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Engineering

Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59614
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

Summary

En este manuscrito, se describe la implementación de un microscopio de dispersión Raman (SRS) estimulado, obtenido mediante la integración de una configuración experimental SRS con un microscopio de escaneo láser. El microscopio SRS se basa en dos fuentes láser de femtosegundo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) y un oscilador paramétrico óptico sincronizado (OPO).

Abstract

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) utiliza luz de excitación infrarroja cercana; por lo tanto, comparte muchas propiedades de imágenes microscópicas multifono. La modalidad de imagen SRS se puede obtener utilizando microscopios comerciales de exploración láser equipando con un detector de avance no desescaneado con filtros de paso de banda adecuados y un esquema de detección de amplificador de bloqueo (LIA). Un diseño esquemático de un microscopio SRS típico incluye lo siguiente: dos rayos láser pulsados, (es decir, la bomba y la sonda dirigidas en un microscopio de escaneo), que deben superponerse tanto en el espacio como en el tiempo en el plano de la imagen, y luego enfocarse mediante un objetivo de microscopio la muestra a través de dos espejos de exploración (SM), que rasterizan el punto focal a través de un plano x-y. Después de la interacción con la muestra, los pulsos de salida transmitidos son recogidos por un objetivo superior y medidos por un sistema de detección hacia adelante insertado en un microscopio invertido. Los pulsos de la bomba se eliminan mediante una pila de filtros ópticos, mientras que los pulsos de la sonda que son el resultado del proceso SRS que se produce en el volumen focal de la muestra se miden mediante un fotodiodo (PD). La lectura de los datos sobre el rendimiento es demodulada por la LIA para extraer la profundidad de modulación. Se obtiene una imagen bidimensional (2D) sincronizando la unidad de detección directa con la unidad de escaneo del microscopio. En este artículo, se describe y demuestra con éxito la implementación de un microscopio SRS, así como la notificación de imágenes sin etiquetas de perlas de poliestireno con diámetros de 3 m. Vale la pena señalar que los microscopios SRS no están disponibles comercialmente, por lo que para aprovechar estas características, la construcción casera es la única opción. Dado que la microscopía SRS se está volviendo popular en muchos campos, se cree que esta descripción cuidadosa de la implementación del microscopio SRS puede ser muy útil para la comunidad científica.

Introduction

En aplicaciones de ciencias de la vida, la microscopía SRS ha surgido como una poderosa herramienta para la creación de imágenes sin etiquetas. La idea básica de la microscopía SRS es combinar la fuerza del contraste vibratorio y su capacidad para adquirir imágenes en pocos segundos.

SRS es un proceso en el que la diferencia de frecuencia entre dos frecuencias de rayos láser (señal de bomba y señal de estoculas a diferentes frecuencias) coincide con la vibración molecular de una muestra investigada, causando dispersión de Raman estimulada y una dispersión significativa de Raman y una dispersión significativa aumento de la señal Stokes. A diferencia de la espectroscopia lineal de Raman, SRS exhibe una dependencia no lineal de los campos de luz entrantes y produce radiación coherente. SRS tiene dos ventajas fundamentales: 1) velocidad, lo que hace que las imágenes sean menos sensibles a los artefactos derivados del movimiento o degradación de la muestra, y 2) una excelente relación señal-ruido (SNR). Además, SRS exhibe un espectro idéntico al Raman espontáneo, y la señal SRS es linealmente proporcional a la concentración del enlace químico excitado1,2,3,4, 5.

En nuestro microscopio, una configuración experimental femtosegundo (fs) SRS se integra con un microscopio óptico invertido equipado con una unidad de escaneo de espejos rápidos (Figura 1)6,7,8. Se utilizan dos fuentes láser pulsadas para implementar este microscopio. El primero es un fs-Ti:Sa con una duración de pulso de aproximadamente 140 fs, tasa de repetición de 80 MHz, y longitudes de onda de emisión en el rango de 680-1080 nm. El segundo, utilizado como haz de sonda y bombeado por Ti:Sa, es un oscilador paramétrico óptico sincronizado femtosegundo (SOPO), con una duración de pulso de aproximadamente 200 fs, tasa de repetición de 80 MHz y longitudes de onda de emisión en el rango de 1000-1600 nm. Cabe señalar que la diferencia mínima de energía fotónica entre el haz Ti:Sa y SOPO es de 2500 cm-1. Por lo tanto, utilizando esta combinación de sistemas láser, sólo la región C-H de alta frecuencia (2800-3200 cm-1) de espectros Raman se puede explorar6,7,8.

