Summary
Протокатчуат 3,4-диоксигеназа (PCD) может ферментативно удалить свободный диатомический кислород из ваневой системы с помощью своего субстрата протокатчуйской кислоты (PCA). Этот протокол описывает экспрессию, очистку и анализ активности этого фермента очистки кислорода.
Abstract
Единая молекула (SM) микроскопия используется в изучении динамических молекулярных взаимодействий флюорофора помечены биомолекулы в режиме реального времени. Тем не менее, фторофоры склонны к потере сигнала через фотоотбеление растворенного кислорода (O2). Для предотвращения фотоотбеления и продления срока службы фторофора, системы очистки кислорода (OSS) используются для уменьшения O2. Коммерчески доступные ПСО могут быть загрязнены нуклеазами, которые повреждают или ухудшают нуклеиновой кислоты, сбивая с толку интерпретацию экспериментальных результатов. Здесь мы подробно протокол для выражения и очистки высокоактивных Pseudomonas putida протокатечуат-3,4-диоксигеназы (PCD) без каких-либо обнаруживаемых загрязнения нуклеазы. PCD может эффективно удалить реактивные O2 видов путем преобразования субстрата протокатчуйской кислоты (PCA) в 3-карбокси-цис, cis-muconic кислоты. Этот метод может быть использован в любой водной системе, где O2 играет пагубную роль в получении данных. Этот метод эффективен в производстве высокоактивных, нуклеаза бесплатно PCD по сравнению с коммерчески доступных PCD.
Introduction
Биофизика одной молекулы (SM) является быстро растущим полем, меняющим то, как мы смотрим на биологические явления. Эта область обладает уникальной способностью связывать фундаментальные законы физики и химии с биологией. Флуоресцентная микроскопия является одним из биофизических методов, которые могут достичь чувствительности СМ. Флуоресценция используется для обнаружения биомолекул, связывая их с небольшими органическими флюорофорами или квантовыми точками1. Эти молекулы могут излучать фотоны, когда возбужденных лазерами до фотоотбелевания необратимо2. Фотоотбеление происходит, когда флуоресцентные этикетки проходят химические повреждения, которые разрушают их способность возбуждать на желаемой длине волны2,3. Присутствие реактивных видов кислорода (ROS) в вавном буфере являются основной причиной фотоотбелевания2,4. Кроме того, ROS может повредить биомолекулы и привести к ошибочным наблюдениям в SM экспериментов5,6. Для предотвращения окислительного повреждения можно использовать системы очистки кислорода (OSS)3,7,8. Глюкоза оксидаза / каталазы (GODCAT) система эффективна при удалении кислорода8, но она производит потенциально опасных перекиси в качестве промежуточных. Они могут нанести ущерб биомолекулам, представляющим интерес в исследованиях СМ.
Кроме того, протокатчуат 3,4 диоксигеназы (PCD) будет эффективно удалить O2 из вогового раствора с помощью субстрата protocatechuic кислоты (PCA)7,9. PCD является металлоэнзим, который использует nonheme железа для координации PCA и катализировать катехиз омрачаемого кольца открытия реакции с помощью растворенного O210. Это один шаг реакции показано, что в целом лучше OSS для улучшения стабильности фторофора в SM экспериментов7. К сожалению, многие коммерчески доступные ферменты OSS, включая ПХД, содержат загрязняющие нуклеазы11. Эти загрязняющие вещества могут привести к повреждению субстратов на основе нуклеиновой кислоты, используемых в экспериментах с СМ. Эта работа позволит разъяснить протокол очистки на основе хроматографии для использования рекомбинантных PcD в системах SM. PCD может быть широко применен к любому эксперименту, где ROS повреждает субстраты, необходимые для получения данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Индуцировать выражение PCD в кишечной палочке
- Объедините 1 l pVP91A-pcaHG PCD выражение плазмида (20 нг/Зл, Рисунок 1A) и 20 Зл E.coli BL21 (20 л коммерчески доступных клеток, 2 х 106 cfu/qsmid) в трубке. Флик трубки для смешивания. Поместите трубку на лед 5 мин.
