Beskyt hudområdet med et sterilt drapere, inden du transporterer musene til den kirurgiske sterile Suite.
    7. Placer dyret i dorsale decubitus og fastholde det med de fire lemmer spredt fra hinanden og sikret med tape.
      Forsigtig: Udfør proceduren på en opvarmet pude for at holde dyrets kropstemperatur stabil; den kirurgiske procedure udføres ved hjælp af en dissektion mikroskop ved 10x eller 20x forstørrelse.
    8. Påfør en chlorhexidin antiseptisk opløsning ved hjælp af steril gaze for at færdiggøre hudens forberedelse. Ved hjælp af en nummer 11 kirurgisk skalpel klinge udføre en 1-cm hud indsnit overliggende låret af den rigtige bagdel.
    9. Stump dissekere subkutant fedt udsætter den neurovaskulære bundt. Ved hjælp af de spidser pincet, fjeder saks og den oftalmiske kanyle holder, åbne den membranøse Ilio-femoral kappe for at udsætte de distale eksterne bækkenbens og femorale beholdere.
    10. Dissekere og adskille skibene (arterie og vene) fra nerven. Ved hjælp af en 7,0 ikke-absorberbare polypropylen sutur ligere den distale eksterne bækkenbens arterien og vene og den distale femorale arterie og vene.
    11. Transect segmentet af Ilio-femoral arterien og vener mellem de distale og proksimale knuder med foråret saks.
    12. Luk indsnittet med en absorbtelig sutur (f. eks. 5,0 Vicryl sutur).
    13. Læg sprøjten med den anti-sedative opløsning, og brug den samme metode, som er beskrevet i 1.2.3 og 1.2.4 til at udføre en intraperitoneal injektion af den anti-sedative opløsning.
  3. Post operativ overvågning
    Bemærk: dyrene observeres omhyggeligt hver 15-20 min for at sikre, at alle dyr restituere godt fra anti-sedative; bedøvede dyr er aldrig uden opsyn.
    1. Vurder genopretning fra anæstesi: 1) overvåge hastigheden og dybden af respiration; 2) Vurder dyrenes reflekser (pedal-og øjen stilling)
    2. Udfør en subkutan injektion af postoperativ analgesi hver 8-12 h.
    3. Overvåge dyrene dagligt efter operationen registrering af en kort beskrivelse af dyrets helbredstilstand og kirurgi site udseende, sikre alle suturer er lukket.
    4. Re-sutur indsnit, hvis dehiscens opstår. Hvis det ikke lykkes, skal du anvende en hudbarriere film på snittet for at beskytte mod urin, fækal afføring, friktion og forskydning af huden og for at hjælpe helingsprocessen.

2. vurdering af den angiogene virkning

Bemærk: efter iskæmi induktion, anvende den terapeutiske agens i studiet og opnå følgende procedurer. De trin, der udføres på andre tidspunkter, er beskrevet i det tilsvarende afsnit.