Con el fin de crear un microscopio SRS, hay tres cuestiones cruciales a considerar, que se describen en los párrafos sucesivos. El primero es la implementación de un método de transferencia de modulación de alta frecuencia (véase el cuadro 2 y el paso 2.1 del protocolo para una descripción). En una investigación experimental SRS, un parámetro crucial es la sensibilidad del sistema. Una señal SRS se detecta como un pequeño cambio en la intensidad de los haces de excitación; por lo tanto, puede ser corrompido por el ruido de intensidad del láser y el ruido de disparo. Este problema se puede superar integrando este sistema con un método de transferencia de modulación de alta frecuencia (véase el cuadro 2 y el paso 2.1 del protocolo para más detalles). En este método, se utiliza un modulador electroóptico (EOM) para modular la bomba. La modulación transferida al haz de la sonda puede ser detectada por un PD después de bloquear el haz de la bomba con una pila de filtros ópticos [modo de detección de ganancia Raman estimulada (SRG)]. La salida PD está conectada por un filtro de paso bajo a un amplificador de bloqueo (LIA), que demodula la señal medida. Al aumentar la frecuencia de modulación del haz a frecuencias superiores a 1 MHz, se puede obtener el límite intrínseco de los PD.

La segunda cuestión a considerar es la instalación de un soporte mecánico que permite llevar a cabo la detección hacia adelante y al mismo tiempo para preservar la observación del microscopio en el campo brillante. Además, tiene que reducir el ruido debido a la vibración mecánica durante la generación de imágenes y permitir el reposicionamiento preciso del sistema de detección (ver Figura 3 y paso 2.2 del protocolo).

La tercera es la sincronización de la señal adquirida por el esquema de detección sensible a la fase, con el haz colocado en la muestra monitoreado por el cabezal de exploración del microscopio. Para realizar imágenes, los SM requieren tres señales TTL que están disponibles por el controlador del microscopio conectado a la unidad principal de escaneo: reloj de píxeles, sincronización de línea y sincronización de fotogramas. La sincronización se logra mediante el control mediante una tarjeta PCI, las tres señales TTLy la adquisición de una señal de tensión en el canal de salida de LIA 6,7,8. Un software casero ha sido desarrollado y descrito previamente6,7,8, mientras que el hardware del sistema de sincronización se informa en la Figura 4.

Un procedimiento fundamental al llevar a cabo imágenes SRS es la alineación del microscopio. Se realiza en el transcurso de cuatro pasos, que se describen en los párrafos sucesivos. La primera es la superposición espacial de dos haces (véase el paso 3.1 del protocolo). En esta configuración experimental, las dos vigas fueron colinealmente combinadas espacialmente por un espejo dicroico. El paso preliminar es la alineación de OPO y Ti:Sa para que cada uno llegue al microscopio. A continuación, considerando oPO como un haz de referencia y aprovechando un detector sensible a la posición, el Ti:Sa se superpone espacialmente a OPO.

El segundo aspecto crucial es la superposición temporal de dos haces (véase el paso 3.2 del protocolo). Incluso si la bomba y los haces OPO están perfectamente sincronizados9,ya que siguen caminos de haz ligeramente diferentes dentro de la carcasa de OPO, en la salida de OPO tienen un retraso de tiempo de aproximadamente 5 ns y diferencia espacial de 5 cm. Por lo tanto, Ti:Sa y OPO requieren ser re-cronometrados ópticamente para asegurar la superposición temporal en la muestra. Esto se logra típicamente con una línea de retardo óptica finamente ajustable, que en este caso se inserta entre el Ti:Sa y el microscopio (véase la figura 1). Para obtener la superposición temporal de dos vigas, se utilizan dos técnicas. El primero se lleva a cabo utilizando un PD rápido y un osciloscopio, mientras que el segundo se basa en correlaciones auto ópticas y cruzadas. Utilizando la primera técnica, se obtiene una superposición aproximada de dos vigas (incertidumbre de 10 ps), mientras que una superposición temporal precisa de dos vigas se obtiene utilizando un correlator cruzado (resolución de 1 fs).

