Engineering

יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59614

Rajeev Ranjan¹, Maurizio Indolfi¹, Maria Antonietta Ferrara¹, Luigi Sirleto¹

¹National Research Council, Institute for Microelectronics and Microsystems, Naples Unit, Italy

Summary

בכתב יד זה, היישום של מיקרוסקופ ראמאן מגורה (SRS), המתקבל על ידי שילוב של הגדרת הניסוי SRS הערכה עם מיקרוסקופ סריקת לייזר, מתואר. מיקרוסקופ SRS מבוסס על שני מקורות לייזר (שניים), טי-ספיר (Ti: Sa) ומתנד פרמטרי אופטי מסונכרן (פופו).

Abstract

מיקרוסקופית פיזור ראמאן (SRS) משתמש באור עירור הקרוב לאינפרא-אדום; לפיכך, היא חולקת הרבה תכונות הדמיה רב-פוטון מיקרוסקופיים. מודאליות של הדמיה SRS ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ מסחרי סריקת לייזר על ידי הציוד עם גלאי הקדמי לא מסורק עם מסננים הנכון bandpass ו נעל-in מגבר (LIA) זיהוי תוכנית. פריסה סכמטית של מיקרוסקופ SRS אופייני כולל את הפרטים הבאים: שני קרני לייזר פעמו, (כלומר, המשאבה והבדיקה מכוונת במיקרוסקופ סריקה), אשר חייב להיות חופפים בחלל ובזמן במישור התמונה, ואז ממוקד על ידי מטרה מיקרוסקופ לתוך המדגם דרך שתי מראות סריקה (SMs), אשר רסטר את הנקודה המוקד על פני מטוס x-y. לאחר האינטראקציה עם המדגם, פולסים פלט ששודרו נאספים על ידי המטרה העליונה נמדדת על ידי מערכת זיהוי קדימה שנוספה במיקרוסקופ הפוך. פולסים משאבה מוסרים על ידי ערימה של מסננים אופטיים, ואילו פולסים בדיקה כי הם תוצאה של תהליך SRS המתרחשים נפח המוקד של הדגימה נמדדת על ידי פוטודיודה (PD). הבדיקה של המשטרה היא מאוד מדולמת על ידי ה-LIA כדי לחלץ את עומק האפנון. תמונה דו-ממדית (דו-ממדית) מתקבלת על ידי סנכרון יחידת הזיהוי הקדמי עם יחידת סריקת המיקרוסקופ. במאמר זה, היישום של מיקרוסקופ SRS מתואר והפגינו בהצלחה, כמו גם את הדיווח של תמונות ללא תווית של חרוזי פוליסטירן עם קטרים של 3 μm. ראוי לציין כי מיקרוסקופים SRS אינם זמינים מסחרית, כך על מנת לנצל את המאפיינים הללו, הבנייה ביתית היא האפשרות היחידה. מאז מיקרוסקופ SRS הופך פופולרי בתחומים רבים, הוא האמין כי תיאור זה זהיר של יישום מיקרוסקופ SRS יכול להיות מאוד שימושי עבור הקהילה המדעית.

Introduction

ביישומי מדעי החיים, מיקרוסקופ SRS התפתחה ככלי רב עוצמה עבור דימות ללא תווית. הרעיון הבסיסי של מיקרוסקופ SRS הוא לשלב את עוצמת הניגודיות התנובותית ואת יכולתה להשיג תמונות בתוך שניות ספורות.