  1. Laser Doppler perfusion Imaging
    1. Fjern håret fra begge baglemmer en dag før analysen ved hjælp af en elektrisk shaveren efterfulgt af depilatory creme.
    2. Bedøvelses musene ved hjælp af anæstesi opløsningen.
    3. Anbring dyret på en 37 °C varmepude i 5 minutter for at sikre, at temperaturen ikke ændres under proceduren
    4. Anbring dyret i liggende stilling med ben sikret i en forlænget position. Mål afstanden mellem højre og venstre ben og fødder for hvert dyr, da placeringen af dyret bør være ens, når proceduren skal gentages for at følgeændringer i bagekstremitets perfusion over tid.
    5. Begynd at hente data ved hjælp af en Laser Doppler perfusion Imager.
    6. Efter overtagelsen er afsluttet, vende anæstesi med den anti-sedative opløsning.
    7. Åbn billedanalyse softwaren, og tegn området af interesse (ROI) omkring den iskæmiske baglemmer og et sammenligneligt ROI omkring den ikke-iskæmiske baglemmer.
    8. Overhold flux-værdierne og bestem perfusion som et forhold mellem perfusion i den iskæmiske ekstremiteter til den i den ikke-iskæmiske lemmer. Ændringer i perfusions forholdet måles over tid.
  2. Analyse af immun histokemi og kapillar tæthed
    1. Efter bedøvelsen, ofrer musene ved livmoderhals dislokation.
    2. For at høste gastrocnemius musklerne i begge ben, skal du først fjerne huden fra begge baglemmer.
    3. Identificer achillessene og adskille senen fra knoglen ved hjælp af en 11-bladet skalpel.
    4. Hold achilles sene og adskille musklen fra skinneben og fibula op til knæet leddet med fjeder saks.
    5. Adskil biceps rectus fra gastrocnemius musklen.
    6. Brug fjeder saks til at skære indsættelser af gastrocnemius muskler på knæet fælles niveau.
    7. Placer de høstede gastrocnemius muskler i en tværgående retning på en lille kork disk ved hjælp af 10% tragacanth.
    8. Fastgør prøverne i flydende, nitrogen kølet isopentan, og opbevar dem ved-80 °C indtil skæring.
    9. Skær 7 μm sektioner af musklen prøver på en kryostat og montere på glas slides.
      Bemærk: protokollen kan sættes på pause her.
    10. Fastgør glas gliderne i en flaske, der indeholder afkølet ren acetone (ca. 50 mL) i 10 min. ved-20 °C.
    11. Tilsæt hydrogen peroxidase 0,3% fortyndet i methanol (50 mL) i 30 min ved stuetemperatur.
    12. Vask to gange i fosfat-bufferet saltvand (PBS) (50 mL) i alt 10 min.
    13. Brug en hydrofobe pen rundt om sektionerne.
      Bemærk: brugen af en hydrofobe pen giver mulighed for at reducere mængden af løsninger, der anvendes i løbet af protokollen. Ved alle inkubationer anvendes 100 μL af alle opløsninger, pr. sektion.
    14. Anvend en blokerende opløsning på 5% kaninserum i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
    15. Enhederne inkubates i 1 time ved stuetemperatur med anti-CD31 rotte monoklonalt antistof fortyndet ved 1:500 i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS.
    16. Vask tre gange i PBS i alt 30 min.
    17. Der tilsættes et sekundært biotinyleret kanin anti-rotte IgG-antistof ved 1:200 i 1% BSA i PBS og 5% kaninserum i 30 minutter ved stuetemperatur.
    18. Vask i PBS som før og tilsæt mærket Avidin-konjugeret peroxidase-kompleks i 30 minutter ved stuetemperatur.
    19. Skyl 3 gange i PBS i 5 min og tilsæt diaminobenzidin (DAB) peroxidase substrat kit i yderligere 5 min.
    20. Modvirker sektionerne med hematoxylinlegemer i 10 s før montering.
    21. Mål kapillar tætheden ved hjælp af et opretstående lysfelt-mikroskop (dvs. antal kapillærer pr. antal myocytter) i 2 forskellige sektioner af 4 særskilte anatomiske områder i hver prøve.
  3. Kontrastmiddel perfusion
    1. Bedøvelses musene ved hjælp af anæstesi opløsningen.
    2. Udfør en median laparotomi ved hjælp af et nummer 15 skalpel blad.