El tercer aspecto crucial es la alineación de las dos vigas dentro del microscopio (ver paso 3.3 del protocolo). Una observación preliminar de la luz blanca de la muestra permite individuate el campo de visión deseado (FOV). Después, los rayos láser, que entran en el microscopio por un puerto lateral del microscopio, se alinean para alcanzar el PD montado en la parte superior (Figura3). Sin embargo, para una adquisición correcta de la imagen, es necesario establecer una serie de parámetros (por ejemplo, la dimensión de píxel y el tiempo de permanencia del píxel). La frecuencia de muestreo debe respetar la restricción impuesta por el teorema de Nyquist para preservar toda la información de una imagen, mientras que para una correspondencia correcta entre las coordenadas espaciales de píxeles y el valor SRS medido en cada píxel, el tiempo de integración de LIA debe ser igual o comparable al tiempo de permanencia del píxel.

En el paso final de la alineación del microscopio, se llevan a cabo numerosas pruebas para optimizar la alineación espacial y temporal (ver paso 3.4 del protocolo). Se adquieren varias imágenes de transmisión (TI) para Ti:Sa y OPO para optimizar la superposición espacial. En una TI, se utiliza un solo haz, y la intensidad del haz transmitido de la muestra se mide mediante un PD. En el caso de TI realizado por OPO, la señal de salida PD está conectada directamente a la tarjeta PCI, mientras que en el caso de TI realizada por Ti:Sa, la señal de salida PD está conectada a LIA y la salida analógica de LIA está conectada a la tarjeta PCI. Las imágenes de transmisión son muy útiles para optimizar el FOV, la iluminación, la posición focal de los objetivos del microscopio y para comprobar si los dos haces están superpuestos espacialmente6,7,8.

La optimización de la superposición temporal de la bomba y del haz de la sonda se obtiene escaneando la línea de retardo con pasos de 0,001 mm correspondientes a un cambio de tiempo de 3,3 fs y realizando una medición SRS en un único punto de una muestra de perlas de poliestireno de 3 m de diámetro. La amplitud de una señal SRS mide los valores de LIA, en función del retardo de la sonda-bomba, y proporciona un máximo correspondiente a la superposición temporal exacta de los dos haces6,7,8. Antes de concluir, cabe señalar que todos los pasos discutidos son obligatorios para obtener una imagen de alta calidad.

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Protocol

1. Puesta en marcha del sistema láser

  1. Compruebe si la temperatura de los enfriadores se mantiene a o por debajo de 20 oC.
  2. Compruebe si la unidad de control de humedad funciona correctamente y la humedad se mantiene en un valor de alrededor del 40%.
  3. Encienda el láser Ti:Sa, siguiendo estrictamente las instrucciones del manual.
  4. Establezca la longitud de onda en 810 nm.
  5. Encienda la OPO y el miniordenador conectado. Ejecute la aplicación que controla el láser de OPO.
  6. Seleccione bypass si se requiere el 100% de la salida láser Ti:Sa a la salida del cuadro OPO.
  7. Anule la selección de bypass si se requiere el 20% de la salida láser Ti:Sa y la salida láser OPO a la salida de la caja OPO.
  8. Abra el obturador de Ti:Sa y suelte el haz Ti:Sa a la entrada OPO.
  9. Suelte los dos rayos láser en la salida de OPO haciendo clic en señal-out y pump-out.
  10. Espere hasta que ambos láseres Ti:Sa y OPO estén estabilizados (alrededor de 45-60 min).
  11. Verifique el punto de viga a la salida de la casilla OPO para Ti:Sa y OPO utilizando una tarjeta detectora de papel y compruebe la alimentación utilizando un medidor de potencia.
  12. Sintonice la longitud de onda láser OPO a 1076 nm.
  13. Reduzca la potencia a 10 mW para que cada rayo láser realice la alineación.