- Поместите преобразование при 42 градусах по Цельсию на 30 с. Затем лед 2 мин.
- Добавьте 80 мл SOC media (супер оптимальный бульон с катаболитными репрессиями: 2,5 мм KCl, 10 мм NaCl, 2% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 мм глюкозы). Встряхните при 225 оборотах на мин (об / мин) 37 градусов по Цельсию на 1 ч.
- Плита трансформации реакции на LB Amp Agar (1L Лурия Бульон агар: 10 г NaCl, 10 г бакто-триптон, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г агара, 50 мкг/мл ампициллин; 25 мл на 10 см диаметр омичи блюдо).
- Инкубировать тарелку, крышкой вниз, при 37 градусах по Цельсию в течение 16-18 ч.
- Прививать 50 мл л.с. Amp (1L LB: 10 г бакто-триптона, 10 г NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 50 мкг/мл ампициллин) в 250 мл колбы Эрленмейера с одной колонией. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию при 16-18 ч встряхивания при 225 об/мин.
- Передача 20 мл культуры 4 L колбу с 1 L LB Amp. Встряхните при 225 об/мин при 37 градусах По Цельсию.
- Каждый h измеряет культуру OD600 (оптическая плотность на 600 nm). По мере того как культура OD600 приближается к 0.5, увеличьте частоту измерений до каждых 15 мин. Пожеланная плотность культуры 0,5 OD600.
- Перенесите колбу 4L в корзину со льдом. Вихрь колбу в ледяной ванне, чтобы снизить температуру культуры.
Примечание: Время на льду должно быть сведено к минимуму, чтобы клетки оставались метаболически активными. В идеале клетки будут находиться на льду менее 10 мин. - Успешную индукцию ПХД можно наблюдать при денатурировании анализа натрия додецил сульфат полиакриламида геля (SDS-PAGE). Урожай 1 мл неиндуцированной культуры в трубке. Спин образца 1 мин при 14000 х г в микрофуге при температуре окружающей среды. Декант супернатант.
- Растворить пеллетные клетки в 150 Л ПБС (фосфат буферный солин).
- Добавьте равный объем 2X погрузочного красителя (1,2% SDS, 30% глицерола, 150 мм Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% бромофенол синий, 15% -меркаптоэтанол). Vortex образец тщательно перемешать.
- Отварить образец в течение 3 мин и переложить на лед. Образец может храниться в морозильной камере -20 градусов для дальнейшего анализа.
Примечание: PBS коммерчески доступен с или без CaCl2 и MgCl2. Многие лаборатории будут иметь PBS без CaCl2 и MgCl2 для методов клеточной культуры. Мы не нашли никакой разницы с PBS с или без CaCl2 и MgCl2.
- Перенесите колбу 4 l в инкубатор при 17 градусах По Цельсию при 180 об/мин встряхивания. Продолжайте следить за OD600 каждые 20 минут.
- При 0,7 OD600 добавьте изопропил-бета-D-thiogalactopyranoside (IPTG) до 0,5 мМ конечной концентрации (0,25 М/ мл бульонного раствора) и 10 мг/л аммония железа (II) сульфат гексагидрата (Fe (NH4)2(SO4)2, 10 мг/мл. PCD гены pcaH и pcaG индуцируются из промоутера T5 путем добавления IPTG(Рисунок 1A). Сульфат железа связан PcD и требуется для каталитического деятельности, координируя кислорода во время открытия катехиза.
- Встряхните культуру при 180 об/мин при 17 градусах по Цельсию на 18 ч.
- Поместите культурную колбу во льду как в 1.2. Урожай 1 мл индуцированных клеток для SDS-PAGE как в 1,3.
- Налейте бактериальной культуры в бутылки, подходящие для центрифугации. Культура 1 л может быть центрифугом в 4 250 мл конических нижних бутылок. Пеллет культуры на 4 кв кс в течение 20 мин при 3000 х г. Декант супернатанты. Утилизировать бактериальные жидкие отходы надлежащим образом.
- Pipet для того чтобы resuspend гранулы в 25 mL холодных PBS (CaCl2 и MgCl2 необязательны) в 1 L культуры.