    3. Udsætte abdominal aorta og hale Vena cava, efter tilbagetrækning sideværts tyndtarmen og ved hjælp af fjeder saks.
    4. Indsæt 1 26-gauge kateter cranially i abdominal aorta og en anden i den caudale Vena cava i samme retning.
    5. Sikre katetre på plads ved hjælp af en 5/0 silke sutur til at udføre en ophold sutur.
    6. Vask det vaskulære system med en 37 °C saltopløsning indeholdende heparin (500 enheder/100 mL) skubbet ind i abdominal aorta ved hjælp af en 10 mL sprøjte. Fortsæt forsigtigt perfusion, indtil der ses en klar opløsning, der kommer ud af katetret placeret inde i hale Vena cava.
      Bemærk: normalt er 30 til 40 mL af en hepariniseret saltvandsopløsning nødvendig for at skylle det vaskulære system hos en voksen rotte.
    7. Giv en blanding af adenosin (1 mg/L) og papaverin (4 mg/L) i 2 min.
    8. Der indsprøjtes i aorta kateteret 10 mL af en blanding af 50% bariumsulfat og 5% gelatine.
      Bemærk: opløsningen skal opbevares ved 60 °C for at undgå fortykkelse.
    9. Lad musene være ved-4 °C i mindst 4 timer, for at den vaskulære støbt kan størkne.
    10. Fjern huden fra den nedre del af hver mus.
  4. Diaphonization - spalteholz teknik
    1. Fastgør musene ved nedsænkning i en 10% formaldehyd opløsning i mindst 72 h.
    2. Blege musene ved nedsænkning i en 30% hydrogenperoxid opløsning til 24 h.
    3. Dehydrere musene ved hjælp af fryse substitutions teknikken. Denne metode består i at indsende musene til flere på hinanden følgende passager (i gennemsnit fire) ren acetone ved-20 °C i hver 24 timer.
    4. Tydeliggør musene ved at fordybe det i en opløsning, der indeholder en blanding af 100% benzylbenzoat og 100% Methylsalicylat i en 3:5-andel (denne blanding er også kendt som Spalteholz-opløsning) 13.
    5. Lad musene nedsænkes i Spalteholz-opløsningen inde i et vakuumkammer, indtil det bliver diaphanous, hvilket normalt tager 5 til 7 dage.
    6. Udskift opløsningen, hvis den bliver mørk, før prøven bliver klar.
  5. Kvantificering af sikkerheds fartøjer
    1. Overhold musene, der er suspenderet i Spalteholz-opløsningen under transillumination ved hjælp af et stereotaxisk mikroskop. Brug mikrokirurgi pincet til forsigtigt at forstå og flytte den.
    2. Fotografere hele lemmer ved hjælp af et digitalt kamera tilsluttet mikroskopet.
    3. Få hele lemmer fotografier ved hjælp af den relevante software.
    4. Udfør en manuel segmentering af sikkerheds beholderne ved at fremhæve dem ved hjælp af den relevante software.
      Bemærk: sikkerhedsstillelse fartøjer er defineret i henhold til longlands definition, en defineret stilk, Mid-zone, og re-nytilkommen, med en diameter på mellem 20 og 300 μm, undtagen femoralis, saphena og popliteale arterier og alle venøse strukturer.
    5. Definer ROIs i hver mus i samme anatomiske region i adductor, omgivende og under den kirurgiske okklusion.
    6. Kvantificere sikkerheds fartøjs tætheden (CVD) i ækvivalent ROIs svarende til 20% af det samlede ekstremitets område. CVD beregnes som forholdet mellem det vaskulære område og ROIs-områderne. Alle tætheds målinger udføres ved hjælp af ImageJ software.
      Bemærk: CVD-værdien af den ikke-iskæmiske ekstremitet for hver mus antages at svare til 100% for at udelukke variationer i anatomi-, perfusions-eller diaphonization-procedurerne. CVD-procenten i den iskæmiske ekstremitet blev derfor beregnet i forhold til den ikke-iskæmiske en.
    7. Bestem procentdelen af CVD-stigningen som forskellen mellem CVD-procenten blandt de iskæmiske og noniskæmiske lemmer.
  6. Laser opsamling microdissection af kapillærer
    1. Efter bedøvelsen, ofrer musene ved livmoderhals dislokation.
    2. For at høste gastrocnemius musklerne i begge ben, fjerne huden fra mus begge baglemmer.
    3. Identificer achillessene og adskille senen fra knoglen ved hjælp af en 11-bladet skalpel.