2. Configuración del microscopio

  1. Implementación del método de transferencia de modulación de alta frecuencia
    1. Lleve a cabo el procedimiento de alineación óptica del modulador de tal forma que el haz Ti:Sa entre y salga sin ninguna distorsión.
    2. Encienda el generador de funciones y genere una señal TTL (onda cuadrada con amplitud de 5 V, desplazamiento a 2,5 V, frecuencia a 5 MHz).
    3. Divida la señal TTL en dos partes utilizando una unión T; uno para EOM y el otro para el amplificador de bloqueo (LIA) (véase la figura2).
    4. Compruebe todos los niveles de señal con un osciloscopio.
    5. Encienda el LIA y conecte el canal de salida del generador al canal de referencia del LIA.
    6. Conecte el canal de salida del generador al amplificador de potencia de alta tensión de EOM.
    7. Encienda el amplificador y ajuste la tensión a casi el nivel máximo. Supervise la potencia del haz a la salida de la EOM.
  2. Integración del montaje mecánico para fijar PD y asignar movimiento relativo x e y
    NOTA: Con el microscopio, se introduce un soporte externo, equipado con un micrómetro que tiene control de movimiento en direcciones x e y.
    1. Monte dos etapas de traducción de viaje para permitir movimientos a lo largo de las direcciones x e y (consulte la figura 3).
    2. Fije el escenario en un poste de 1,5" de altura apropiada.
    3. Monte el PD en un soporte externo.
    4. Maximice la potencia del haz en PD, ajustando las posiciones de PD (coordenadas x e y) utilizando los micrómetros conectados al soporte (consulte la figura 3).