SRS הוא תהליך שבו הפרש התדירות בין שני תדרי קרני לייזר (אות משאבה ואות סטוקס בתדרים שונים) מתאים את הרטט המולקולרי של דגימת נחקר, וגורם מגורה פיזור ראמאן ומשמעותי עליה. באות של סטוקס בניגוד ליניארי ספקטרוסקופית ראמאן, SRS מציג תלות לא לינארית על שדות האור הנכנסות ומייצרת קרינה קוהרנטית. ל-SRS יש שני יתרונות בסיסיים: 1) מהירות, מה שהופך את התמונות לרגישות פחות לחפצי אמנות הנובעים מתנועה לדוגמה או השפלה, ו-2) יחס מעולה של אות לרעש (SNR). בנוסף, srs מציג ספקטרום זהה ראמאן ספונטנית, ואת האות SRS הוא פרופורציונלי ליניארי לריכוז של הקשר הכימי נרגש¹^,²^,³^,⁴^, ⁵. המשך

במיקרוסקופ שלנו, הגדרת שנייה (fs) SRS ניסיוני משולב עם מיקרוסקופ אופטי הפוך מצויד מראות מהירה יחידת סריקה (איור 1)⁶^,⁷^,⁸. שני מקורות לייזר פעמו משמשים ליישום מיקרוסקופ זה. הראשון הוא fs-Ti: Sa עם משך פעימה של כ 140 fs, קצב חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 680-1080 nm. השני, המשמש כקרן בדיקה ושאוב על ידי Ti: Sa, היא מתנד פרמטרית מסונכרן האופטי השני (SOPO), עם משך הדופק של כ 200 fs, שיעור חזרה של 80 MHz, ואורכי גל פליטה בטווח של 1000-1600 nm. יצוין כי ההבדל אנרגיית פוטון המינימלי בין Ti: Sa ו-SOPO קורה הוא 2500 ס"מ^-1. לכן, באמצעות שילוב זה של מערכות לייזר, רק בתדירות גבוהה C-H אזור (2800-3200 ס"מ^-1) של ראמאן ספקטרום ניתן לחקור⁶^,⁷^,⁸.

כדי להקים מיקרוסקופ SRS יש שלושה נושאים קריטיים לשקול, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא יישום של שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לתיאור). בחקירה ניסויית של SRS, פרמטר חיוני הוא רגישות המערכת. אות SRS מזוהה כשינוי קטן בעוצמת קורות העירור; לכן, זה יכול להיות פגום על ידי רעש לייזר בעוצמה ורעש ירה. ניתן להתגבר על בעיה זו על-ידי שילוב מערכת זו עם שיטת העברת אפנון בתדר גבוה (ראה איור 2 וצעד 2.1 של הפרוטוקול לקבלת פרטים). בשיטה זו, מאופנן אלקטרו-אופטיים (EOM) משמש לווסת את המשאבה. אפנון הועבר קרן בדיקה לאחר מכן ניתן לזהות על ידי משטרת לאחר חסימת קרן המשאבה עם ערימה של מסננים אופטיים [גירוי לצבור ראמאן (SRG) מצב זיהוי]. פלט ה-PD מחובר באמצעות מסנן מעבר נמוך למגבר מנעול (LIA), אשר מדגיש את האות הנמדד. על-ידי הגברת תדירות האפנון של הקרן לתדרים מעל 1 MHz, ניתן להשיג את המגבלה הפנימית של PDs.

הסוגיה השנייה לשקול הוא התקנה של הר מכני אשר מאפשר לבצע זיהוי קדימה באותו זמן כדי לשמר את ההתבוננות במיקרוסקופ ברייטפילד. בנוסף, הוא צריך להפחית את הרעש עקב רטט מכני במהלך הדור של תמונות ולאפשר מיקום מדויק של מערכת האיתור (ראה איור 3 וצעד 2.2 של הפרוטוקול).

השלישי הוא סנכרון האות שנרכש על ידי ערכת האיתור התלויית-פאזה, כאשר הקרן ממוקמת על המדגם הנמצא במעקב על-ידי ראש הסורק של המיקרוסקופ. כדי להגשים תמונות, ה-SMs דורש שלושה אותות TTL שנעשים זמינים על-ידי בקר המיקרוסקופ המחובר ליחידת ראש הסריקה: שעון פיקסל, סנכרון קו, וסנכרון מסגרת. הסנכרון מושג על ידי שליטה באמצעות כרטיס PCI, שלושת אותות הTTL, ורכישת אות מתח בערוץ הפלט של LIA⁶^,⁷^,⁸. תוכנה תוצרת בית פותחה ותוארה בעבר⁶^,⁷^,⁸, בעוד החומרה של מערכת הסינכרון מדווחת באיור 4.

