Summary
Здесь представлена критическая экспериментальная модель ишемии задних конечностей, за которой следует батарея функциональных, гистологических и молекулярных тестов для оценки эффективности ангиогенной терапии.
Abstract
Критическая ишемия конечностей (CLI) является серьезным заболеванием, которое влечет за собой высокий риск ампутации нижних конечностей. Несмотря на реваскуляризацию, являясь золотым стандартом терапии, значительное число пациентов с КЛИ не подходят ни для хирургической, ни для эндоваскулярной реваскуляризации. Ангиогенные терапии становятся вариантом для этих пациентов, но в настоящее время все еще находятся под следствием. Перед применением в людях, эти терапии должны быть проверены в животных моделях и его механизмы должны быть четко поняты. Модель ишемии задних конечностей (HLI) была разработана путем перевязки и иссечения дистальных внешних подвздошных и бедренных артерий и вен у мышей. Была собрана комплексная группа тестов для оценки воздействия ишемии и предполагаемых ангиогенных методов лечения на функциональном, гистологическом и молекулярном уровнях. Лазерный Доплер использовался для измерения потока и функциональной оценки перфузии. Ткань ответ был оценен путем анализа плотности капилляров после окрашивания анти-CD31 антитела на гистологических участках гастрокнемии мышц и измерения плотности залога сосуда после диафонизации. Выражение ангиогенных генов было количественно RT-PCR ориентации отдельных ангиогенных факторов исключительно в эндотелиальных клеток (ECs) после лазерного захвата микрорассечения из мышц гастрокнемии мышей. Эти методы были чувствительными в выявлении различий между ишемическими и неишемическими конечностями и между обработанными и необработанными конечностями. Этот протокол обеспечивает воспроизводимую модель CLI и основу для тестирования ангиогенных методов лечения.
Introduction
Периферийное артериальное заболевание (ПАД) поражает преимущественно нижние конечности. PAD вызвана атеросклерозом, обструкцией артерий, которая может вызвать серьезное ограничение кровотока в нижних конечностях1. Прерывистая claudication является первым проявлением PAD и относится к мышечной боли при ходьбе. CLI является наиболее тяжелой стадии PAD, будучи диагностированы у пациентов, которые показывают ишемическую боль отдыха, язвы или гангрены2. Пациенты с CLI имеют высокий риск ампутации, особенно если не лечить3. В настоящее время реваскуляризация нижних конечностей (либо открытой хирургией, либо эндоваскулярной процедурой) является единственным способом спасти конечности. Тем не менее, около 30% пациентов CLI не подходят для этих процедур, по причинам, которые включают расположение поражений, картина артериальной окклюзии и обширной сопутствующих4,5. Таким образом, новые методы лечения необходимы для этих в противном случае неизлечимых пациентов, с продвижением ангиогенеза является стратегией под более интенсивным расследованием.
Перед тестированием на людях, эффективность и безопасность новых методов лечения in vivo должны быть рассмотрены в животных моделях. Несколько моделей были разработаны для изучения CLI, в основном путем индуцирования ишемии задних конечностей (HLI) у мышей6,7,8,9,10. Тем не менее, эти модели отличаются в нескольких аспектах, включая характер артерий, которые ligated и / или вырезаны и являются ли вены и нервы окружающих вскрыты, а6,7,8, 9,10. Взятые вместе, эти аспекты будут влиять на тяжесть ишемии реперфузии травмы в каждом животном, что делает результаты трудно сравнить. Поэтому крайне важно разработать эффективный протокол, в котором процедура индуцирования ишемии и оценка различных целей должны быть стандартизированы для оценки эффективности данной ангиогенной терапии. Экспериментальный протокол, предназначенный для охвата всех этих аспектов, обеспечит всестороннее понимание механизмов, с помощью которых ангиогенные методы лечения оказывают свое воздействие, и меру их эффективности при каждом из своих результатов. Две различные работы, недавно опубликованные нашей командой являются хорошим примером11,12, в котором различные подходы, чтобы вызвать терапевтический ангиогенез были оценены с использованием того же протокола, который будет описан с более подробно в этом Протокол.
Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать воспроизводимую экспериментальную модель, которая может имитировать эффекты CLI и заложить экспериментальную основу для всесторонней оценки функциональных, гистологических и молекулярных эффектов предпологаемых ангиогенных Агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры животных в соответствии с Директивой 2010/63/EU и были одобрены Институциональным органом защиты животных и лицензированы DGAV, португальским компетентным органом по защите животных (лицензионный номер 023861/2013)
ПРЕДЕКТО: Некоторые химические вещества, используемые в протоколах, являются токсичными и вредными. Пожалуйста, используйте все соответствующие методы безопасности и средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторное пальто, брюки в полный рост и обувь с закрытыми ностями)
1. Мурин модель ишемии задних конечностей
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся на 22-недельных мышах C57BL/6.
- Подготовка решений
-
Подготовка анестезиологического раствора
Примечание: Эта анестезия комбинация (медетомидин и кетамин) обеспечивает до 30 мин иммобилизации и хирургическое окно 15 мин. Эффект может быть возвращен администрацией atipamezole.- С чистой, 1 cc шприц, снять 1 мл мететомидина (1 мг / кг массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений, и добавить его в 15 мл сокол трубки.
- С чистой, 1 куб.см шприц, снять 0,75 мл кетамина (75 мг / кг массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений и добавить его в 15 мл сокол трубки, содержащей медетомидин.
- Добавьте 8,25 мл стерильного сольника (0,9% NaCl), чтобы получить 10 мл анестезирующегося раствора.
- Определите трубку с названием соединений, смешанной датой и сроком годности.
- Хранить в темноте при 4 градусах По Цельсию.
-
Подготовка антиседативного раствора
- С чистой, 1 куб.см шприц, снять 1 мл атипамезола (5 мг / кг массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений, и добавить его в 15 мл сокол трубки.
- Добавьте 9 мл стерильного сольника (0,9% NaCl), чтобы получить 10 мл реверсивного раствора.
- Определите трубку с названием соединений, смешанной датой и сроком годности.
- Хранить в темноте при 4 градусах По Цельсию.
-
Подготовка послеоперационного обезболиваемого раствора
- С чистым, 1 см шприц, снять 0,5 мл бупренорфина (100 л/15-30 г массы тела), устранить пузырьки воздуха для точных измерений, и добавить его в 15 мл сокол трубки.
- Добавьте 9,5 мл стерильного сольника (0,9% NaCl), чтобы получить 10 мл обезболивающегося раствора.
- Определите трубку с названием соединений, смешанной датой и сроком годности.
- Хранить в темноте при 4 градусах По Цельсию.
-
Подготовка анестезиологического раствора
- Хирургическая индукция ишемии заднеlimb
- Для этого вмешательства необходимы хирургические инструменты: заостренные щипцы, пружинные ножницы, держатель офтальмологических игл, хирургические ножницы и держатель иглы. Стерилизовать все хирургические инструменты в автоклаве перед использованием. Используйте ватные тампоны для вскрытия подкожного жира.
- Загрузите шприц с анестезией раствор перед проведением мыши.
- Сдержите животное, применяя силу за ушами к сетке клетки, удерживая как можно больше кожи, чтобы держать мышь неподвижной.
- Держите животное наклоненным с опущенной головой и выполнять интраперитонеальную инъекцию анестезии раствор, сохраняя шприц под углом 45 "с телом мыши.
- Проверьте отсутствие рефлектов отмены педалей, оцените глубину анестезии.
- Удалите волосы с правой задней конечности с помощью электрической бритвы. Используйте хлоргексидин дезинфицирующее мыло скраб для подготовки кожи. Используйте чистое бумажное полотенце, чтобы удалить пены. Нанесите хлоргексидин хирургического скраб и защитить область кожи с стерильной драпировки перед транспортировкой мышей в хирургический стерильный набор.
- Поместите животное в dorsal decubitus и сдержать его с четырьмя конечностями разрознены и обеспечены скотчем.
ВНИМАНИЕ: Выполните процедуру на нагретой подушечке, чтобы поддерживать стабильную температуру тела животного; хирургическая процедура выполняется с помощью рассечения микроскопа при 10x или 20x увеличение. - Нанесите антисептический раствор хлоргексидина с использованием стерильной марли для завершения подготовки кожи. Используя хирургическое лезвие скальпеля no 11, выполняйте 1-сантиметровый разрез кожи над бедренной костью правой задней конечности.