    4. Hold achilles sene og adskille musklen fra skinneben og fibula op til knæet leddet med fjeder saks.
    5. Adskil biceps rectus fra gastrocnemius musklen.
    6. Brug fjeder saks til at skære indsættelser af gastrocnemius muskler på knæet fælles niveau.
    7. Placer de høstede gastrocnemius muskler i en tværgående retning på en lille kork disk ved hjælp af 10% tragacanth.
    8. Fastgør prøverne i flydende, nitrogen kølet isopentan, og opbevar dem ved-80 °C indtil skæring.
    9. Skær på en kryostat 12 μm sektioner af musklen prøver og montere på glas slides.
      Bemærk: for RNA-beskyttelse skal du tage en forkølet slide og røre ved bagsiden af diaset med din finger (handsker) for kun at varmeområdet for at placere sektionen. Overføres fra kryostat kniven ved at røre ved med det opvarmede område og tørre ved-20 °C i kryostaten i 2-3 min. Protokollen kan sættes på pause her.
      1. Fastgør glas gliderne i en flaske, der indeholder afkølet ren acetone (ca. 50 mL) i 5 minutter ved-20 °C, og lufttørre dem.
      2. Brug en hydrofobe pen rundt om sektionerne.
        Bemærk: brugen af hydrofobe pennen hjælper med at reducere mængden af løsninger, som anvendes i løbet af protokollen. Ved alle inkubationer anvendes 100 μL af alle opløsninger, pr. sektion.
      3. Rehydreres med 2 M NaCl/PBS ved 4 °C og Inkuber enhederne natten over ved 4 °C med anti-CD31 rat monoklonalt antistof ved 1:500 i 2M NaCl/PBS.
      4. Vask to gange i 2M NaCl/PBS i alt 6 min.
      5. Der tilsættes et sekundært biotinyleret kanin anti-rotte IgG-antistof ved 1:200 i 2M NaCl/PBS og 5% kaninserum i 30 min ved 4 °C.
      6. Vask i 2 M NaCl/PBS som før og tilsæt mærket Avidin-konjugeret peroxidase-kompleks i 30 min ved 4 °C.
      7. Skyl og tilsæt DAB peroxidase substrat kit i 5 min.
      8. Dehydrat afsnittene i iskold 90% ethanol efterfulgt af 100% ethanol og lad dem tørre.
      9. Dissekere 10 000 kapillærer per mus ved hjælp af en laser microdissection system udstyret med en pulserende solid-state 355 nm laser og katapult de dissekeret kapillærer i en Micro fuge tube klæbemiddel-cap.
  7. RNA-ekstraktion, cDNA-syntese, præ-amplifikation og RT-PCR
    1. Isoler total RNA fra de microdissekterede kapillærer ved hjælp af et passende sæt, det totale RNA opnået er mellem 1,5-3 ng/μL.
    2. Brug et cDNA-syntese kit til syntese og to runder Forforstærkning ved hjælp af de primere, der er beskrevet i tabel 1.
    3. Udfør RT-PCR for de samme mål, der er beskrevet i det foregående trin. Brug et program bestående af et indledende Denaturerings trin ved 95 °C i 10 min, efterfulgt af 50 cyklusser ved 95 °C i 15 s og ved 60 °C i 1 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne protokol blev navlestrengen mesenchymal stamceller og lavdosis ioniserende stråling (LDIR) testet som formodede angiogene terapier 11,12. Laser Doppler perfusion målinger blev opnået før iskæmi induktion og på præ-specificerede tidspunkter, der spænder fra umiddelbart efter iskæmi induktion til 45 dage post-iskæmi. Vævs perfusion aflæsninger af Laser Doppler blev indspillet som farvekodede billeder, uden perfusion vist som mørkeblå og det højeste perfusions niveau vist som rødt.  Som vist i figur 2A og 3a og kvantificeret i figur 2B og 3bblev der observeret et fuldstændigt tab af perfusion i bagekstremiteter hos alle mus umiddelbart efter induktion af bagekstremitets iskæmi, reproducerbarhed af teknikken til inducerende baglemmer iskæmi. Vigtigere er sværhedsgraden af iskæmi ens i alle dyr. Der blev trukket et INVESTERINGSAFKAST omkring den iskæmiske baglemmer, og der blev trukket et sammenligneligt ROI omkring den ikke-iskæmiske baglemmer for at udføre kvantificeringen af perfusion. Perfusion udtrykkes som et forhold mellem perfusion i den iskæmiske ekstremitet og i den ikke-iskæmiske lemmer. Ændringer i perfusions forholdet måles over tid.