3. Alineación del microscopio

  1. Superposición espacial de las vigas
    NOTA: Teniendo en cuenta el haz oPO como una referencia y aprovechando un detector sensible a la posición, el Ti:Sa debe superponerse a OPO de acuerdo con el siguiente procedimiento:
    1. Alinee la OPO y los rayos láser Ti:Sa para que ambos lleguen al microscopio.
    2. Coloque los detectores de sensores de posición de haz láser en dos posiciones entre el espejo dicroico 1 y el espejo 6, la primera posición se encuentra cerca del espejo dicroico 1 y la segunda está cerca del espejo 6. Para cada posición, utilice los sensores para detectar las coordenadas x e y del haz OPO (siga la Figura 1).
    3. Verifique que las coordenadas x e y del rayo láser Ti:Sa sean la misma OPO en ambas posiciones de los detectores de sensores. Si en algunas posiciones las coordenadas de Ti:Sa y OPO no coinciden, ajuste la inclinación del espejo adyacente para compensar la diferencia (siga la Figura 1).
    4. Siga el mismo procedimiento para alinear las posiciones de la viga Ti:Sa con respecto a OPO para la ruta entre M6-M7 (siga la figura 1).
  2. Sincronización temporal de los haces
    1. Uso del fotodiodo rápido más osciloscopio:
      1. Detenga la propagación de los haces Ti:Sa y OPO y coloque un detector rápido delante del haz OPO (entre M6 y M7).
      2. Conecte la señal de disparo proporcionada por la caja láser Ti:Sa con un osciloscopio en el canal 2.
      3. Conecte el cable detector con el osciloscopio en el canal 1 y visualice el perfil temporal de OPO.
      4. Registre el tiempo (abscisa) medido por el osciloscopio correspondiente a su valor máximo, a saber, t1.
      5. Detenga la viga OPO y suelte la viga Ti:Sa.
      6. Visualice el perfil temporal Ti:Sa y registre la hora (abscisa) correspondiente a su valor máximo, a saber, t2.
      7. Minimice la diferencia entre t1-t2 utilizando la línea de retardo para superponer las dos vigas. En nuestro caso, la diferencia medible mínima es de 10 ps.
      8. Retire el detector rápido entre M6 y M7.
    2. Uso del autocorrerelator:
      NOTA: En el diagrama esquemático que se muestra en la Figura 1, se instala un autocorrelator sin interferir con las trayectorias ópticas de las vigas. Además, se introduce un espejo adicional y se monta en un soporte flip-flop (denominado FFM/AM) entre M6 y M7 para desviar la viga hacia el autocorrelator.
      1. Gire el AM para dirigir la viga hacia el autocorrelator.
      2. Detenga el Ti:Sa y suelte la OPO.
      3. Ajuste el micrómetro de tornillo de ajuste de distancia de haz del autocorrelator a la posición Normal (8,35 mm).
      4. Encienda el controlador de autocorrelator e inicie la aplicación de software en el ordenador personal que lo controla.
      5. Proyecte el haz OPO desde FFM/AM hasta el espejo de entrada en el autocorrerelator.
      6. Controle el punto de reflexión (utilizando una tarjeta detectora de papel) de la viga en la ventana de alineación del autocorrelator.
      7. En el caso de la intensidad de haz sin haz o de haz bajo, ajuste la posición y la orientación de FFM/AM a la medida óptima, e intente ajustar el espejo de entrada (montado en el autocorrelator) para maximizar la señal de pulso láser. La señal autocorrelator se obtiene como se muestra en la Figura 5a.
      8. Detenga la OPO y el proyecto del haz Ti:Sa desde FFM/AM para introducir el espejo en el autocorrelator. Repita los pasos 3.2.2.6 y 3.2.2.7. La señal autocorrelator se obtiene como se muestra en la Figura 5b.
      9. Ajuste el micrómetro de ajuste de distancia de haz a Posición transversal (7,30 mm).
      10. Suelte ambas vigas.
      11. Escanee la línea de retardo para obtener las dos vigas OPO y Ti:Sa superpuestas. La señal de corredor cruzado se obtiene como se muestra en la Figura6.
      12. Gire el espejo FFM/AM para que las vigas puedan alcanzar M7 y escanear la cabeza del microscopio.
  3. Alineación del microscopio
    1. Realizar observación microscópica de luz blanca:
      NOTA: Antes de la observación microscópica, asegúrese de que el microscopio esté correctamente alineado.
      1. Preparar la muestra de ensayo, que consiste en una solución tampón de fosfato en la que se dispersan las perlas de poliestireno con diámetros de 3 m. La solución se coloca dentro de un sándwich de dos diapositivas de vidrio.
      2. Encienda el microscopio y la fuente de alimentación de la luz blanca. Siga el manual para observación bajo luz blanca.
      3. Utilice un condensador para iluminar la muestra. Utilice el objetivo de 60x para recoger la luz. Coloque la muestra en el escenario. Optimice la posición focal del objetivo del microscopio 60x.
      4. Seleccione el FOV de interés. Tome una imagen CCD de la muestra (Figura7).
      5. Apague la fuente de alimentación de la luz blanca.
    2. Alineación del microscopio con rayos láser de femtosegundo: OPO y Ti:Sa
      1. Retire el condensador con el botón de escape para retirar temporalmente la lente objetivo del microscopio 60x. Mueva la lente objetivo del microscopio 60x fuera de la trayectoria óptica, girando la boquilla.
      2. Monte el detector en la parte superior del microscopio utilizando el soporte mecánico externo. Conecte la salida del detector a través de un filtro de paso bajo de 50o al osciloscopio y supervise la señal OPO.
      3. Encienda el procesador que controla el cabezal del escáner. Proyecte el haz OPO en la cabeza del escáner del microscopio.
      4. Compruebe la posición de la viga dentro del microscopio, asegúrese de que la ubicación de la viga está en el centro o cerca del centro.
      5. Compruebe que la posición de la viga dentro de la cabeza de PD está en el centro.
      6. Maximice la potencia medida por el detector utilizando un traductor x-y.
      7. Cambie el haz de OPO a Ti:Sa y compruebe que también se obtiene una señal máxima para el láser de titanio zafiro. THis indica que ambas vigas están bien alineadas.
      8. Finalice la alineación del haz, introduciendo la lente objetivo del microscopio 60x y girando hacia atrás la boquilla.
      9. Utilice el botón de reenfoque del microscopio para recuperar el enfoque finalizado de la lente objetivo del microscopio 60x.
      10. Coloque el objetivo con aumento 40x en lugar del condensador sin tocar ni perturbar la muestra.
  4. Optimización de las sincronizaciones espaciales y temporales de vigas
    1. Sincronización temporal
      1. Ajuste la potencia de Ti:Sa y OPO medida antes del microscopio a 30 mW para ambos haces. Ajuste la longitud de onda de OPO a un valor diferente con respecto al anterior para que la bomba y la sonda no estén en resonancia con la frecuencia vibratoria de las perlas.
      2. Suelte ambos haces (Ti:Sa y OPO) para que entren en el microscopio.
      3. Ejecute el traductor computarizado de la línea de retardo de escaneo y registre la intensidad medida por LIA para cada posición de la línea de retardo. Espere hasta que se complete el escaneo de la línea de retardo. El perfil temporal obtenido se visualiza en la Figura 8a.
      4. Ajuste la longitud de onda de OPO a 1076 nm de nuevo para que la bomba y la sonda estén en resonancia con la frecuencia vibratoria de las perlas. Repita el paso 3.4.1.3 (el perfil temporal obtenido se visualiza en la Figura 8b).
      5. Establezca la posición del haz de solapamiento obtenida en la línea de retardo para adquirir imágenes SRS.
    2. Sincronización espacial de los haces
      NOTA: Las imágenes de transmisión son útiles para optimizar el FOV, la iluminación y la posición focal de los objetivos del microscopio, y para comprobar si los dos haces están superpuestos espacialmente.
      1. Adquisición de imágenes de transmisión de OPO
        1. Detenga el haz Ti:Sa y reduzca la potencia de OPO a 8 mW.
        2. Conecte la lectura del detector a la tarjeta de adquisición de datos.
        3. Ejecute el programa de adquisición de datos junto con la consola de exploración del microscopio.
        4. Guarde el archivo y procese los datos para obtener la imagen. La imagen sin procesar aparece tal y como se muestra en de la figura 9a.
      2. Adquisición de imágenes de transmisión de Ti:Sa
        1. Detenga el haz OPO y reduzca la potencia de Ti:Sa a 2,5–4,5 mW.
        2. Conecte el detector con las lecturas de LIA y LIA con la tarjeta de adquisición de datos.
        3. Repita los pasos 3.4.2.1.3 y 3.4.2.1.4. La imagen sin procesar aparece tal y como se muestra en de la figura 9b.