- Блант вскрыть подкожный жир подвергая нервно-сосудистый пучок. Используя остроконечные щипцы, пружинные ножницы и держатель офтальмованной иглы, откройте мембранусную илио-бедренную оболочку, чтобы разоблачить дистальные внешние подвздошные и бедренные сосуды.
- Вскрыть и отделить сосуды (артерии и вены) от нерва. Использование 7,0 неабсорбируемых полипропиленовых швов ligate дистальных внешних подвздошной артерии и вены и дистальной бедренной артерии и вены.
- Переувайте сегмент илио-бедренной артерии и вен между дистальными и проксимальными узлами с помощью пружинных ножниц.
- Закройте разрез абсорбируемым швом (например, шов 5,0 Vicryl).
- Загрузите шприц антиседативным раствором и используйте тот же метод, описанный в 1.2.3 и 1.2.4 для выполнения внутриперитонеальной инъекции антиседативного раствора.
- Послеоперационный мониторинг
ПРИМЕЧАНИЕ: за животными тщательно наблюдают сяочить каждые 15-20 минут, чтобы убедиться, что все животные хорошо оправяются от антиседативных; анестезирует животных никогда не оставляют без присмотра.- Оценить восстановление после анестезии: 1) контролировать скорость и глубину дыхания; 2) оценить животные рефлексы (педаль и положение глаз)
- Выполняйте подкожную инъекцию послеоперационной анальгезии каждые 8-12 ч.
- Мониторинг животных ежедневно после операции записи краткое описание состояния здоровья животного и внешний вид места операции, убедитесь, что все швы закрыты.
- Повторношовиразрез разреза, если происходит опознавание. Если неудача, нанесите пленку барьера кожи на разрез для защиты от мочи, фекальные выделения, трение и сдвига кожи и, чтобы помочь процессу заживления.
2. Оценка ангиогенного эффекта
ПРИМЕЧАНИЕ: После индукции ишемии, применять терапевтический агент в исследовании и достичь следующих процедур. Меры, предпринятые в других точках времени, подробно описаны в соответствующем разделе.
- Лазерная доплеровская перфузионная визуализация
- Удалите волосы с обеих задних конечностей за день до анализа с помощью электрической бритвы с последующим кремом для депиляции.
- Анестезируйте мышей с помощью анестезируемого раствора.
- Поместите животное на грелку 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут, чтобы гарантировать, что температура не изменится во время процедуры
- Поместите животное в положение на спине с ногами, закрепленными в расширенном положении. Измерьте расстояние между правыми и левыми ногами и ногами для каждого животного, так как позиционирование животного должно быть одинаковым всякий раз, когда процедура должна быть повторена, чтобы следовать изменениям в перфузии задних конечностей с течением времени.
- Начните получать данные с помощью лазерного доплероводного перфузийного изображения.
- После завершения приобретения, вернуть анестезию с анти-седативным раствором.
- Откройте программное обеспечение для анализа изображений и нарисуйте область интереса (ROI) вокруг ишемической hindlimb и сопоставимой рентабельности инвестиций вокруг неишемической hindlimb.
- Наблюдайте значения потока и определите перфузию как отношение перфузии в ишемической конечности к тому в неишемической конечности. Изменения в соотношении перфузии измеряются с течением времени.
- Иммуногистохимия и анализ плотности капилляров
- После анестезии, пожертвовать мышей шейки матки дислокации.
- Для сбора гастрокнемиозных мышц обеих ног, во-первых, удалить кожу с обеих задних конечностей.
- Определите ахиллово сухожилие и отделите сухожилие от кости с помощью 11-лезвия скальпеля.
- Держите ахиллово сухожилие и отделить мышцы от голени и малоберцовой кости до коленного сустава с пружинными ножницами.
- Отделить бицепс фемориса от гастрокнемии мышцы.
- Используйте пружинные ножницы, чтобы сократить вставки гастрокнемии мышц на уровне коленного сустава.
- Поместите собранные гастрокнемиозные мышцы в поперечную ориентацию на небольшой пробковый диск с помощью 10% трагаканта.
- Привязать заморозить образцы в жидком азоте охлажденный иопентан и хранить их при -80 градусов по Цельсию до секции.
- Вырезать 7 мкм участки мышц образцы на криостат и смонтировать на стеклянных слайдах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Исправьте стеклянные горки в бутылке, содержащей охлажденный чистый ацетон (примерно 50 мл) в течение 10 мин, при -20 градусов по Цельсию.