Immun histokemi blev udført mellem 15 og 90 dage efter iskæmi. Diaphonization blev foretaget mellem 19-og 90-dage post-iskæmi og kapillær microdissection mellem 45-og 70-dage post-iskæmi induktion sikre, at de forskellige Pro-angiogen behandlinger induceret en vedvarende og langvarig proangiogenic virkning.

Kvantificering af CD31-positive kapillærer i histologiske sektioner af gastrocnemius muskel vurderet kapillær tæthed og dette blev udtrykt som antallet af kapillærer pr antal muskelfibre. Som vist i figur 4var kapillær tætheden større i iskæmisk versus ikke-iskæmisk lemmer.

For at evaluere sikkerheden for fartøjs tætheden blev mus diaphoniseret, og et tilsvarende ROI, svarende til 20% af ekstremitets arealet, blev udvalgt til kvantificering. Sikkerhed fartøjs tæthed konstant steget i iskæmisk lemmer, så data vedrørende behandlede og kontrol lemmer blev udtrykt som procentdelen af sikkerhedsstillelse fartøjs tæthed stigning i iskæmisk lemmer relativt til ikke-iskæmisk en (figur 5 ).

Ekspression af Pro-angiogene gener af ECs blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR af CD31-positive celler. Udskrifter for Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, hgf, og met viste en klar variation i ekspression mellem iskæmiske og ikke-iskæmiske lemmer, udelukkende i mus udsat for Pro-Angiogen stimulus (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk illustration af musens anatomi baglemmer vaskulatur, der viser ligations stederne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : LDIR øger genfinding af perfusion. Efter kirurgisk induktion af unilaterale HLI var begge bagdele af C57BL/6-musene blevet bestrålet eller bestrålet med fire daglige fraktioner af 0,3 Gy i sammenhængende dage og fik lov til at komme sig. A) repræsentative Laser Doppler flow-billeder før HLI og på dag 0 (d0) og 15 (D15) efter HLI-induktion. B) kvantitativ vurdering af blodgennemstrømningen udtrykt som forholdet mellem ISC og NISC-ekstremiteter udviste signifikant forbedret perfusion af lemmer i bestrålede mus vs. Sham-bestrålede dem både på dag 15 (D15) og 45 (d45) post-HLI. Mellem gruppens ændringer blev vurderet ved to-vejs gentagne målinger ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test (n = 12 mus pr. gruppe). Betyder ± SEM vises.  P < 0,001; ns, ikke signifikant. HLI, baglemmer iskæmi; ISC, iskæmisk; NISC, ikke-iskæmisk; Præ-HLI, før baglemmer iskæmi. Tilpasset fra 11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Navlestrengen mesenchymal stamceller (UCX) øge perfusion opsving. UCX eller deres køretøj (som en kontrol) blev administreret i den iskæmiske gastrocnemius muskel 5 timer efter HLI induktion. A) repræsentative Laser Doppler-flow billeder før (PRÆ-HLI) umiddelbart efter (d0 POST-HLI) og ved 7, 14 og 21 dage efter HLI-induktion (D7 POST-HLI, D14 POST-HLI, D21 POST-HLI). (B) kvantitativ vurdering af blodgennemstrømningen udtrykt som et forhold mellem ISC og NISC-ekstremiteter udviste signifikant forbedret ekstremitet blod perfusion i navlestrengen mesenchymal stamceller-behandlede mus ved 7, 14 og 21 dage post-HLI. (n = 16 for hver forsøgsgruppe; D7: t (22,69) = 4,26; P ˂ 0,001; effekt størrelse var 1,51 og Power 0,98; D14: t (30) = 4,7; P ˂ 0,001; effekt størrelse var 1,66 og Power 0,99; D21: t (30) = 7,22; P ˂ 0,001; effekt størrelse var 2,56 og Power 0,99). HLI, baglemmer iskæmi; ISC, iskæmisk; NISC, ikke-iskæmisk. Tilpasset fra11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : LDIR øger kapillar tætheden. A) repræsentative sektioner fra Sham-bestrålede og bestrålede iskæmiske gastrocnemius-muskler på dag 45 efter HLI. Kapillærer og myocytter blev identificeret ved henholdsvis CD31 Immunhistokemi og hematoxylin. Skala bjælke, 150 mm.B) kvantitativ analyse afslørede øget kapillær densitet (kapillærer/myocyte) i bestrålede iskæmiske gastrocnemius muskler sammenlignet med Sham-bestrålede iskæmiske dem på dag 15 og 45 post-HLI. Blandet ANOVA efterfulgt af Bonferroni post-hoc test blev udført med en inden-emne faktor af ISC og mellem-emne faktorer på dagen og bestråling (n = 6 mus pr. gruppe). Individuelle data og midler ± SEM vises. P < 0,001; ns, ikke signifikant. ISC, iskæmisk; NISC, ikke-iskæmisk. Tilpasset fra11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: LDIR øger sikkerheden tæthed. A) illustrerende billeder af udvalgte Rois for Sham-bestrålede og bestrålede mus. ISC og NISC lemmer på dag 90 post-HLI vises. Scale bar, 300 mm. (B) data er repræsenteret som procentdelen af CVD stigning i ISC lemmer relativt til nisc One. På dag 15 og 90 efter HLI præsenterede bestrålede mus en signifikant højere CVD-stigning (%) vs. Sham-bestrålede mus. To-vejs ANOVA blev udført efterfulgt af Bonferroni post-hoc test med en mellem emne faktorer på dagen og bestråling (n = 6 mus pr. gruppe).  Individuelle data og midler ± SEM vises. * P < 0,05; P < 0,001; ns, ikke signifikant. HLI, baglemmer iskæmi; ISC, iskæmisk; NISC, ikke-iskæmisk. Tilpasset fra11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : LDIR opregulerer ekspression af angiogene gener i ECs isoleret fra bestrålede iskæmiske gastrocnemius muskler. Efter kirurgisk induktion af unilaterale HLI var begge bagdele af C57BL/6-musene Sham-bestrålede eller bestrålede med fire daglige fraktioner af 0,3 Gy i sammenhængende dage og fik lov til at komme sig. På dag 45 efter HLI blev ekspression af Pro-angiogeniske faktorer og deres receptorer evalueret af qRT-PCR udelukkende på ECs. Gastrocnemius muskel sektioner blev plettet for CD31. Individuelle endotel CD31 + celler blev visualiseret, dissekeret, og isoleret ved hjælp af en laser microdissection system. Hver søjle repræsenterer det relative genekspression i ét dyr. Hvide og grå stænger repræsenterer henholdsvis Sham-bestrålede og bestrålede mus. Værdier blev normaliseret til 18S for at opnå relative udtryks niveauer. Resultater udtrykt som LOG2 fold ændringer mellem iskæmiske og ikke-iskæmiske prøver viste den relative overflod af transskriptioner i bestrålede mus; i modsætning hertil observeres en Nedregulering i Sham-bestrålede mus. Tilpasset fra11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Vegfr1_f (5 '-TTGAGGAGCTTTCACCGAACTCCA-3 ');
Vegfr1_r (5 '-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGCTT-3 ');
Vegfr2_f (5 '-AGGCCCATTGAGTCCAACTACACA-3 ');
Vegfr2_r (5 '-AGACCATGTGGCTCTGTTTCTCCA-3 ');
PDGF-c_f (5 '-ATGCCACAAGTCACAGAAACCACG-3 ');
PDGF-c_r (5 '-AAGGCAGTCACAGCATTGTTGAGC-3 ');
Mødte_f (5 '-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3 ');
Met_r (5 '-TTGCGTCGTCTCTCGACTGTTTGA-3 ');
Fgf2_f (5 '-ACTCCAGTTGGTATGTGGCACTGA-3 ');
Fgf2_r (5 '-AACAGTATGGCCTTCTGTCCAGGT-3 ');
Tgfb2_f (5 '-GCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTT-3 ');
Tgfb2_r (5 '-CTCCAGCACAGAAGTTGGCATTGT-3 ');
Ang2_f (5 '-ATCCAACACCGAGAAGATGGCAGT-3 ');
Ang2_r (5 '-AACTCATTGCCCAGCCAGTACTCT-3 ');
Hgf_f (5 '-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3 ');
Hgf_r (5 '-TCATGCTTGTGAGGGTACTGCGAA-3 ');
18s_f (5 '-GCCCTATCAACTTTCGATTGGTAGT-3 ');
18s_r (5 '-CCGGAATCGAACCCTGATT-3 ').