4. Adquisición de imágenes SRS

NOTA: Se ha realizado un algoritmo dedicado para almacenar datos. Soporta los siguientes formatos de imagen: 512 px x 512 px y 256 px x 256 px, con tiempos de adquisición de 16 s, 8 s, 4 s y 2 s.

  1. Introducir una pila de filtros entre el objetivo 40x y PD para eliminar los pulsos de la bomba (Ti:Sa) y adquirir sólo la señal Stokes (OPO).
  2. Ajuste la señal de la bomba a 810 nm con una potencia enfocada de 8 mW y la señal de sonda a 1076 nm con una potencia enfocada de 8 mW para investigar un enlace C-H típico de poliestireno (desplazamiento de Raman de 3054 cmx 1).
  3. Conecte el detector con la lectura de LIA y LIA a la tarjeta de adquisición de datos.
  4. Establezca el formato de píxel de adquisición de imagen según el requisito y establezca el tiempo de adquisición.
  5. Ejecute el programa que controla el controlador del microscopio.
  6. Ejecute el programa de algoritmo dedicado que actúa como sincronización entre el controlador del microscopio, el sistema de detección y DAQ (consulte la figura 4).
  7. Guarde el archivo de matriz una vez completada la adquisición.
  8. Importe el archivo de datos sin procesar y guarde la imagen en el formato requerido (normalmente guardado en formato .tif) utilizando el software ImageJ. La imagen se muestra en el cuadro 10.

