뉴클레아제 없는 산소 제거제 프로토카테의 발현 및 정제 3,4-디옥시게나아제
Summary
프로토카테츄아제 3,4-디옥시게나아제(PCD)는 기질 인 프로토카츄산(PCA)을 사용하여 수성 시스템에서 자유 분무기 산소를 효소적으로 제거할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 산소 제거 효소의 발현, 정제 및 활성 분석을 설명합니다.
Abstract
단 하나 분자 (SM) 현미경 검사법은 실시간으로 불소 표지된 생체 분자의 동적 분자 상호 작용의 연구 결과에서 이용됩니다. 그러나 형광단은 용존 산소에 의한 광표백을 통해 신호가 손실되는 경향이있다(O2). 광표백을 방지하고 형광공 수명을 연장하기 위해 산소 청소 시스템(OSS)을 사용하여O2를줄입니다. 시판되는 OSS는 핵산을 손상시키거나 분해하는 뉴클레아제에 의해 오염될 수 있으며, 실험 결과의 해석을 혼란스럽게 할 수 있다. 여기서 우리는 검출 가능한 뉴클레아제 오염이 없는 고활성 슈도모나스 푸티다 프로토카테추아제-3,4-디옥시게나아제(PCD)의 발현 및 정제를 위한 프로토콜을 상세히 설명한다. PCD는 기질 인 protocatechuic 산 (PCA)을 3-카르복시 -시스, 시스-무콘 산으로 변환하여 반응성 O2 종을 효율적으로 제거 할 수 있습니다. 이 메서드는 O2가 데이터 수집에 해로운 역할을 하는 모든 수성 시스템에서 사용할 수 있습니다. 이 방법은 시판되는 PCD와 비교하여 고활성, 뉴클레아제 프리 PCD를 제조하는데 효과적이다.
Introduction
단일 분자 (SM) 생물 물리학은 우리가 생물학적 현상을 보는 방식을 변화시키는 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 분야는 생물학에 물리학 및 화학의 기본 법칙을 연결하는 독특한 능력을 가지고있다. 형광 현미경 검사법은 SM 감도를 달성할 수 있는 1개의 생물물리학적인 방법입니다. 형광은 작은 유기 형광체 또는 양자점1에연결하여 생체 분자를 검출하는 데 사용됩니다. 이 분자는 비가역적으로 광표백하기 전에 레이저에 의해 흥분될 때 광자를 방출할 수 있습니다2. 광표백은 형광 라벨이 원하는 파장에서 흥분하는 능력을 파괴하는 화학적 손상을 겪을 때 발생합니다2,3. 수성 완충제에 반응성 산소 종 (ROS)의 존재는광표백2,4의주요 원인입니다. 또한, ROS는 생체 분자를 손상시키고 SM 실험5,6에서잘못된 관찰로 이어질 수 있습니다. 산화 손상을 방지하기 위해 산소 청소 시스템 (OSS)을 사용할 수 있습니다3,7,8. 포도당 산화증 /카랄라제 (GODCAT) 시스템은 산소8을제거하는 데 효율적이지만 잠재적으로 손상될 수 있는 과산화물을 중간체로 생성합니다. 이들은 SM 연구 결과에 있는 관심의 생체 분자에 손상될 수 있습니다.
대안적으로, 프로토카테츄아테 3,4 디옥시게라아제(PCD)는 기질 프로토카테추산(PCA)7,9를이용하여 수성 용액으로부터O2를 효율적으로 제거한다. PCD는 논헴 철을 사용하여 PCA를 조정하고 용해O210을사용하여 카테콜 링 개방 반응을 촉매하는 금속 효소입니다. 이러한 한 단계 반응은 SM 실험에서 형광공 안정성을 향상시키기 위한 전체적으로 더 나은 OSS인 것으로 나타났다7. 불행히도, PCD를 포함하여 많은 시판되는 OSS 효소는 오염뉴클레아제를함유한다 11. 이러한 오염 물질은 SM 실험에 사용되는 핵산 계 기판의 손상으로 이어질 수 있습니다. 이 작품은 SM 시스템에서 재조합 PCD의 사용을 위한 크로마토그래피 기반 정제 프로토콜을 해명할 것이다. PCD는 ROS가 데이터 수집에 필요한 기판을 손상시키는 모든 실험에 광범위하게 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
산소 청소 시스템은 일반적으로 광표백을줄이기 위해 단일 분자 형광 현미경 검사법에 포함3,7,8. 이러한 현미경 기술은 종종 핵산 또는 핵산과 단백질 상호 작용을 관찰하는 데 사용된다1,13,14. 뉴클레아제와 OSS의 오염은 가짜 결과로 이어질 수 있습니다.</p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH GM121284 및 AI126742에서 KEY로 지원되었습니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
