Summary

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Published: November 08, 2019
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Summary

Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.

Abstract

A microscopia de molécula única (SM) é usada no estudo de interações moleculares dinâmicas de biomoléculas rotuladas por fluorofóforos em tempo real. No entanto, os fluorofônicos são propensos à perda de sinal através do fotobranqueamento por oxigênio dissolvido (O2). Para evitar o reclareamento e estender a vida fluorofônica, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) são empregados para reduzir O2. OsS comercialmente disponíveis podem ser contaminados por nucleases que danificam ou degradam os ácidos nucleicos, confundindo a interpretação dos resultados experimentais. Aqui detalhamos um protocolo para a expressão e purificação de pseudomonas altamente ativas putida protocatechuato-3,4-dioxigenase (PCD) sem contaminação por nuclease detectável. Pcd pode remover eficientemente reativo O2 espécies através da conversão do ácido protocatecogênico substrato (PCA) para 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método pode ser usado em qualquer sistema aquoso onde O2 desempenha um papel prejudicial na aquisição de dados. Este método é eficaz na produção de PCD altamente ativo, livre de nuclease em comparação com PCD comercialmente disponível.

Introduction

A biofísica de molécula única (SM) é um campo em rápido crescimento mudando a forma como olhamos para fenômenos biológicos. Este campo tem a capacidade única de ligar as leis fundamentais da física e da química à biologia. A microscopia da fluorescência é um método biofísico que pode alcançar a sensibilidade do SM. Fluorescência é usada para detectar biomoléculas, ligando-os a pequenos fluorofônicos orgânicos ou pontos quânticos1. Estas moléculas podem emitir fótons quando excitados por lasers antes do photobleaching irreversivelmente2. Photobleaching ocorre quando os rótulos fluorescentes sofrem danos químicos que destrói sua capacidade de excitar no comprimento de onda desejado2,3. A presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tampão aquoso são uma das principais causas de fotobranqueamento2,4. Além disso, o ROS pode danificar biomoléculas e levar a observações errôneas nos experimentos sm5,6. Para evitar danos oxidativos, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) podem ser usados3,7,8. O sistema de oxidase/catalase de glicose (GODCAT) é eficiente na remoção de oxigênio8,mas produz peróxidos potencialmente prejudiciais como intermediários. Estes podem ser prejudiciais para biomoléculas de interesse em estudos de SM.

Alternativamente, o protocatechuato 3,4 dioxygenase (PCD) removerá eficientemente O2 de uma solução aquosa usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD é uma metalloenzima que usa ferro autónomos para coordenar PCA e catalisar a reação de abertura do anel catechol usando dissolvido O210. Esta reação de um passo é mostrado para ser um oss global melhor para melhorar a estabilidade do fluorofóbico em experimentos SM7. Infelizmente, muitas enzimas oss comercialmente disponíveis, incluindo PCD, contêm nucleases contaminantes11. Esses contaminantes podem levar ao dano de substratos à base de ácido nucleico usados em experimentos com SM. Este trabalho irá elucidar um protocolo de purificação à base de cromatografia para o uso de PCD recombinante em sistemas de SM. Pcd pode ser amplamente aplicado a qualquer experimento onde ROS estão prejudicando os substratos necessários para a aquisição de dados.

Protocol

1. Induzir a expressão pcd em E. coli Combine 1 μL pVP91A-pcaHG PCD expressão plasmid (20 ng/μL, Figura 1A)e 20 μL de E.coli BL21 (20 μL células comercialmente disponíveis, > 2 x 106 cfu/μg plasmid) em um tubo. Agite o tubo para misturar. Coloque o tubo no gelo 5 min. Coloque a transformação em 42 °C para 30 s. Em seguida, gelo 2 min. Adicionar 80 μL SOC media (super caldo ideal com repressão catabolite…

Representative Results

Pcd de scavenger de oxigênio comercialmente disponível é freqüentemente contaminado com uma nuclease de DNA. Contaminar a atividade da nuclease pode levar a resultados espúrios em estudos fluorescentes, particularmente estudos que analisam proteínas interagindo com DNA ou DNA. Descobrimos que pcd recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, pode ser expressa em E. coli (Figura 1). O heterodimero é primeiro purificado pela cromatog…

Discussion

Sistemas de limpeza de oxigênio são comumente incluídos na microscopia de fluorescência de molécula única para reduzir o fotobranqueamento3,7,8. Essas técnicas de microscopia são freqüentemente usadas para observar ácidos nucleicos ou interações proteicas com ácidos nucleicos1,13,14. A contaminação dos SEs com nucleases p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo NIH GM121284 e AI126742 para key.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

References

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Cite This Article
Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

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