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Representative Results

En la Figura 7se indica un ejemplo de medición SRS (es decir, medición SRS en un único punto de la muestra). Cuando las vigas no se superponen en el tiempo o el espacio, el resultado obtenido se indica en la Figura 8a. En la baja resonancia, la amplitud de la señal medida por LIA es cero, mientras que la fase de la señal medida por LIA salta entre los valores negativos y positivos. Mientras que, cuando las vigas se superponen en el espacio, moviendo la línea de retardo en un rango apropiado, los resultados obtenidos se indican en la Figura 8b. La señal medida por LIA aumenta y alcanza su máximo cuando los haces están perfectamente superpuestos en el tiempo, mientras que la fase comienza a alcanzar un valor fijo durante el tiempo en el que los haces se superponen en el tiempo.

Las imágenes de absorción obtenidas utilizando un solo haz (Ti:Sa u OPO) de las mismas perlas de poliestireno se representan en la Figura 9a, b con barras de escala de 6 m. Para adquirir las imágenes SRS, la línea de retardo se fija a la posición alcanzada en el cuadro 7b,una imagen típica SRG se muestra en la figura 10 con una barra de escala de 6 m.

Figure 1
Figura 1: Diseño esquemático del sistema de microscopio f-SRS. OPO - oscilador paramétrico óptico; Ti:Sa - Láser de titanio-zafiro; M1-M7o espejos de banda ancha femtosegundo; FFM/AM - Espejo Flip-Flop / Espejo Autocorrelator;  DM1, DM2 - espejos dicrhídricos; DL - Línea de retardo; AC - autocorrelator ; EOM - modulador electro-óptico; FG - generador de funciones; GM - Espejo Galvo; Obj1, Obj2 - objetivos del microscopio; PD - fotodiodo; DAQ - sistema de adquisición de datos; PC: ordenador personal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema del método de transferencia de modulación de alta frecuencia. En la figura de inserción, se representan los dos haces láser antes de la interacción dentro de la muestra y la sonda modificada debido a las interacciones de la sonda y la bomba dentro de la muestra. El tiempo se representa en ns. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Representación del montaje de fotodiodo con sistema de montaje mecánico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Esquema del sistema de adquisición de datos. PD - fotodiodo, LIA - amplificador de bloqueo, DS - sistema de detección, MC - control de microscopio, sistema de adquisición de datos DAQ, PC - ordenador personal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Función de autocorrelador de OPO (a) y Ti:SA (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Función de correlación cruzada de OPO y Ti:Sa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 7: Imagen CCD de perlas de poliestireno.

Figure 7
Figura 8: Amplitud y fase de la señal SRS medida por amplificador de bloqueo: resonancia de salida (a la izquierda) y en resonancia (a la derecha) . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Imágenes de transmisión de cuentas de poliestireno logradas por OPO (a) y Ti:Sa (b). Barra de escala de 16 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Imagen SRS de perlas de poliestireno. Barra de escala a 12 m.

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Discussion

La microscopía SRS ha llevado la imagen sin etiquetas a nuevas alturas, especialmente en estudios de estructuras biológicas complejas como los lípidos, que son fundamentales para las células y la arquitectura celular. Los lípidos están involucrados en múltiples vías fisiológicas como la producción de membranas biológicas, y sirven como precursores biosintéticos y transductores de señal10. Los lípidos se envasan en orgánulos intracelulares especializados, también llamados gotas de lípidos (LD). Sus diámetros varían de pocas decenas de nanómetros a decenas de micrómetros11,12. Los D.M. no sólo participan abundantemente en las células productoras de adiposo y esteroides, sino que también están presentes en otras líneas celulares. Los LU cooperan en varios procesos fisiológicos como el almacenamiento de lípidos. Se presentan prominentemente en patologías comunes (por ejemplo, metabolismo alterado del colesterol)13,14.