- Добавьте перекисовую перекистину водорода 0,3%, разбавленный метанолом (50 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Дважды вымойте фосфатно-буферизированный солен (PBS) (50 мл) в общей сложности 10 мин.
- Используйте гидрофобную ручку вокруг секций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование гидрофобной ручки позволяет уменьшить количество растворов, израсходованных во время протокола. Для всех инкубаций используйте 100 л всех растворов, на секцию. - Нанесите блокирующий раствор 5% сыворотки кролика в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубировать образцы в течение 1 ч при комнатной температуре с анти-CD31 крысы моноклонального антитела разбавленного в 1:500 в 1 % бычьего сыворотки альбумина (BSA) в PBS.
- Вымойте три раза в PBS в общей сложности 30 минут.
- Добавить вторичные биоинтиниляции кролика анти-крысы IgG антитела в 1:200 в 1% BSA в PBS и 5% кролика сыворотки в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Вымойте в PBS, как и раньше, и добавить помечены avidin-конъюгированный комплекс пероксидазы в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Промыть 3 раза в PBS в течение 5 мин и добавить диаминбензидин (DAB) пероксидазы подстрат комплект еще 5 мин.
- Противопокой разделы с гематоксилином в течение 10 с перед монтажом.
- Измерьте плотность капилляров с помощью вертикального яркого поля микроскопа (т.е. количество капилляров на количество миоцитов) в 2 различных участках 4 различных анатомических областей в каждом образце.
- Контрастный агент перфузии
- Анестезируйте мышей с помощью анестезируемого раствора.
- Выполните среднюю лапаротомию с помощью лезвия скальпеля номер 15.
- Выставляют брюшную аорту и каву чонду вену, после втягивания боковой тонкой кишки и использования пружинных ножниц.
- Вставьте один 26-калиберный катетер, черепно в брюшную аорту, а другой в каудальную полу вены в том же направлении.
- Безопасные катетеры на месте с помощью 5/0 шелковый шов для выполнения пребывания шов.
- Вымойте сосудистую систему сольистым раствором 37 градусов, содержащим гепарин (500 единиц/100 мл), витуемым в брюшную аорту с помощью шприца 10 мл. Продолжайте нежную перфузию до тех пор, пока не будет видно четкое решение, выходящее из катетера, помещенного внутрь каудальной полы вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для промывки сосудистой системы взрослой крысы требуется от 30 до 40 мл гепаринов. - Вводят смесь аденозина (1 мг/л) и папаверина (4 мг/л) в течение 2 мин.
- Вводят в аортатический катетер 10 мл смеси 50% сульфата бария и 5% желатина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен храниться при 60 градусах Цельсия, чтобы избежать утолщения. - Оставьте мышей при - 4 градуса х, по крайней мере 4 ч, для того, чтобы сосудистый литые затвердеть.
- Удалите кожу из нижней части тела каждой мыши.
- Диафонизация - Техника Спалтехольц
- Исправить мышей путем погружения в 10% раствор формальдегида, по крайней мере 72 ч.
- Отбеливайте мышей путем погружения в 30% раствор перекиси водорода в течение 24 ч.
- Обезвоживать мышей с помощью техники замены замораживания. Эта методология состоит из представления мышей последовательных проходов (в среднем четыре) чистого ацетона при - 20 градусов по Цельсию на 24 ч каждый.
- Уточните мышей, погрузив его в раствор, содержащий смесь 100% бензил бензоат и 100% метил-салицилат в пропорции 3:5 (эта смесь также известна как раствор Spalteholz) 13.
- Оставьте мышей погруженными в раствор Spalteholz внутри в вакуумной камере, пока он не станет диафрагмы, которая обычно занимает от 5 до 7 дней.
- Замените раствор, если стемнеет до того, как образец станет ясным.
- Количественная оценка сосуд
- Наблюдайте за мышами, подвешенными в растворе Spalteholz под трансиллионом, с помощью стереотаксического микроскопа. Используйте микрохирургические щипки, чтобы аккуратно схватить и переместить его.
- Фотографируй все конечности с помощью цифровой камеры, подключенной к микроскопу.
- Получить все конечности фотографии с помощью соответствующего программного обеспечения.