- Передача повторного подвески до 50 мл конических труб (1 50 мл трубки на 1 л культуры). Пеллетите клетки при 3000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Декант супернатант и распоряжаться надлежащим образом.
- Приостанавливается действие клеток в 10 мл буфера из лисиса (300 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 20 мм имидазол, 10% глицерол, 800 нг/мл Пепстатин, 1 мкг/мл леупептина, и 87,1 мкг/мл фенилметилсульфонил фтора (PMSF)) путем пайптинга. Заморозить повторное с жидким азотом в колбе Dewar. Храните образцы трубок в морозильной камере -80 градусов. Мы очищены PCD от гранул, хранящихся при -80 градусов по Цельсию в течение одного года без видимой потери активности.
- Сравните неиндуцированные и индуцированные клетки SDS-PAGE.
Примечание: У нас не было никаких трудностей с индукцией PCD неетеродимер. Тем не менее, мы рекомендуем тестировать индукцию, прежде чем продолжить очистку в случае, если любой реагент истек неожиданно.- Соберите пластины для SDS-PAGE (размеры: 7,3 см х 8,3 см х 0,75 мм толщиной). Укладка гель 1,5 мл 6% полиакриламид (6% акриламида, 125 мм Tris-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS, 0,1% персульфат аммония, 0,001% TEMED). Разрешающый гель составляет 3,5 мл 12% полиакриламид (12% акриламида, 375 мм Трис-ХК, рН 8,8, 0,1% SDS, 0,1% гперсия аммония, 0,001% TEMED). Вставьте 10 хорошо гребень на укладке слоя.
- Нагрузка 10 Зл неиндуцированных и индуцированных бактериальных образцов. Нагрузка 4 Зл акрарованных молекулярных маркеров веса для белков(рисунок 1B).
- Электрофорез гель на 16,5 В / см примерно 1 ч. Бромофенол синий должен достичь нижней части геля.
- Поместите гель в Coomassie Blue пятно (10% уксусной кислоты, 40% метанола, 0,1% Coomassie Синий краситель) в пластиковой ванне. Пятно должно полностью погрузить гель. Пятно при температуре окружающей среды в течение 20 мин. Нежное вращение во время окрашивания не является обязательным.
- Замените раствор депятном (10% уксусной кислоты, 40% метанола). Инкубировать при температуре окружающей среды с дополнительным нежным вращением до тех пор, пока белковые полосы не будут видны.
- Замените дестин деионизированной водой. Среди бактериальных белков индуцированные субъединицы ПХД должны быть видны в индуцированных клетках. Гексахитидин помечены PCD субединицы pcaH имеет молекулярный вес 28,3 kDa и pcaG подразделение 22,4 kDa. Если подразделения PCD не являются очевидными, следует провести новую индукцию, полученную из новой колонии.
2. Никель сродство хроматографии очистки PCD
- Оттепель на льду одна 50 мл трубки индуцированных клеток. Для полной размобливания образца может потребоваться 2-3 ч.
- Сохраняя трубку на льду, снотворно ездит на образец при 30% амплитуде в течение 1 мин, езда на велосипеде 1 с и выключается. Используйте конический микротип (диаметр 0,125 дюйма) звуковой элемент. Максимальная мощность 400 Вт, частота - 20 кГц и на 1 л.
- После звукования добавьте лизоним до 0,2 мг/мл конечной концентрации (10 мг/мл бульонного раствора) и держите на льду 30 мин при 4 градусах Цельсия.
- Налейте бактериальный лизат в предварительно охлажденный поликарбонат (размеры: 25 мм x 89 мм). Бутылка должна быть совместима с фиксированным углом ультрацентрифугного ротора. Другие трубки и/или роторы могут быть заменены, но окончательная сила гравитации должна быть сохранена.
- Центрифуга в течение 60 мин при 120 000 х г при 4 градусах Цельсия. Сотовый мусор образует гранулы. Супернатант может выглядеть желтым.
- Гранулы могут быть включены в последующий анализ SDS-PAGE для определения растворимости ПХД(рисунок 1B). Solubilize гранулы путем вихря в 10 мл PBS. Перенесите 150 л.с. на трубку 1,5 мл. Подготовьте образец для SDS-PAGE как в 1.3.
- Налейте супернатант в холодную коническую трубку 50 мл. Обратите внимание на громкость. Загрязнение супернатанта бактериальной ДНК может дать вязкий образец. Бактериальная геномная ДНК может блокировать поток колонны. Ультрацентррифификация шаг 2.2 должны быть повторены, чтобы гранулы бактериальной ДНК. Гранулы из этого второго спина не могут быть легко видны или могут быть прозрачными.
- Сделать 500 мл Ni Buffer A (300 мМ NaCl, 50 мм Tris-HCl, рН 7,5, и 10% глицерол, 800 нг/мл Пепстатин, 1 мкг/мл leupeptin, и 87,1 мкг/мл PMSF) и 500 мл Ni Buffer B (300 м. 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 10% глицерол, 800 нг/мл Пепстатин, 1 мкг/мл леупептина, и 87,1 мкг/мл PMSF, 250 мМ имидазол, рН 8,0). Пройдите оба Ni буфера через фильтры пор 0,2 мкм.
- Образец, буферы и система FPLC (быстрая белковая жидкая хроматография) находятся в холодильной комнате при 4 градусах Цельсия. Насос для мытья A с Ni Buffer A и насос B с Ni Buffer B. Вымойте систему с 20 мМ имидазолом (8% Ni Buffer B, 92% Ni Buffer A) до тех пор, пока УФ и проводимость не стабилизируются. Мы регулярно протекаем буферы на уровне 5 м/мин с ограничением давления 1,0 MPa. Скорость потока и предел давления должны определяться спецификациями используемого инструмента FPLC.
- Подготовьте колонку с никель-заряженной микой йеником (размеры: 110 мм в длину х 5 мм). Способность к связыванию с голени составляет 50 мг/мл и может переносить давление 1 МПа. Перед очисткой столбец можно налить и хранить при 4 градусах Цельсия.
Примечание: Размер колонны может быть пропорционально увеличен, чтобы вместить более одной трубки индуцированных клеток 50 мл, если требуется больше белка. Мы предпочитаем свежий столбец для каждого препарата, чтобы гарантировать, что никакие остаточные белки не загрязняют наш желаемый белок. Тем не менее, никель шрейны могут быть переработаны в соответствии с инструкциями производителя. - Прикрепите колонку с миник-заряженной мисиной к FPLC. Выполнить 20 мл 92% Ni Buffer A и 8% Ni Buffer B (20 мМ имидазола) на 0,5 мл/мин с 0,5 MPa предел давления через столбец, чтобы уравновесить. В режиме реального времени FPLC должен измерять A280 (280 нм УФ-абсорбции), а также проводимость. Если эти значения не стабилизировались после прохождения через столбец 20 мл, поток буферов до тех пор, пока они не стабилизируются.
- Загрузите образец на столбец (10 мл) на 0,15 м/м/ мин. Установите предел давления до 0,5 МПа. Соберите поток через.
- Вымойте колонку с 20 мл Ni Buffer на 20 мМ имидазол (92% Ni Buffer A и 8% Ni Buffer B). Сохраните мытье в трубке 50 мл для анализа. Вымойте колонку с 15 мл 50% Ni Buffer A и 50% Ni Buffer B (125 мМ имидазола). Соберите elution в 19 фракциях объема 0,8 мл. Вымойте колонку с 15 мл 100% Ni Buffer B. Соберите дополнительные 75 фракций 0,2 мл. Некоторые PCD heterodimer будет elute в 50% Ni Buffer B мыть, но большинство неоздоровительных будет elute в 100% Ni Buffer B мыть.
- Анализ собранных фракций на 12% Гели SDS-PAGE, чтобы подтвердить наличие ПХД. Добавьте равные объемы 2X погрузочного красителя в поток через, мыть, и пик280 фракций. Отварить 3 мин. Переложить на лед. Налейте два 12% Геля SDS-PAGE (как в шаге 1.7). Повторите метод геля, описанный в 1.7.
3. Нуклеаза деятельности асссе
- На основе анализа SDS-PAGE выявляется фракция сродства никеля, которые содержат почти чистый ПХД. Объедините 5 фракций хроматографии и 500 нг 3 кб суперкоидной плазмиды pXba в буфере реакции (50 мм Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 мМ MgCl2, 0.1 mM DTT) с окончательным объемом 50 мл L.
- Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Включите отрицательный контроль (без добавления белка) и положительный контроль (коммерчески доступный PCD). Остановите реакцию с помощью стоп-раствора 10 л (150 мМ EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% глицерола, 0,15% Оранжевый G).
- Образцы могут храниться в морозильной камере -20 градусов, которые будут проанализированы позже. Любой supercoiled плазмида может быть использован в нуклеаза ассы до тех пор, как суперкоидные и расслабленной реакции круга продукты могут быть решены агарозный гель электрофорасис.
- Налейте 120 мл 1% агарозный гель в буфере 1X TAE ethidium (40 мм Трис-ацетат, 1 мМ EDTA, 0,5 мкг/мл бромистого этидия) в гель литой (размеры: 15 х 10 см). Используйте 15 хорошо гребень (размеры скважины: 5 мм х 1,5 мм). Когда гель установлен, погрузите его в буфер 1X TAE ethidium.
- Проанализируйте 30 л реакций агарозным гелем. Электрофореза при температуре 10 В/с при температуре окружающей среды около 1 ч. Оранжевый G красителя фронт должен быть в конце геля.
- Используйте флуоресценционный сканер, чтобы немедленно отобразить сигнал бромистого этидия геля. Если 3 кБ плазмида была использована, медленная полоса будет расслабленной кругах на 3,5 кб, линейная ДНК будет работать на 3 кб, и supercoiled плазмида будет иметь самую быструю мобильность на 2 кб.
- Рассчитайте общий объем пикселей каждой полосы с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
- Определите объем пикселей различных видов ДНК, таких как суперкоидные, линейные и происшенные круги. Используйте эти значения, чтобы определить процент каждого вида ДНК. Например, увеличение присутствия проникнунных кругов, связанных с долей по сравнению с отрицательным контролем, указывает на наличие нуклеаза. Объем пикселей произанных кругов в полосе делится на значение пикселя общей ДНК. Определите процент, умножая это число на 100.
- Объедините фракции со второго пика elution, которые содержат почти чистый неортодоксимер PCD на основе анализа SDS-PAGE и имеют минимальную к необнаруживаемую активность нуклеаза. Наш типичный объединенный объем составляет 2 мл.
- Загрузите образец в центробежный фильтр с 10 kDa молекулярного отсечения веса. Центрифуга в размахивая центрифуге ведра на 4000 х г в течение 40 минут при 4 кв. C. Кроме того, 35 "фиксированный угол ротора может быть использован на 7500 х г в течение 20 минут при 4 C.
- Повторяйте центрифугацию до тех пор, пока окончательный объем ретентата не будет 100-200 зл.
- Переверните блок фильтра и восстановите ретентат центрифугированием при 1000 х г в течение 2 мин при 4 градусах Цельсия.
4. Размер исключения хроматографии очистки PCD
- Сделайте 250 мл размера исключения хроматографии (SEC) работает буфер (100 мм NaCl, 50 мм Tris-HCl, рН 7,5, 10% глицерол, 0,1 мМ EDTA, 800 нг/мл Пепстатин, 1 мкг/мл Leupeptin, и 87,1 мкг /mL PMSF). Пройдите буфер через фильтр пор0,2 мкм и храните при 4 градусах Цельсия.
Примечание: Выполните все шаги в холодильной комнате при 4 градусах Цельсия. Очистка SEC не является обязательным, но белок должен храниться в буфере SEC работает. Если очистка SEC опущена, ретентат собран в 3.6.2. следует диализировать против 1 l буфера SEC в 10 kDa MWCO (молекулярный вес отрезан) диализные трубки на 4 кВ ночь. - Уравновешивание перекрестной агарозной SEC (размер исключения хроматографии) колонка (димесионы: 10 мм х 300 мм; 24 мл объем кровати; 25 - 500 л объем образца; 1,5 MPa ограничение давления; 2 х 106 Da ограничение исключения; 1 до 300 kDa разделения) с SEC Running Buffer на 0,5 мл/млин.
Примечание: При желании могут использоваться столбцы SEC альтернативного размера. - Загрузите концентрированные фракции в цикл впрыска объемом 200 л. Загрузите образец на 0,5 мл/мин к колонне. Разрешение SEC увеличивается при меньшем объеме нагрузки. Elute с 23 мл SEC работает буфер и собирать 94 фракции из 250 Зл. Хроматограмма SEC должна решить один пикA 280, который является неетеродимером PCD. Мы находим, что PCD elutes 8,9 мл. Время elution изменится с помощью альтернативных столбцов SEC.
5. PCA окисления и нуклеаза деятельности анализы
- Реакции для проверки как окисления PCA и нуклеаза деятельности выполняются в 96-хорошо плоский дно пластины. Соберите реакции в 96 хорошо пластины на льду в 4 "С холодной комнате для предотвращения преждевременного катализа. Комбинат в окончательном объеме 50 мл: 130 мм NaCl, 50 мм Tris-HCl, pH 7,5, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ DTT, 5 мМ PCA, 10 нг /мЛ суперкоидная плазма pXba, и 10 мл отдельных фракций PCD SEC.
Примечание: Фракции PCD SEC должны быть добавлены последними и непосредственно перед анализом, так как белок начнет катализ во время добавления. - PCD окисления PCA приводит к снижению поглощения PCA на 290 нм (A290). Перенесите пластину 96 скважин на держатель пластины считывателя пластины, установленную при внутренней температуре 37 градусов по Цельсию. Ввейте держатель пластины в инструмент и измерьте A290 с интервалом 20 с интервалом в 1 ч. Попроси прибор встряхнуть тарелку 5 с перед каждым чтением.
- После 1 ч прекратите реакцию, добавив 10 л стоп-раствора (150 мМ EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% глицерол, 0,15% Оранжевый G).
- Подготовка, загрузка и запустить гель агарозы, как в шаге 3.2.
- Изображение и анализ агарозный гель, как в шаге 3.3.
- Выберите фракции с наиболее активностью окисления PCA и отсутствием наблюдаемого загрязнения нуклеазы для длительного хранения при -80 градусов по Цельсию. Измерьте A280.
- Рассчитайте общую концентрацию ПХД с использованием Коэффициента A280 и коэффициента вымирания(280) из 734 700 М-1см-1.
- Привязка замораживает отдельные фракции в жидком азоте. Хранить в морозильной камере -80 градусов. Кроме того, объединить активные, нуклеа-свободных фракций, aliquot, и заморозить таким же образом. Наш типичный выход 1-2 мг PCD на L культуры. Типичное использование в эксперименте SM 3 мкг PCD. Мы использовали ПХД, хранящиеся при -80 градусов по Цельсию в течение 1 года без снижения активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Коммерчески доступный кислородный мусорщик PCD часто загрязнен нуклеазой ДНК. Загрязнение нуклеаза деятельности может привести к ложным результатам в флуоресцентных исследований, в частности, исследования, которые анализируют ДНК или ДНК взаимодействующих белков. Мы обнаружили, что рекомбинантные PCD, неортодоподобног гексагистидин помечены pcaH и pcaG, могут быть выражены в кишечной палочки (Рисунок 1). Неортодомимоявляется сначала очищается хроматографией сродства никеля(рисунок 2). PcD eluted в 2 шагах концентраций имидазола. Фракции хроматографии анализируются SDS-PAGE. Фракции почти чистого PCD концентрируются и дополнительно очищаются SEC(рисунок 3). Фракции SEC индивидуально анализируются как для активности окисления PCA, так и для активности нуклеаза(рисунок 4). Фракции, которые отображали высокую активность окисления и отсутствие очевидной активности нуклеаза, анализируются на концентрацию белка и хранятся в морозильной камере -80 градусов для экспериментального использования.
Рисунок 1: Индукция ПХД в кишечной палочке. (A) pVP91A-pcaHG показан с pcaG (я) и гексагисттидин-тегами pcaH (я) PCD субъединиц. (B) Представитель SDS-PAGE гель индукции ПХД. Молекулярные веса указаны слева. На правой стороны мобилизованы 28,3 kDa hexahistidine-tagged pcaH и 22,4 kDa pcaG. Неиндуцированные E. coli (Un), индуцированные E. coli (In), гранулы после E. coli lysis и ultracentrifugation (P), супернатант после ультрацентрифугирования, чтобы быть загружены в колонку никеля (S), репрезентативная фракция после хроматографии никеля (Ni), и репрезентативную фракцию после SEC (SE). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Хроматография сродства никель очищает PcD. (A) Хроматограмма хроматографии сродства никеля. A280 отображается синим цветом, а процентная концентрация Ni Buffer B — красным цветом. Образец был загружен в низкой концентрации имидазола 20 мМ. Протекатель (Flw Thr) показывает растворимые бактериальные белки, которые не связываются с никельской мизины. Колонна была промыта 20 мл 20 мМ имидазол буфера. Вторая 15 мл стирки была выполнена с 125 мМ имидазола. Удаление ПХД было выполнено с 250 мМ имидазола. Некоторые ПХД eluted в присутствии 125 мМ имидазола, но большинство белка eluted в 250 мМ имидазола. (B) Представитель SDS-PAGE анализ никель сродство фракций. Нагрузка, протока (Flw Thr) и первая стирка показали успешную индукцию ПХД, растворимых бактериальных белков, которые не связывались с никельйной мисиной, и минимальные белки, наблюдаемые во время первой стирки, соответственно. Показано несколько фракций на протяжении второй стирки и элютации. Фракции из второй стирки включены PCD белка, но и отображается обнаруживаемых более высоких молекулярных загрязнительов веса. Фракции из шага elution, как представляется, свободны от загрязняющих веществ. Слева показаны молекулярные веса. С правой стороны показаны mobilities pcaH и pcaG. (C) Агарозгель нуклеаза асссея. Нагрузка столбца сродства никеля, протекать, мыть, и множественные фракции были испытаны для деятельности nuclease. Отрицательный контроль (контроль) является плазмид без добавления белка. Положительный контроль (PCDa) является коммерчески доступным PCD, как известно, загрязнены нуклеаза ДНК. Виды ДНК указаны справа как мелкие фрагменты (SF), суперкоидные (SC), линейные (LN), проислированный круг (NC) и nicked dimer (ND). (D) Количественная оценка различных видов ДНК наблюдается в агарозе гель нуклеазы анализа. Измеряется общий объем пикселей каждой полосы движения. Объем пикселей каждого вида ДНК был определен и выражен в процентах от общего объема пикселей в полосе. Отрицательный контроль составил 81,7% суперcoiled с 14,4% nicked кругов. Положительный контроль показал значительное увеличение на 46,0% происшенных кругов. Нагрузка и прохождение содержали бактериальные нуклеазы, которые преобразовывали плазмид и загрязняющие ДНК бактерий в мелкие фрагменты. Первая стирка на 20 мМ имидазола также, как представляется, содержат значительные активности нуклеаза, в результате чего линейные и nicked круги. Фракции 4-7 от второй стирки на 125 мМ имидазола также отображается значительная активность нуклеаза (в частности, фракции 4 и 5, которые генерируются наблюдаемые линейные плазмиды). Фракции 29-38 от ступени elution оказались более похожими на отрицательный контроль. В этом примере фракции 29-38 были выбраны для комбинирования, концентрирования и дальнейшей очистки SEC. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: SEC очистки PCD. (A) Хроматограмма SEC фракций ПХД после хроматографии сродства никеля. A280 показан синим цветом, а фракции elution показаны. PCD eluted от SEC как один очевидный пик. (B) Представитель SDS-PAGE анализ фракций SEC 33-48. Нагрузка концентрированная PCD после очистки сродства никеля. Фракции 33-48 охватывают видимый пик SEC. Обнаруженных загрязняющих веществ не наблюдалось. (C) Агарозгель нуклеаза асссея. Нагрузка SEC и несколько фракций были протестированы на нуклеайскую активность. Отрицательный контроль (контроль) является плазмид без добавления белка. Положительный контроль (PCDa) является коммерчески доступным PCD, как известно, загрязнены нуклеаза ДНК. Виды ДНК показаны слева как суперкоидные (SC), проислированный круг (NC) и nicked dimer (ND). (D) Количественная оценка различных видов ДНК наблюдается в агарозе гель нуклеазы анализа. Измеряется общий объем пикселей каждой полосы движения. Объем пикселей каждого вида ДНК был определен и выражен в процентах от общего объема пикселей в полосе. Отрицательный контроль был 82,1% supercoiled только с 13,7% nicked кругов. Положительный контроль показал значительное увеличение на 64,8% происшенных кругов. Нагрузка SEC не отображалась без видимой активности нуклеаза из-за разумного выбора фракций из очистки сродства никеля. Аналогичным образом, фракции 33-48 оказались похожими на отрицательный контроль. Например, фракция 36 была 82,5% суперкоидных и 13,2% nicked круг. В этом примере фракции 36 и 37 были выбраны для количественной оценки, замораживания и хранились в морозильной камере -80 градусов для будущего экспериментального использования. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Окисление PCA и нуклеаза деятельности PCD SEC фракций. Окисление PCA было измерено A290. По мере того как PCD окисляло молекулу PCA, A290 уменьшило. Окисление PCA измерялось каждые 20 с на 1 ч. Отрицательный контроль без добавления фракции PCD (синяя линия) не показал никаких изменений в A290, указывая молекула PCA была стабильной. Данные из трех репрезентативных фракций SEC (36 в красном, 33 в оранжевом, 39 в желтом) показывают, что очищенный PCD уменьшил A290, что указывает на окисление PCA. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Системы очистки кислорода обычно включаются в одну молекулу флуоресценции микроскопии, чтобы уменьшить фотоотбеление3,7,8. Эти методы микроскопии часто используются для наблюдения нуклеиновых кислот или белковых взаимодействий с нуклеиновыми кислотами1,13,14. Загрязнение ПСТ нуклеазой может привести к ложным результатам.
Коммерчески доступные OSS, в том числе GODCAT и PCD, были показаны, чтобы включить значительное загрязнение нуклеазы11. Можно приобрести PCD и использовать SEC, чтобы удалить нуклеазы загрязняющих11. Однако после публикации этого метода цена на коммерчески доступные ПХД от одного поставщика возросла в 5 раз. Этот метод генерирует очень активный, нуклеаза бесплатно PCD неоздоровую и может быть выполнена в течение 1 недели. По нашему опыту, количество ПХД, генерируемого культурой 1 л (1-2 мг), достаточно для одного года экспериментов (3 мкг/эксперимент) в продуктивной лаборатории с 2 флуоресцентными системами визуализации.
Эффективность индукции является ключом к успеху этого метода. Если НЕострогореючное PCD не будет эффективно индуцировано и очевидно SDS-PAGE, очистка будет неудачной. Можно попробовать две альтернативные стратегии. Во-первых, попытка индукции из другой колонии на пластине преобразования кишечной палочки. Во-вторых, мы имели предыдущий успех с BL21, но альтернативный штамм кишечной палочки для выражения, такие как BL21 pLysS, может быть опробован. Успех проверки окисления PCA зависит от минимального воздействия субстрата на PCD перед началом проверки. Настоятельно рекомендуется собрать 96 хорошо пластины реакции на льду в холодной комнате и добавить образец белка непосредственно перед загрузкой пластины к читателю.
Хроматография сродства никель может быть достаточно для того чтобы определить фракции чисто ГОК, без загрязняя деятельность nuclease. В этом случае можно исключить очистку SEC. Тем не менее, фракции хроматографии никеля должны быть объединены и диализированы на ночь при 4 градусах По Цельсия в буфере SEC. Глицерол, присутствующий в беговом буфере SEC, имеет важное значение для хранения при -80 градусах Цельсия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH GM121284 и AI126742 в KEY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A.
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