Tradicionalmente, la visualización de lípidos se logra mediante microscopía de fluorescencia y células fijas con etiqueta de tinte específica sódica10. Cabe señalar que como los lípidos son de menor tamaño en comparación con las proteínas y el ADN, cambios estructurales y funcionales y artefactos no deseados pueden ocurrir al agregar fluoróforos15,16. SRS ha demostrado ser potente para el estudio de estructuras ricas en lípidos. Los lípidos son abundantes en los grupos C-H 2. Por lo tanto, los picos relativamente aislados asociados con los estados vibratorios de unión C-H en 2845 cm-1 en sus espectros Raman proporcionan una firma única para los lípidos dentro de una célula. Desafortunadamente, dado que las firmas vibratorias diferenciables son finitas, es bastante difícil distinguir una biomolécula objetivo de las otras especies relacionadas dentro de las células que comparten enlaces químicos similares. Sin embargo, es posible añadir pequeñas sondas vibratorias Raman-activas (por ejemplo, alquilanos e isótopos estables) para obtener especificidad para la toma de imágenes de pequeñas biomoléculas17.

Para las aplicaciones biológicas y biomédicas in vivo, el mapeo simultáneo de diversas especies químicas en una muestra dada es necesario para invertir la cordistribución y correlaciones dinámicas entre pares de biomoléculas18,19. Por lo tanto, se han hecho muchos esfuerzos para obtener múltiples contrastes químicos. En la opción más simple de imágenes multicolor, para crear imágenes de diferentes modos Raman de una muestra, la frecuencia del haz de la bomba o del haz Stokes se sintoniza nalen en los escaneos secuenciales18. Sin embargo, el uso del enfoque de ajuste de longitud de onda puede causar la pérdida de información de colocalización de diferentes modos de Raman, especialmente cuando la muestra está en un entorno dinámico18.

Como consecuencia de la excitación no lineal, SRS ofrece capacidades intrínsecas de resolución 3D del enlace químico seleccionado dentro de muestras biológicas20. La reconstrucción del volumen del enlace químico seleccionado y sus distribuciones espaciales se puede lograr simplemente mediante la recopilación de imágenes SRS en diferentes planos focales a lo largo del eje z. Dado que las imágenes se adquieren con altas resoluciones espaciales y temporales, se pueden obtener otras piezas de información clave (es decir, estructura 3D, composición química, etc.) sobre la muestra biológica.

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a V. Tufano de IMM CNR por su valiosa asistencia técnica y a Giacomo Cozzi, especialista en productos de Nikon Instruments, por sus útiles debates y soporte continuo. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Programas Operativos Nacionales Italianos PONa3 00025 (BIOforIU) y por el proyecto de infraestructura de investigación paneuropea Euro-Bioimaging a gran escala.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisation tool Nikon Nikon C2Tool Acquisation supported tool
APE Pulse link control software APE- APE Pulse link control software software control
Autocorrelator APE APE PulseCheck USB 50 Autocorrelator
Detector Thorlabs Thorlabs DET10A Photodiode
Detector card Thorlabs Thorlabs VRC IR detector Card
Dichroic mirror Semrock Semrock FF875-Di01-25X36 Dichroic mirror
Dichroic mirror Semrock FF875-Di01-25x36 Dichroic mirror
EOM Conoptics (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). Pockels cell
Fast detector Thorlabs Thorlabs DET025AL/M Photodiode
Fast mirror scanning unit Nikon C2 Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA Coherent Coherent Chameleon Ultra II Chameleon Ultra II
Function generator TTi TG5011 AIM – TTi Function generator
Inverted optical microscope Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier Standford Research System SR844-200 MHz dual phase A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter, Semrock NF03-808E-25 Notch filter
Optical delay line Newport Newport M-ILS200CC Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator Coherent Coherent Compact OPO Coherent Compact OPO
Oscilloscope WaveRunner 640Zi 4GHz OSC/LeCroy Digital Oscilloscope
PCI Card National instrument NI PCIe 6363 Data acquisation card
Position Sensors Detectors Newport Newport Conex PSD9 Position detector sensor
Power meter head Coherent PowerMax PM10, Laser power detector
Translation Stages Thorlabs Thorlabs PT1/M Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

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References

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Implementación de un microscopio no lineal basado en la dispersión estimulada de Raman
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Ranjan, R., Indolfi, M., Ferrara, M. A., Sirleto, L. Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59614, doi:10.3791/59614 (2019).

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