Tabel 1: primere anvendt til studiet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Murine modeller af CLI har for det meste bestået i ligering af femoral arterien bare distale til oprindelsen af den profunda rectus 4,5,6,7,8,9. Dette har vist sig at lade det meste af sikkerhedsstillelse cirkulation intakt, som genskaber blodtilførslen til lemmer inden 7 dag 9. Fjernelse af sikkerhedsstillelse sengen kan opnås ved excision af femoral arterien. Men, op til en tredjedel af den oprindelige blodgennemstrømning kan genoprettes så snart 7 dage efter proceduren, da de fleste sikkerhedsstillelse fartøjer opstår fra den interne bækkenbens arterie 7. Lejay et al har foreslået sekventielle ligationer med en anden ligering udført på den fælles iliacarterie, effektivt at reducere sikkerhed perfusion leveres af den interne bækkenbens arterie 4. Kritiske trin i denne protokol omfatter ikke kun identifikation af den eksterne bækkenbens arterie lige over lyske ligament, men også ligering og excision af den distale eksterne bækkenbens og femorale arterier og vener, som tjener et dobbelt formål: at øge sværhedsgraden af iskæmi samt at forbedre den tekniske reproducerbarhed af modellen, som eksponering af femoral arterien alene ofte resulterer i rive af venen.