- Выполните ручную сегментацию сосудов, выделяя их с помощью соответствующего программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосуды-сосуды определяются в соответствии с определением Лонгленда, определенным стеблем, средней зоной и повторно абитуриентом, диаметром от 20 до 300 мкм, за исключением бедренных, сафенозных и поплиновых артерий и всех венозных структур. - Определите ROIs в каждой мыши в той же анатомической области в аддуктора, окружающих и ниже хирургического окклюзии.
- Количественная плотность сосуда (CVD) в эквивалентной рентабельности инвестиций, соответствующая 20% от общей площади конечностей. ССЗ рассчитывается как соотношение между сосудистой областью и областими ROIs. Все измерения плотности выполняются с помощью программного обеспечения ImageJ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что значение ССЗ неишемической конечности для каждой мыши соответствует 100%, чтобы исключить изменения в процедурах анатомии, перфузии или диафонизации. Таким образом, процент ССЗ в ишемической конечности был рассчитан по отношению к неишемическому. - Определить процент увеличения ССЗ, как разница между сДЗ процент между ишемической и неишемической конечностей.
- Лазерный захват микрорассечения капилляров
- После анестезии, пожертвовать мышей шейки матки дислокации.
- Для сбора гастрокнемиозных мышц обеих ног, удалить кожу с мышей обех задних конечностей.
- Определите ахиллово сухожилие и отделите сухожилие от кости с помощью 11-лезвия скальпеля.
- Держите ахиллово сухожилие и отделить мышцы от голени и малоберцовой кости до коленного сустава с пружинными ножницами.
- Отделить бицепс фемориса от гастрокнемии мышцы.
- Используйте пружинные ножницы, чтобы сократить вставки гастрокнемии мышц на уровне коленного сустава.
- Поместите собранные гастрокнемиозные мышцы в поперечную ориентацию на небольшой пробковый диск с помощью 10% трагаканта.
- Привязать заморозить образцы в жидком азоте охлажденный иопентан и хранить их при -80 градусов по Цельсию до секции.
- Вырезать на криостат 12 мкм разделы мышц образцы и смонтировать на стеклянных слайдах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для защиты РНК возьмите предварительно охлажденный слайд и коснитесь задней стороны слайда пальцем (перчатками), чтобы согреть только область для размещения раздела. Передача раздела от криостата нож, касаясь с разогретой области и сухой при -20 градусов по Цельсию в криостат в течение 2-3 мин. Протокол можно приложить здесь.- Исправьте стеклянные горки в бутылке, содержащей охлажденный чистый ацетон (примерно 50 мл) в течение 5 мин при -20 градусов по Цельсию и высушите их.
- Используйте гидрофобную ручку вокруг секций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование гидрофобной ручки помогает сократить количество растворов, потраченных во время протокола. Для всех инкубаций используйте 100 л всех растворов, на секцию. - Регидратировать с 2 M NaCl / PBS при 4 КС и инкубировать образцы на ночь при 4 КС с анти-CD31 крысмоноклональных антител в 1:500 в 2M NaCl / PBS.
- Вымойте дважды в 2M NaCl/PBS в общей сложности 6 мин.
- Добавить вторичное биоинтинилапотированное анти-крыса кролика IgG антитела в 1:200 в 2M NaCl / PBS и 5% кролика сыворотки в течение 30 минут при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте в 2 M NaCl /PBS, как и раньше, и добавить помечены avidin-конъюгированный комплекс пероксидазы в течение 30 минут при 4 кв С.
- Промыть и добавить DAB пероксидаза подлодки комплект для 5 мин.
- Обезвоживать участки в ледяной 90% этанола следуют 100% этанола и оставить их высохнуть.
- Рассекать 10 000 капилляров на мышей с помощью лазерной системы микродиссекции оснащены импульсным твердотельным лазером 355 нм и катапульты расчлененных капилляров в микрофуг трубки клея-шапка.
- Экстракция РНК, синтез кДНК, предусилительация и РТ-ПЦР
- Изолировать общую РНК из микрорассеченных капилляров с помощью соответствующего комплекта, общая полученная РНК составляет от 1,5-3 нг/Л.
- Используйте набор синтеза кДНК для синтеза и два раунда предварительного усиления, используя грунтовки, описанные в таблице 1.
- Выполните RT-PCR для тех же целей, описанных на предыдущем этапе. Используйте программу, состоящую из первоначального шага денатурации на 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем 50 циклов при 95 градусах по Цельсию в течение 15 с и при 60 градусах по Цельсию в течение 1 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя описанный протокол, мезенхимальные стволовые клетки пуповины и низкодозное ионизирующее излучение (LDIR) были протестированы как индиантные ангиогенные терапии 11,12. Лазерные показания перфузии доплера были получены до индукции ишемии и в заранее определенные временные точки, начиная от непосредственно после индукции ишемии до 45 дней после ишемии. Пролифынные показания с помощью лазерного доплера были записаны как цветные изображения, при этом перфузия не отображается как темно-синий, а самый высокий уровень перфузии отображается как красный. Как показано на рисунках 2A и 3A и количественно в рисунках 2B и 3B, полная потеря перфузии задних конечностей наблюдалась у всех мышей сразу после индукции ишемии задних конечностей, обеспечивая воспроизводимость техники для индуцирования ишемии задних конечностей. Важно отметить, что тяжесть ишемии аналогична у всех животных. Рентабельность инвестиций была нарисована вокруг ишемической задней конечности, и сопоставимая рентабельность инвестиций была нарисована вокруг неишемической задней конечности для выполнения количественной оценки перфузии. Перфузия выражается как отношение перфузии в ишемической конечности к неишемической конечности. Изменения в соотношении перфузии измеряются с течением времени.
Иммуногистохимия проводилась в период от 15 до 90 дней после ишемии. Диафонизация была предпринята между 19-и 90-дневный пост-ишемия и капиллярной микродиссецидации между 45- и 70 дней после ишемии индукции обеспечения того, чтобы различные про-ангиогенных терапии индуцированных устойчивый и длительный проангиогенный эффект.
Количественная оценка CD31-положительных капилляров в гистологических участках гастрокнемиозной мышцы оценивала плотность капилляров, и это выражалось как количество капилляров на количество мышечных волокон. Как показано на рисунке 4, плотность капилляров была больше в ишемической по сравнению с неишемической конечности.
Для того, чтобы оценить плотность сосуда, мышей были диафонизированы и эквивалентрентабельности рентабельности инвестиций, что соответствует 20% площади конечностей, был выбран для количественной оценки. Плотность сосуды последовательно увеличивалась в ишемической конечности, поэтому данные, относящиеся к обработанным и контрольным конечностям, были выражены как процент увеличения плотности залогового сосуда в ишемической конечности относительно неишемической (Рисунок 5 ).
Выражение проангиогенных генов ECs было проанализировано количественным RT-PCR CD31-положительных клеток. Стенограммы для Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf и Met показали четкое изменение выражения между ишемической и неишемической конечностей, исключительно у мышей, подвергшихся про-ангиогенного стимула (рисунок6).
Рисунок 1 : Схематическая иллюстрация анатомии сосуды задней конечности мыши, показывающей места перевязки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : LDIR увеличивает восстановление перфузии. После хирургической индукции одностороннего HLI, обе задние конечности c57BL/6 мышей были фиктивны облучены или облучены с четырьмя суточными фракциями 0,3Gy, в последовательных дней и позволили восстановиться. (A) Представитель лазерного доплера потока изображения до HLI, и в дни 0 (d0) и 15 (d15) после HLI индукции. (B) Количественная оценка кровотока, выраженная как соотношение МСК к конечности NISC, продемонстрировала значительно ежефую перфузию крови конечностей у облученных мышей по сравнению с облученными шам-облученными как в 15 дней (d15) и 45 (d45) после HLI. Изменения между группами оценивались с помощью двусторонних повторных измерений ANOVA, за которыми следовал пост-специальный тест Bonferroni (n - 12 мышей на группу). Показаны средства и SEM. Злт; 0,001; нс, незначительный. HLI, ишемия задних конечностей; МЦ, ишемическая; НИСК, неишемическая; Предварительно HLI, до ишемии заднеlimb. Адаптировано из 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Мезенхимальные стволовые клетки пуповины (UCX) увеличение перфузии восстановления. UCX или их транспортного средства (в качестве контроля) вводили в ишемической гастрокнемии мышцы 5 часов после индукции HLI. (A) Представитель лазерных доплеров поток изображений до (PRE-HLI), сразу после (d0 POST-HLI) и в 7, 14 и 21 дней после HLI индукции (d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (B) Количественная оценка кровотока, выраженная как соотношение ISC к конечности NISC продемонстрировали значительно повышенную перфузию крови конечностей в пуповину мезенхимальных стволовых клеток- обработанных мышей в 7, 14 и 21 дней после HLI. (n-16 для каждой экспериментальной группы; D7: т (22,69) 4,26; ПЗ 0,001; размер эффекта составил 1,51, а мощность 0,98; D14: т (30) 4,7; ПЗ 0,001; размер эффекта составил 1,66, а мощность 0,99; D21: т (30) 7,22; ПЗ 0,001; размер эффекта составил 2,56 и мощность 0,99). HLI, ишемия задних конечностей; МЦ, ишемическая; NISC, не ишемический. Адаптировано из11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : LDIR увеличивает плотность капилляров. (A) Представитель разделов от фиктивных облученных и облученных ишемической гастрокнемии мышц на 45 день после HLI. Капилляры и миоциты были идентифицированы CD31 иммуногистохимии и гематоксилин, соответственно. Шкала бар, 150 мм. (B) Количественный анализ показал увеличение плотности капилляров (капилляры / миоциты) в облученных ишемических гастрокнемии мышц по сравнению с фиктивно облученных ишемических в дни 15 и 45 после HLI. Смешанные ANOVA следуют Bonferroni после специального испытания было проведено с внутри субъекта фактор ISC и между субъектами факторов дня и облучения (n'6 мышей на группу). Отображаются индивидуальные данные и средства SEM. ПЗЛ;0.001; нс, незначительный. МЦ, ишемическая; NISC, не ишемический. Адаптировано из11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: LDIR увеличивает плотность залога. (A) Иллюстрирующие изображения выбранных ROIs для фиктивных и облученных мышей. ISC и NISC конечностей на день 90 после HLI показаны. Шкала бар, 300 мм. (B) Данные представлены как процент CVD увеличение конечности ISC относительно NISC один. В 15 и 90 дней после HLI, облученные мыши представили значительно более высокий рост ССЗ (%) против фиктивных мышей. Двусторонняя ANOVA была проведена последована за Bonferroni post-hoc испытанием с между субъективными факторами дня и облучением (n'6 мышей в группу). Отображаются индивидуальные данные и средства SEM. Злт;0,05; ПЗЛ;0.001; нс, незначительный. HLI, ишемия задних конечностей; МЦ, ишемическая; NISC, не ишемический. Адаптировано из11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : LDIR upregulates выражение ангиогенных генов в ECs изолированы от облученных ишемической гастрокнемии мышц. После хирургической индукции одностороннего HLI, обе задние конечности c57BL/6 мышей были облучены или облучены с четырьмя ежедневными фракциями 0,3Gy, в последовательных дней и позволили восстановиться. На 45 день после HLI, выражение проангиогенных факторов и их рецепторов была оценена qRT-PCR исключительно на ECs. Гастрокнемия мышечных секций были окрашены для CD31. Индивидуальные эндотелиальные клетки CD31 были визуализированы, расчленены и изолированы с помощью лазерной системы микродиссекции. Каждый бар представляет относительную экспрессию гена в одном животном. Белые и серые полоски представляют собой облученных и облученных мышей, соответственно. Значения были нормализованы до 18S для получения относительных уровней выражения. Результаты, выраженные в виде изменений в развок журнала между ишемическими и неишемическими образцами, продемонстрировали относительное изобилие транскриптов у облученных мышей; в отличие от этого, вниз регулирования наблюдается в фиктивных облученных мышей. Адаптировано из11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Vegfr1ЗФ (5'-TTGAGGAGCTTCACCGAACTCCA-3'); |
| Вегфр1ЗР (5'-TATCTTCATGGAGGCCTTGGGtTT-3'); |
| Вегфр2ЗФ (5'-AGGCCCATGAGTCCAACTA-3';; |
| Вегфр2ЗР (5'-AGACCATGTGGCTCTCTCTCTCTCTCTCCA-3'); |
| Pdgf-cЗФ (5'-ATGCCACAAGTКАКААААААККАКГ-3'); |
| Pdgf-cЗР (5'-AAGGCAGTCACAGCATGTTGAG-3'); |
| Встреча сЗФ (5'-ACGTTGAAATGCACAGTTGGTCCC-3';; |
| Встретился сЗР (5'-TTGCGTCTCTCGCTCGCTGTTGA-3'); |
| Fgf2ЗФ (5'-ACTCCAGTTGGTGTGTGGCACTGA-3'); |
| Fgf2ЗР (5'-AACAGTATGGCCTCTCTCTCCAGGT-3'); |
| Tgfb2ЗФ (5'-GCTTGGATGCGGCCTTGCTTTT-3';; |
| Tgfb2ЗР (5'-CTCCAGКАКАГААГТГТГКАТГТГ-3'); |
| Анг2ЗФ (5'-ATCCAACACCGAGAGATGGCAGT-3'); |
| Анг2ЗР (5'-AACTCATTGCCCAGTACTCT-3'); |
| HgfЗФ (5'-GCATTCAAGGCCAAGGAGAAGGTT-3';; |
| HgfЗР (5'-TCATGCTGTGAGGGTACTGCGAA-3'); |
| 18sЗФ (5'-GCCCTCAACTTCGATTGGTAGT-3';; |
| 18sЗР (5'-CCGGAATCGAACCCTGATT-3'). |
Таблица 1: Праймеры, используемые для исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Murine модели CLI в основном состояли в перевязке бедренной артерии просто дистальный к происхождению profunda бедрарис 4,5,6,7,8,9. Это показало, чтобы оставить большую часть залога циркуляции нетронутыми, который восстанавливает приток крови к конечности в течение 7 дней 9. Удаление залоговой кровати может быть достигнуто путем иссечения бедренной артерии. Тем не менее, до трети первоначального кровотока может быть восстановлена уже через 7 дней после процедуры, учитывая, что большинство сосудов залога возникают из внутренней подвздошной артерии 7. Lejay et al предложили последовательные перевязки со второй перевязкой, выполняемой на общей подвздошной артерии, эффективно уменьшая поддающееся перфузии, обеспечиваемые внутренней подвздошной артерией 4. Критические шаги в рамках этого протокола включают в себя не только выявление внешней подвздошной артерии чуть выше связки с глоток, но и перевязка и иссечение дистальных внешних подвздошных и бедренных артерий и вен, что служит двойной цели: увеличить тяжесть ишемии, а также улучшить техническую воспроизводимость модели, как воздействие бедренной артерии само по себе часто приводит к разрыву вены.
Одним из ограничений этой техники является острое прерывание кровотока к конечности, которое отличается от затяжного процесса, связанного с накоплением атеросклеротической бляшки, приводящей к стенозу артерии и окклюзии. Тем не менее, снижение кровотока присутствовало и через 2 недели, установленный срок для диагностики хронической ишемии. Кроме того, залогообеспечение было увеличено только с ишемическим оскорблением, которое имитирует процесс формирования залога, наблюдаемый в хронически ишемических конечностях.
Неоваскуляризация ишемических конечностей включает в себя сложное взаимодействие биологических событий, а именно ангиогенеза и артериогенеза. Этот протокол включает в себя различные анализы, которые оценивали вмешательство предопорчивых ангиогенных методов лечения ангиогенного прорастания (плотность капиллярного сосуда) и разработки сосудов (артериогенез), наиболее важного механизма толерантности человека для ишемии нижних конечностей. Одновременно, лазерный Доплер используется для открытия функции этих новых или расширенных сосудов, и для впервые лазерной микродиссекции капилляров используется для сбора ECs раскрытия молекулярных механизмов, которые лежат в основе функционального восстановления. Этот протокол дает воспроизводимую модель животных, которая может имитировать эффекты CLI стандарт тестирования, когда животные обрабатываются с возможными ангиогенных методов лечения, которые могут быть применены в клиническом контексте в будущем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Хосе Рино и Танию Карвалью, руководителей Биоimaging фонда и гистологии и сравнительной патологии лаборатории Института Медицины Молекулярной Jo'o Лобо Antunes, соответственно. Мы также благодарим Вячеслава Сущика из кафедры анатомии Новой медицинской школы/Факулдаде-де-Сьончиас Медикас, Университет Нова-де-Лисбоа.
Справка о финансировании: проект, финансируемый UID/IC/0306/2016 Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia. Паула де Оливейра поддерживается стипендией (SFRH/BD/80483/2011) от Фунданьо пара Ci'ncia e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
