Utvärdering av lagrings stabiliteten hos extracellulära vesikler
Summary
Här presenterar vi ett lätt tillämpbart protokoll för att bedöma lagrings stabiliteten hos extracellulära vesikler, en grupp av naturligt förekommande nanopartiklar som produceras av celler. Vesiklarna är laddade med glukuronidas som modell enzym och lagras under olika förhållanden. Efter lagringen utvärderas deras fysikalisk-kemiska parametrar och aktiviteten hos det inkapslade enzymet.
Abstract
Extracellulära vesikler (EVs) är lovande mål i aktuell forskning, som ska användas som läkemedel, läkemedel-bärare, och bio markörer. För deras kliniska utveckling är inte bara deras farmaceutiska aktivitet viktig utan även deras produktion måste utvärderas. I detta sammanhang fokuserar forskningen på isolering av EVs, deras karakterisering, och deras lagring. Det nuvarande manuskriptet syftar till att tillhandahålla ett lättsamt förfarande för bedömning av effekten av olika lagrings förhållanden på EVs, utan genetisk manipulation eller specifika funktionella analyser. Detta gör det möjligt att snabbt få ett första intryck av stabiliteten hos EVs under en given lagrings förhållanden, och EVs som härrör från olika cell källor kan jämföras lätt. Stabilitets mätningen baseras på de fysikalisk-kemiska parametrarna för EVs (storlek, partikel koncentration och morfologi) och bevarandet av deras last. Den senare bedöms av saponin-medierad inkapsling av enzymet beta-glukuronidas i EVs. Glukuronidas fungerar som ett surrogat och möjliggör en enkel kvantifiering via klyvning av en fluorescerande reporter molekyl. Det nuvarande protokollet kan vara ett verktyg för forskare i sökandet efter lagrings förhållanden som optimalt behåller EV egenskaper att avancera EV forskning mot klinisk tillämpning.
Introduction
EVs är membran bundna nanopartiklar som produceras av nästan alla cell typer. För däggdjurs celler kan EVS indelas i två huvud grupper med skilda produktions kedjor1,2. Membran vesikler, med en storleks intervall från cirka 100-1000 Nm, produceras genom direkt spirande från cell membranet. Exosomer, storlek 30-200 nm, härstammar från multivesikulära kroppar som bildas genom inåtgående i endosomer som därefter smälter samman med cell membranet för att frigöra flera exosomer samtidigt. Huvud funktionen hos dessa vesikler är transporten av information mellan cellerna3. För detta ändamål, laster som RNA, DNA, och proteiner är aktivt sorteras in i dem. EVs kan förmedla en mängd effekter på sina mål, med konsekvenser för både hälsa och sjukdoms tillstånd. På ena sidan, de förmedlar positiva effekter såsom vävnadsregenerering, antigen presentation, eller antibiotika effekter, vilket gör dem gynnsamma mål för deras utveckling som Therapeutics4,5. Å andra sidan kan EVS främja tumör vascularization6, inducera åskådare effekter i stress svar7, och kan spela en roll i autoimmuna sjukdomar8 och inflammatoriska sjukdomar9. Sålunda, de kan vara en viktig del för en bättre förståelse för många patologiska effekter. Emellertid, förekomsten av förändrade EVS i många sjukdomar, såsom cancer10,11,12 och kardiovaskulära sjukdomar13, och deras lätt tillgänglighet i blod och urin gör dem idealiska Biomarkörer. Slutligen, deras goda biokompatibilitet14 och deras inneboende inriktnings förmåga gör EVS också intressant för läkemedels leverans15. I detta manuskript beskriver vi ett protokoll för utvärdering av lagrings stabiliteten hos EVs som härrör från däggdjurs celler, en viktig egenskap som fortfarande unders öks lite.
För den kliniska utvecklingen av EVs, det finns fortfarande många hinder för att övervinna16, inklusive utvärdering av deras terapeutiska effekter, produktion, rening, och lagring17. Medan-80 ° c är allmänt ses som den gyllene standarden för EV lagring18, de nödvändiga frysarna är dyra, och bibehålla den erforderliga kyl kedjan från produktionen till patienten kan vara utmanande. Dessutom visar vissa rapporter att lagring vid-80 ° c fortfarande inte optimalt bevarar EVS och inducerar en förlust i EV funktionalitet19,20. Andra metoder, såsom frys torkning21,22 eller spray-torkning23, har föreslagits som potentiella alternativ till fryst lagring av EVS.
Det optimala sättet att bedöma lagrings stabiliteten är att testa EVs i funktionella analyser eller genom att utvärdera en specifik markör, till exempel deras antibakteriella aktivitet19. Detta är möjligt när den önskade effekten av vesikler är känd och när en distinkt grupp av EVs ska studeras. Om EVs från olika cell källor ska jämföras (t. ex. för läkemedels inkapsling) eller om det inte finns någon känd funktionell avläsning, är det inte längre möjligt att bedöma förändringar på grund av lagring på ett direkt sätt.
Å andra sidan, helt enkelt utvärdera förändringar i deras fysikalisk-kemiska parametrar, såsom storlek, partikel återvinning, och protein koncentration, inte alltid förutsäga förändringar i EV aktivitet, som har visats i ett nyligen patent20.
Här ger vi ett lätt tillämpbart protokoll för att mäta lagrings stabiliteten hos EVs genom att bedöma deras fysikalisk-kemiska parametrar kombinerat med aktiviteten hos ett inkapslat beta-glukuronidas-enzym som ett surrogat för last av EVs. Belastningen av enzymet sker genom saponin inkubation, en mild metod som fastställts med EVS från olika källor21,24,25. Saponin bildar övergående porer i EV-membranet, vilket möjliggör enzym upptag i vesikeln. Som enzymer är benägna att förlora sin verksamhet om de utsätts för ogynnsamma lagrings förhållanden, de är en idealisk surrogat för utvärdering av bevarandet av funktionella laster av EVs.
Vi har visat att tillämpningen av detta protokoll till EVs härrör från mänskliga mesenkymala stamceller (MSCs), mänskliga navel Strängs endotelceller (HUVECs), och mänskliga adenocarcinom alveolära epitelceller (A549) faktiskt resultera i stora skillnader i lagrings stabilitet mellan olika cellinjer, vilket bör beaktas vid val av EV-källa21.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript presenterar vi ett omfattande protokoll för att studera stabiliteten hos EVs under olika lagrings förhållanden. Med en kombination av inkapslad glukuronidas som en funktionell avläsning och utvärdering av de fysikalisk-kemiska parametrarna hos de europeiska oberoende observatörs programmen, möjliggör protokollet en enkel bedömning av lagrings stabiliteten för EVs och jämförelsen mellan EVs från olika cell Linjer. SEM och TEM som komplementära metoder ger en inblick i förändringar av EVs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den NanoMatFutur Junior forsknings programmet från det federala ministeriet för utbildning och forskning, Tyskland (Grant nummer 13XP5029A) stödde detta arbete. Maximilian Richter fick stöd av Studienstiftung des Deutschen Volkes (tyska akademiska stipendie stiftelsen) genom en Ph.D. gemenskap.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
References
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