En begrænsning af denne teknik er den akutte afbrydelse af blodtilførslen til ekstremiteten, som adskiller sig fra den langvarige proces i forbindelse med opbygningen af aterosklerotisk plaque, der fører til arteriel stenose og okklusion. Stadig, reduktion af blodgennemstrømningen var til stede godt efter 2 uger, den etablerede tidspunkt for diagnosticering af kronisk iskæmi. Også, sikkerhedsstillelse blev øget med iskæmisk fornærmelse alene, som efterligner processen med sikkerhedsstillelse dannelse observeret i kronisk iskæmiske lemmer.

Neovaskularisering af iskæmiske lemmer involverer et komplekst samspil af biologiske hændelser, nemlig angiogenese og arteriogenesis. Denne protokol omfatter en række analyser, der vurderede interferensen af formodede angiogene terapier på angiogen spiring (kapillær fartøjs tæthed) og udvikling af sikkerheds fartøjer (arteriogenesis), den vigtigste mekanisme i menneskelig tolerance til lavere ekstremiteter iskæmi. Samtidig, Laser Doppler bruges til at afsløre funktionen af disse nye eller udvidede fartøjer, og for første gang laser microdissection af kapillærer bruges til at indsamle ECs afsløre de molekylære mekanismer, der ligger til grund for funktionel genopretning. Denne protokol giver en reproducerbar dyremodel, der kan efterligne virkningerne af CLI en standard for testning, når dyrene behandles med mulige angiogeniske behandlinger, der kan anvendes i en klinisk sammenhæng i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker José Rino og Tânia Carvalho, lederne af bioimaging Facility og histologi og komparativ patologisk laboratorium for henholdsvis Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Vi takker også Vyacheslav Sushchyk fra Institut for anatomi af Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.

Finansierings reference: projekt finansieret af UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira støttes af et stipendium (SFRH/BD/80483/2011) fra Fundação para a Ciência e tecnologia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7500 Fast Real-Time PCR Applied Biosystems Instrument
Acetone Merk 1000141000 Reagent; Caution - highly flammable
Adenosine Valdepharm Reagent
Atipamezole OrionPharma Reagent
Barium sulphate (Micropaque) Guebert 8671404 (ref. Infarmed) Reagent
Buprenorphine RichterPharma Reagent
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit Qiagen 7335730 Reagent
Cryostat Leica CM Leica Microsystems 3050S Instrument
DAB peroxidase substrate kit DAKO;Vector Laboratories K3468 Reagent
hydrogen peroxidase Merk 1072090250 Reagent; Caution - nocif
hydrophobic pen Dako 411121 Reagent; Caution - toxic
Ketamidor Richterpharma CN:580393,7 630/01/12 Dfvf Reagent
Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK 5710 Instrument
Leica DM2500 upright brightfield microscope Leica Microsystems Instrument
Medetor Virbac 037/01/07RFVPT Reagent
methanol VWR UN1230 Reagent; Caution - toxic and highly flammable
Papaverine Labesfal Reagent
Pentano Isso Merk 1060561000 Reagent; Caution - highly flammable
Power SYBR® Green Applied Biosystems 4309155 Reagent
Purified rat anti-mouse CD31 Pharmingen 550274 Reagent
RNeasy Micro kit Qiagen 74004 Reagent
Surgic-Pro 6.0 Medtronic (Coviden) VP733X Suture
VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) Vectastain ABC kit; Vector Laboratories PK-4004 Reagent
Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 Medtronic (Covidien) UL202/ UL101 Suture
Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System Carl Zeiss Microscopy, Germany 1023290916 Instrument
Stereotaxic microscope Carl Zeiss Microscopy, Germany Instrument
Digital camera Linux Instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
  2. Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
  3. Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
  4. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  5. Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
  6. Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
  7. Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
  8. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
  9. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  10. Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
  11. Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
  12. Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
  13. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).

Tags

Medicin angiogenese terapeutisk angiogenese kritisk ekstremitet iskæmi perifer arteriel sygdom murine Hindlemmer iskæmi model CLI
Vurdering af terapeutisk angiogenese i en murine model af baglemmer iskæmi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ministro, A., de Oliveira, P.,… More

Ministro, A., de Oliveira, P., Nunes, R. J., dos Santos Rocha, A., Ferreira, T., Goyri-O'Neill, J., Rosa Santos, S. C. Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (148), e59582, doi:10.3791/59582 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter