Summary
I dette manuskript beskrives gennemførelsen af et stimuleret Raman spredning (SRS)-mikroskop, som opnås ved integrationen af en SRS-eksperimentel opsætning med et mikroskop til Laserscanning. SRS-mikroskop er baseret på to at (FS) laser kilder, en ti-safir (ti: SA) og synkroniseret optisk parametrisk oscillator (OPO).
Abstract
Stimuleret Raman spredning (SRS) mikroskopi bruger nær-infrarød excitation lys; Derfor, det deler mange multi-photon mikroskopiske billeddannelse egenskaber. SRS Imaging modalitet kan fås ved hjælp af kommercielle laser-scanning mikroskoper ved at udstyre med en ikke-nedsænket fremad detektor med ordentlig båndpas filtre og lock-in forstærker (Lia) afsløring ordning. Et skematisk layout af et typisk SRS-mikroskop omfatter følgende: to pulserende laserstråler (dvs. pumpen og sonden, der er rettet ind i et scannings mikroskop), som skal overlappes i både rum og tid på billedplanet, og som derefter fokuserer på et mikroskop-mål i prøven gennem to scannings spejle (SMs), som raster brændpunktet på tværs af et x-y-plan. Efter interaktion med prøven opsamles de transmitterede output impulser af en øvre målsætning og måles ved et fremad detekteringssystem indsat i et inverteret mikroskop. Pumpe impulser fjernes af en stak optiske filtre, hvorimod sonde impulserne, der er resultatet af SRS-processen i enhedens brændvidde, måles ved hjælp af en fotodiode (PD). Udlæningen af PD er demodulerede af Lia at udtrække modulations dybden. Der opnås et todimensionalt (2D) billede ved at synkronisere enheden til fremad sporing med mikroskop scanningsenheden. I dette dokument er implementeringen af et SRS-mikroskop beskrevet og med succes demonstreret, samt rapportering af etiket frie billeder af polystyren perler med diametre på 3 μm. Det er værd at bemærke, at SRS mikroskoper ikke er kommercielt tilgængelige, så for at drage fordel af disse egenskaber, den hjemmelavede konstruktion er den eneste mulighed. Da SRS mikroskopi er ved at blive populær i mange områder, det menes, at denne omhyggelige beskrivelse af SRS mikroskop gennemførelse kan være meget nyttigt for det videnskabelige samfund.
Introduction
I Life Science-applikationer er SRS-mikroskopi dukket op som et effektivt værktøj til Label-fri billeddannelse. Den grundlæggende idé om SRS mikroskopi er at kombinere styrken af vibrationelle kontrast og dens evne til at erhverve billeder i et par sekunder.
SRS er en proces, hvor frekvensen forskellen mellem to laserstråler frekvenser (pumpe signal og Stokes signal ved forskellige frekvenser) svarer til den molekylære vibration af en undersøgt prøve, forårsager stimuleret Raman spredning og en signifikant stigning i Stokes signalet. I modsætning til lineær Raman spektroskopi udviser SRS en ikke-lineær afhængighed af de indkommende lysfelter og producerer sammenhængende stråling. SRS har to grundlæggende fordele: 1) hastighed, som gør billeder mindre følsomme over for artefakter som følge af prøve bevægelse eller nedbrydning, og 2) et fremragende signal-støj-forhold (SNR). Derudover udviser SRS et spektrum, der er identisk med den spontane Raman, og SRS-signalet er lineært proportionalt med koncentrationen af den kemiske binding, der er spændt1,2,3,4, 5.
I vores mikroskop er en at (FS) SRS-eksperimentel opsætning integreret med et inverteret optisk mikroskop udstyret med en hurtig spejle scanningsenhed (figur 1)6,7,8. To pulserende laser kilder bruges til at implementere dette mikroskop. Den første er en FS-ti: SA med en puls varighed på ca. 140 FS, gentagelsesfrekvens på 80 MHz og emissions bølgelængder i intervallet 680-1080 nm. Den anden, der anvendes som sonde stråle og pumpet af ti: SA, er en at synkroniseret optisk parametrisk oscillator (Sopo), med en impuls varighed på ca. 200 FS, gentagelseshastighed på 80 MHz, og emissions bølgelængder i intervallet 1000-1600 nm. Det skal bemærkes, at den mindste foton energi forskel mellem ti: SA og SOPO stråle er 2500 cm-1. Derfor, ved hjælp af denne kombination af laser systemer, kun højfrekvens C-H region (2800-3200 cm-1) af Raman Spectra kan udforskes6,7,8.
For at oprette et SRS-mikroskop er der tre afgørende spørgsmål at overveje, som er beskrevet i de efterfølgende afsnit. Den første er gennemførelsen af en højfrekvent modulations overførselsmetode (Se figur 2 og trin 2,1 i protokollen for en beskrivelse). I en SRS eksperimentel undersøgelse, en afgørende parameter er følsomheden af systemet. Et SRS-signal detekteres som en lille ændring i intensiteten af excitation bjælker; Derfor kan det være ødelagt af laser intensitet støj og skudt støj. Dette problem kan løses ved at integrere dette system med en højfrekvens modulations overførselsmetode (Se figur 2 og trin 2,1 i protokollen for detaljer). I denne metode anvendes en elektrooptisk modulator (EOM) til at moduere pumpen. Den modulering, der overføres til sonde strålen, kan derefter detekteres af en PD efter blokering af pumpe strålen med en stak optiske filtre [stimuleret Raman Gain (SRG) detekterings tilstand]. PD-udgangen er forbundet med et lavpasfilter til en lock-in forstærker (LIA), som demodulerer det målte signal. Ved at øge modulens modulationsfrekvens til frekvenser over 1 MHz kan den iboende grænse for PDs opnås.
Det andet spørgsmål at overveje, er installationen af en mekanisk beslag, som tillader at udføre fremadrettet detektion og samtidig at bevare mikroskop observation i brightfield. Desuden skal det reducere støjen på grund af mekaniske vibrationer under genereringen af billeder og for at muliggøre en præcis Repositionering af detekterings systemet (Se figur 3 og trin 2,2 i protokollen).
Det tredje er synkroniseringen af det signal, der er erhvervet af den fase følsomme detekterings ordning, hvor strålen er anbragt på prøven, som overvåges af mikroskopets scannings hoved. For at realisere billeder, SMS kræver tre TTL-signaler, der er stillet til rådighed af mikroskop controller tilsluttet til Scan hovedenhed: pixel ur, linje Sync, og ramme Sync. Synkroniseringen opnås ved at kontrollere ved hjælp af et PCI-kort, de tre TTL-signaler, og erhvervelse af et spændingssignal på udgangs kanalen af Lia6,7,8. En hjemmelavet software er blevet udviklet og beskrevet tidligere6,7,8, mens hardwaren i synkroniserings systemet er rapporteret i figur 4.
En grundlæggende procedure ved udførelse af SRS-afbildning er mikroskop justering. Det er realiseret i løbet af fire trin, som er beskrevet i de efterfølgende afsnit. Den første er den rumlige overlapning af to bjælker (Se trin 3,1 i protokollen). I dette eksperimentelle set-up, de to bjælker var rumligt collinearly kombineret med en koldtlysreflektorlamper spejl. Det indledende skridt er tilpasningen af OPO og ti: SA, så hver når mikroskop. Derefter, overvejer OPO som en referencestråle og drage fordel af en position følsom detektor, ti: SA er rumligt overlappet til OPO.
Det andet afgørende aspekt er den tidsmæssige overlapning af to bjælker (Se trin 3,2 i protokollen). Selv om pumpen og OPO bjælker er perfekt synkroniseret9, da de følger lidt forskellige stråle stier inde i OPO huset, ved OPO exit de har en tidsforsinkelse på omkring 5 ns og rumlig forskel på 5 cm. Derfor kræver ti: SA og OPO, at de bliver gentimet optisk for at sikre tidsmæssig overlapning ved stikprøven. Dette opnås typisk med en fint tunbar optisk forsinkelses linje, som i dette tilfælde indsættes mellem ti: SA og mikroskopet (Se figur 1). For at opnå den tidsmæssige overlapning af to bjælker, anvendes to teknikker. Den første udføres ved hjælp af en hurtig PD og Oscilloscope, mens den anden er baseret på Auto-og tvær optiske korrelationer. Ved hjælp af den første teknik opnås en grov overlapning af to stråler (usikkerhed på 10 PS), mens en nøjagtig tidsmæssig overlapning af to bjælker opnås ved hjælp af en kryds korrelator (opløsning på 1 FS).
Det tredje afgørende aspekt er tilpasningen af de to bjælker i mikroskop (Se trin 3,3 i protokollen). En foreløbig hvid lys observation af prøven gør det muligt at individuere det ønskede synsfelt (FOV). Bagefter justeres laserstråler, der kommer ind i mikroskopet med en side port af mikroskop, for at nå PD monteret på den øverste del (figur 3). Hvis du ønsker en korrekt billed anskaffelse, er det dog nødvendigt at angive et antal parametre (f. eks. pixeldimension og pixel opholdstid). Prøvetagnings frekvensen skal respektere begrænsningen pålagt af Nyquists sætning for at bevare alle oplysninger i et billede, mens integrationstiden for en korrekt korrespondance mellem pixels og SRS-værdi målt i hver pixel er af LIA skal være lig med eller sammenlignelig med pixel opholdstid.
I det sidste trin af mikroskop tilpasningen udføres talrige tests for at optimere den rumlige og tidsmæssige tilpasning (Se trin 3,4 i protokollen). En række transmission images (TI) for både ti: SA og OPO er erhvervet for at optimere rumlig overlapning. I en TI anvendes en enkelt stråle, og den transmitterede stråle intensitet fra prøven måles ved hjælp af en PD. I tilfælde af TI realiseret af OPO, PD udgangssignalet er direkte forbundet til PCI-kort, mens der i tilfælde af TI realiseret af ti: SA, PD udgangssignalet er forbundet til LIA og analog udgang af LIA er forbundet til PCI-kort. Transmissions billederne er meget nyttige til at optimere FOV, belysningen, brændpositionen af mikroskopet mål og til at kontrollere, om de to bjælker er rumligt overlappet6,7,8.
Optimering af pumpen og Probe strålens tidsmæssige overlap opnås ved at scanne forsinkelses linjen med trin på 0,001 mm svarende til en 3,3 FS Time-Shift og udføre en SRS-måling i et enkelt punkt af en polystyren perle prøve 3 μm i diameter. Amplituden på et SRS-Signalmåler værdier fra Lia, som en funktion af sonde-pumpe forsinkelsen, og giver et maksimum svarende til den nøjagtige tidsmæssige overlapning af de to bjælker6,7,8. Før du afslutter, skal det bemærkes, at alle diskuterede trin er obligatoriske for at opnå en høj kvalitet billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opstart af Lasersystemet
- Kontroller, om kølere temperatur holdes på eller under 20 °c.
- Kontrollér, om fugtigheds styringsenheden fungerer korrekt, og at luftfugtigheden opretholdes til en værdi på omkring 40%.
- Tænd for ti: SA laser, strengt følge instruktionerne i manualen.
- Indstil bølgelængden til 810 nm.
- Tænd for OPO og den tilsluttede mini-computer. Kør det program, der styrer OPO-laseren.
- Vælg bypass , hvis 100% af ti: SA laser output er påkrævet ved udgangen af OPO box.
- Fravælg bypass , hvis 20% af ti: SA laser output og OPO laser output er påkrævet ved udgangen af OPO box.
- Åbn udløseren af ti: SA, og frigør ti: SA Beam til OPO-indgangen.
- Slip de to laserstråler ved OPO exit ved at klikke på signal-out og pumpe-out.
- Vent, indtil begge lasere ti: SA og OPO er stabiliseret (ca. 45 – 60 minutter).
- Bekræft stråle stedet ved udgangen af OPO box for både ti: SA og OPO ved hjælp af et papir detektor kort og kontrollere strømmen ved hjælp af en effektmåler.
- Tune OPO laser bølgelængde til 1076 nm.
- Reducer kraften til ~ 10 mW for hver laserstråle for at udføre tilpasningen.
2. opsætning af mikroskopet
-
Implementering af højfrekvens modulations overførselsmetode
- Udfør den optiske justeringsprocedure for modulatoren, således at ti: SA strålen kommer ind og ud uden forvrængning.
- Tænd for funktions generatoren og Generer et TTL-signal (firkantet bølge med amplitude = 5 V, forskydning = 2,5 V, frekvens = 5 MHz).
- Del TTL-signalet op i to dele ved hjælp af et T-kryds. den ene for EOM og den anden for lock-in-forstærkeren (LIA) (Se figur 2).
- Kontrollér alle signal niveauer med et oscilloskop.
- Tænd for LIA og Tilslut generatoren outputkanal til reference kanalen af LIA.
- Tilslut generatoren udgangs kanal til højspændings forstærkeren af EOM.
- Tænd for forstærkeren og Indstil spændingen til næsten det maksimale niveau. Overvåg stråle strømmen ved afgangen fra EOM.
-
Integrering af mekanisk montering for at fastsætte PD og tildele x og y relativ bevægelse
Bemærk: med mikroskopet introduceres et eksternt beslag, udstyret med et mikrometer, der har bevægelseskontrol i x-og y-retninger.- Monter to stadier til rejse oversættelse for at tillade bevægelser langs x-og y-anvisningerne (Se figur 3).
- Fastgør scenen på en Ø 1,5 "post af passende højde.
- Monter PD på et eksternt beslag.
- Maksimer stråle strømmen ved PD, justering af PD-positionerne (x-og y-koordinater) ved hjælp af de mikrometer, der er fastgjort til holderen (Se figur 3).
3. tilpasning af mikroskop
- Geografisk overlap af bjælkerne
Bemærk: i betragtning af OPO Beam som reference og drage fordel af en positions følsom detektor, skal ti: SA overlappes til OPO efterfølgende procedure:- Justér OPO-og ti: SA-laserstrålerne, så de begge når mikroskop.
- Placer laserstråle positions sensorerne i to positioner mellem koldtlysreflektorlamper Mirror 1 og Mirror 6, den første position er placeret tæt på koldtlysreflektorlamper Mirror 1 og den anden er tæt på spejlet 6. For hver position skal du bruge sensorerne til at detektere OPO-strålens x-og y-koordinater (Følg figur 1).
- Kontroller, at x-og y-koordinaterne for ti: SA laserstrålen er den samme OPO i begge positioner af sensorerne. Hvis koordinaterne for ti: SA og OPO i nogle positioner ikke falder sammen, skal du justere hældningen af det tilstødende spejl for at kompensere for forskellen (Følg figur 1).
- Følg samme procedure for at justere ti: SA Beam positioner med hensyn til OPO for stien i mellem M6-M7 (Følg figur 1).
- Tidsmæssig synkronisering af bjælkerne
- Brug af den hurtige fotodiode plus Oscilloscope:
- Stop formering af ti: SA og OPO bjælker og placere en hurtig detektor foran OPO Beam (i mellem M6 og M7).
- Tilslut Trigger signalet fra ti: SA laser boksen med et oscilloskop i Channel 2.
- Tilslut detektor kablet med oscilloskop i kanal 1, og Visualiser den tidsmæssige profil i OPO.
- Registrer tiden (abscissa) målt ved oscilloskopet svarende til dens maksimumværdi, nemlig T1.
- Stop OPO Beam og slip ti: SA Beam.
- Visualiser ti: SA Temporal profil og registrere den tid (abscissa) svarende til dens maksimumværdi, nemlig T2.
- Minimer forskellen mellem T1-T2 ved hjælp af forsinkelses linjen for at overlappe de to bjælker. I vores tilfælde er den mindste målbare forskel 10 PS.
- Fjern hurtig detektoren mellem M6 og M7.
- Brug af autocorrelator:
Bemærk: i det skematiske diagram, der er vist i figur 1, installeres en autocorrelator uden at forstyrre de optiske stier på bjælkerne. Derudover introduceres et ekstra spejl og monteres på en flip-flop Mount (omtalt som FFM/AM) mellem M6 og M7 for at aflede strålen ind i autocorrelatoren.- Vend AM for at dirigere strålen ind i autocorrelatoren.
- Stop ti: SA og slip OPO.
- Indstil skrue afstands justeringsskruen mikrometer på autocorrelatoren til normal position (8,35 mm).
- Tænd for autocorrelator-controlleren, og Start softwareprogrammet på den personlige computer, der styrer det.
- Projicer OPO-strålen fra FFM/AM til indgangs spejlet i autocorrelatoren.
- Kontroller refleksions stedet (ved hjælp af et papir detektor kort) på bjælken i justerings vinduet på autocorrelatoren.
- I tilfælde af No-Beam eller Low-Beam intensitet, justere positionen og retningen af FFM/AM i det optimale omfang, og forsøge at justere input spejlet (monteret på autocorrelator) for at maksimere laser pulssignal. Autocorrelatorsignalet opnås som vist i figur 5a.
- Stop OPO og projektet af ti: SA Beam fra FFM/AM til input spejl i autocorrelator. Gentag trin 3.2.2.6 og 3.2.2.7. Autocorrelatorsignalet opnås som vist i figur 5b.
- Indstil stråle afstands justeringsskruen mikrometer til at krydse positionen (7,30 mm).
- Frigør begge bjælker.
- Scan forsinkelses linjen for at få de to bjælker OPO og ti: SA overlappet. Det tvær korrelatorsignal opnås som vist i figur 6.
- Vend spejlet FFM/AM, så bjælkerne kan nå M7 og scanne hoved af mikroskopet.
- Brug af den hurtige fotodiode plus Oscilloscope:
- Tilpasning af mikroskop
- Udfør hvidt lys mikroskopisk observation:
Bemærk: før mikroskopisk observation skal du sikre, at mikroskopet er korrekt justeret.- Prøven forberedes, som består af en fosfatbufferopløsning, hvor polystyren perler med diametre på 3 μm er spredt. Opløsningen er placeret inde i en sandwich af to glas glider.
- Tænd mikroskop og strømforsyning af hvidt lys. Følg vejledningen for observation under hvidt lys.
- Brug en kondensator til at belyse prøven. Brug mål 60x til at indsamle lys. Placer prøven på scenen. Optimer brændpositionen for målet på 60x mikroskopet.
- Vælg den FOV af interesse. Tag et CCD-billede af prøven (figur 7).
- Sluk for strømforsyningen af hvidt lys.
-
Mikroskop justering med at laserstråler: OPO og ti: SA
- Fjern kondensatoren ved hjælp af Escape -knappen for midlertidigt at trække 60x mikroskop objektiv objektivet tilbage. Bevæg objektiv objektivet 60x mikroskop væk fra den optiske kurve, og drej næsestykket.
- Monter detektoren på den øvre del af mikroskop ved hjælp af den udvendige mekaniske monteringsbeslag. Tilslut detektor udgangen gennem et lavpasfilter på 50 ω til oscilloskop og Overvåg OPO-signalet.
- Tænd for processoren, der styrer scanner hovedet. Projicer OPO-strålen ind i scannerens hoved i mikroskop.
- Kontroller placeringen af strålen inde i mikroskopet, skal du sørge for, at placeringen af strålen er i midten eller i nærheden af midten.
- Kontroller, at positionen af strålen inde i chefen for PD er i midten.
- Maksimer den effekt, som detektoren måler ved hjælp af en x-y-oversætter.
- Skift strålen fra OPO til ti: SA, og kontrollér, at der også opnås et maksimalt signal for titanium-safir laseren. Dette indikerer, at begge bjælker er godt afstemt.
- Færdiggør stråle justeringen, introducerer 60x mikroskopet objektiv objektiv og roterer bagsiden af næsestykket.
- Brug knappen koncentrere på mikroskopet til at genvinde det endelige fokus til mål-objektivet på 60x mikroskop.
- Placer målet med forstørrelse 40x i stedet for kondensatoren uden at røre eller forstyrre prøven.
- Udfør hvidt lys mikroskopisk observation:
- Optimering af rumlige og tidsmæssige synkroniseringer af bjælker
- Tidsmæssig synkronisering
- Indstil kraften i ti: SA og OPO målt før mikroskopet til 30 mW for begge bjælker. Indstil bølgelængden af OPO til en anden værdi med hensyn til den foregående, så pumpen og sonden ikke er i resonans med Vibrationfrekvensen af perlerne.
- Frigør begge bjælker (ti: SA og OPO), så de kommer ind i mikroskopet.
- Kør scannings forsinkelses linjen edb-Oversætter og Optag den målte intensitet med LIA for hver position af forsinkelses linjen. Vent, indtil scanningen af forsinkelses linjen er fuldført. Den opnåede tidsmæssige profil visualiseres i figur 8a.
- Indstil bølgelængden af OPO til 1076 nm igen, så pumpen og sonden er i resonans med Vibrationfrekvensen af perlerne. Gentag trin 3.4.1.3 (den opnåede tidsmæssige profil visualiseres i figur 8b).
- Indstil den opnåede overlapnings stråle position i forsinkelses linjen for at erhverve SRS-billeder.
- Rumlig synkronisering af bjælkerne
Bemærk: transmissions billederne er nyttige til optimering af FOV, belysning og brændposition af mikroskopet mål, og til at kontrollere, om de to bjælker er rumligt overlappet.- Overførsel billede erhvervelse af OPO
- Stop ti: SA Beam og Reducer OPO Power til 8 mW.
- Forbind detektoren med udlæsningen til dataindsamlings kortet.
- Kør dataindsamling program sammen med mikroskop scanning konsol.
- Gem filen, og Behandl dataene for at hente billedet. Det rå billede vises som vist i figur 9a.
- Overførsel billede erhvervelse af ti: SA
- Stop OPO Beam, og Reducer ti: SA-kraften til 2,5 – 4,5 mW.
- Tilslut detektoren med LIA og LIA-udlæsninger med dataindsamlings kortet.
- Gentag trin 3.4.2.1.3 og 3.4.2.1.4. Det rå billede vises som vist i figur 9b.
- Overførsel billede erhvervelse af OPO
- Tidsmæssig synkronisering
4. SRS-billed erhvervelse
Bemærk: en dedikeret algoritme er blevet realiseret for at gemme data. Det understøtter følgende billedformater: 512 px x 512 px og 256 px x 256 px, med anskaffelses tider på 16 s, 8 s, 4 s og 2 s.
- Introducer en stak filtre mellem 40x-målsætningen og PD for at fjerne pumpe pulserne (ti: SA) og kun erhverve Stokes signal (OPO).
- Indstil pumpe signalet til 810 nm med en fokuseret effekt på 8 mW og sonde signalet til 1076 nm med en fokuseret effekt på 8 mW for at undersøge en typisk C-H-binding af polystyren (Raman Shift på 3054 cm− 1).
- Forbind detektoren med LIA og LIA udlæser til dataindsamlings kortet.
- Angiv pixel formatet for billed anskaffelse som pr. behov, og Angiv anskaffelsestid.
- Kør det program, der styrer mikroskop controlleren.
- Kør det dedikerede algoritme program, der fungerer som synkronisering mellem mikroskop controlleren, detekterings systemet og DAQ (Se figur 4).
- Gem matrix filen, når købet er fuldført.
- Importer RAW-datafilen, og Gem billedet i det ønskede format (typisk gemt i. tif-format) ved hjælp af ImageJ-software. Billedet vises i figur 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på SRS-måling (dvs. SRS-måling i et enkelt punkt i prøven) er rapporteret i figur 7. Når bjælkerne ikke er overlappet i tid eller rum, er det opnåede resultat rapporteret i figur 8a. I off-resonans, amplituden af signalet målt af LIA er nul, mens den fase af signalet måles af LIA hopper mellem negative og positive værdier. Der henviser til, at når bjælkerne er overlappet i rummet og flytter forsinkelses linjen i et passende interval, rapporteres de opnåede resultater i figur 8b. Signalet måles af LIA stiger og når sit maksimum, når bjælkerne er perfekt overlappet i tid, mens fasen begynder at opnå en fast værdi i den tid, hvor bjælkerne er overlappet i tide.
De absorptions billeder, der opnås ved hjælp af en enkelt stråle (ti: SA eller OPO) af de samme polystyren perler, er gengivet i figur 9a, b med skala stænger på 6 μm. For at erhverve SRS-billederne er forsinkelses linjen indstillet til positionen opnået i figur 7b, et typisk SRG-billede vises i figur 10 med en skala stang på 6 μm.
Figur 1: skematisk layout af f-SRS-mikroskop systemet. OPO = optisk parametrisk oscillator; Ti: SA = titanium-safir laser; M1-M7 = at bredbånds spejle; FFM/AM = flip-flop spejl/Autocorrelator spejl; DM1, DM2 = koldtlysreflektorlamper spejle; DL = forsinkelses linje; AC = autocorrelator; EOM = elektrooptisk modulator; FG = funktionsgenerator; GM = Galvo spejl; Obj1, Obj2 = mål for mikroskop; PD = fotodiode; DAQ = dataindsamling system; PC = personlig computer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ordning for overførselsmetode med høj frekvens graduering. I den indsatte figur er de to lasere bjælker før interaktion inde i prøven og modificeret sonde på grund af interaktioner mellem sonden og pumpen inde i prøven er repræsenteret. Tiden er repræsenteret i ns. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: gengivelse af fotodiode montering med mekanisk monteringssystem. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk dataindsamlings system. PD = photodiode, LIA = lock-in forstærker, DS = detekteringssystem, MC = mikroskopet kontrol, DAQ = data erhvervelse system, PC = Personal computer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Autocorrelator funktion af OPO (a) og ti: SA (b). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: korrelationsfunktion for OPO og ti: SA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: CCD-billede af polystyren perler.
Figur 8: amplitude og fase af SRS-signal målt ved lås-in-forstærker: off resonans (til venstre) og i resonans (til højre) . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: transmissions billeder af polystyren perler opnået ved OPO (a) og ti: SA (b). Skala bar = 16 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: SRS billede af polystyren perler. Skala bjælke = 12 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SRS mikroskopi har taget label-fri billeddannelse til nye højder, især i undersøgelser af komplekse biologiske strukturer som lipider, som er grundlæggende for celler og cellulære arkitektur. Lipider er involveret i flere fysiologiske veje såsom produktion af biologiske membraner, og de tjener som biosyntetiske prækursorer og signal transducere10. Lipider er pakket ind i specialiserede intracellulære organelles, også kaldet lipid dråber (LDs). Deres diametre varierer fra få titusinder af nanometer til snesevis af mikrometer11,12. LDs ikke kun deltage rigeligt i Adipose-og steroid-producerende celler, men er også til stede i andre cellelinjer. LDs samarbejder i en række fysiologiske processer såsom Lipid opbevaring. De er præsenteret fremtrædende i fælles patologier (f. eks. ændret kolesterol metabolisme)13,14.
Traditionelt er visualisering af lipider opnået ved hjælp af Fluorescens mikroskopi og neutrale lipid-specifikke Dye-mærkede faste celler10. Det skal bemærkes, at som lipider er mindre størrelse i forhold til proteiner og DNA, strukturelle og funktionelle ændringer og uønskede artefakter kan forekomme, når du tilføjer fluorophores15,16. SRS har vist sig at være stærk til at studere lipid-rige strukturer. Lipider er rigelige i C-H2 grupper. Derfor giver de relativt isolerede toppe forbundet med C-H-obligations vibrationsmæssige tilstande på 2845 cm-1 i deres Raman Spectra en unik signatur for lipider inde i en celle. Desværre, da de differentiable vibrationelle signaturer er begrænsede, er det temmelig vanskeligt at skelne et mål biomolekyle fra de andre beslægtede arter inde celler, der deler lignende kemiske obligationer. Det er dog muligt at tilføje bittesmå Raman-aktive vibrationelle sonder (f. eks. Alkyner og stabile isotoper) for at opnå specificitet for billeddannelse af små biomolekyler17.
For biologiske og biomedicinske in vivo-anvendelser er det nødvendigt samtidig at kortlægge forskellige kemiske arter i en given prøve for at investere samdistribution og dynamiske korrelationer mellem par af biomolekyler18,19. Derfor er der gjort mange anstrengelser for at opnå flere kemiske kontraster. I den enkleste mulighed for flerfarvet billeddannelse, til billede forskellige Raman-tilstande af en prøve, er frekvensen af pumpe strålen eller Stokes Beam indstillet i sekventielle scanninger18. Men ved hjælp af bølgelængde tuning tilgang kan forårsage tab af co-lokalisering oplysninger af forskellige Raman modes, især når prøven er i et dynamisk miljø18.
Som en konsekvens af ikke-lineær excitation tilbyder SRS iboende 3D-løsningsmuligheder af den valgte kemiske binding inden for biologiske prøver20. Volumen rekonstruktion af den valgte kemiske obligation og dens rumlige distributioner kan simpelthen opnås ved at indsamle SRS-billeder på forskellige brændplan langs z-aksen. Da billederne er erhvervet med høje rumlige og tidsmæssige resolutioner, andre stykker af vigtige oplysninger (dvs., 3D-struktur, kemiske sammensætning, etc.) om den biologiske prøve kan opnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi sætter pris på V. Tufano fra IMM CNR for hans værdifulde tekniske assistance og Giacomo Cozzi, produktspecialist fra Nikon Instruments, for nyttige diskussioner og kontinuerlig support. Dette arbejde blev delvis støttet af italienske nationale operative programmer PONa3 00025 (BIOforIU) og af euro-bioimaging storstilet paneuropæisk forskningsinfrastruktur projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