הליך בסיסי בעת ביצוע הדמיה SRS הוא יישור מיקרוסקופ. היא ממומשת במהלך ארבעת השלבים, המתוארים בפסקאות העוקבות. הראשון הוא חפיפה מרחבית של שתי קורות (ראה שלב 3.1 של הפרוטוקול). בערכה ניסיונית זו, שתי הקורות היו משולבים באופן קוליניארי בשילוב על ידי מראה דיקרואיק. הצעד הראשוני הוא היישור של פופו ו-Ti: Sa כך שכל אחד מהם מגיע למיקרוסקופ. אז, בהתחשב ב-פופו כקרן התייחסות וניצול של גלאי מיקום רגיש, Ti: Sa הוא חופף באופן מהותי ל-פופו.

ההיבט המכריע השני הוא החפיפה הטמפורלית של שתי קורות (ראה שלב 3.2 של הפרוטוקול). גם אם המשאבה ו-פופו קורות מסונכרנים באופן מושלם⁹, מאז הם בעקבות שבילים מעט שונים הקורה בתוך הדיור פופו, ביציאה פופו יש להם עיכוב זמן של כ 5 ns והבדל מרחבי של 5 ס מ. לכן, Ti: Sa ו-פופו דורשות לבצע מחדש את הזמן הקצוב באופן מתוזמן כדי להבטיח חפיפה זמנית במדגם. הדבר מתבצע בדרך כלל עם קו השהיה אופטי הניתן לפעולה דק, אשר במקרה זה מוכנס בין Ti: Sa ומיקרוסקופ (ראה איור 1). על מנת להשיג חפיפה זמנית של שתי קורות, נעשה שימוש בשתי טכניקות. הראשונה מבוצעת באמצעות משטרת מהירה והאוסילוסקופ, בעוד השני מבוסס על מערכת יחסים אוטומטית ומחוצה אופטי. באמצעות הטכניקה הראשונה, חפיפה מחוספס של שתי קורות מושגת (אי ודאות של 10 ps), בעוד החפיפה הזמני מדויק של שתי קורות מושגת באמצעות משתמש חוצה (רזולוציה של 1 fs).

ההיבט העיקרי השלישי הוא יישור של שתי הקורות בתוך המיקרוסקופ (ראה שלב 3.3 של הפרוטוקול). התבוננות מוקדמת באור לבן של המדגם מאפשרת לאינדיבידוקה את השדה הרצוי (FOV). לאחר מכן, קרני לייזר, כניסה למיקרוסקופ על ידי נמל צדדי של מיקרוסקופ, מיושרים על מנת להגיע למשטרה רכוב על החלק העליון (איור 3). עם זאת, עבור רכישת תמונה נכונה, הגדרת מספר פרמטרים נדרש (לדוגמה, מימד פיקסל ופיקסל זמן לשכון). תדר הדגימה חייב לכבד את האילוץ שהוטל על ידי משפט נייקוויסט על מנת לשמר את כל המידע בתמונה, ובמקביל לתכתובת נכונה בין הקואורדינטות המרחבית של פיקסלים לבין ערך SRS הנמדד בכל פיקסל, זמן האינטגרציה של LIA צריכה להיות שווה או דומה לזמן לשכון פיקסל.

בשלב האחרון של יישור מיקרוסקופ, בדיקות רבות מתבצעות כדי לייעל את היישור המרחבי והזמני (ראה שלב 3.4 של הפרוטוקול). מספר תמונות שידור (TI) עבור שתיהן Ti: Sa ו-פופו נרכשים כדי לייעל את החפיפה המרחבית. ב-TI, נעשה שימוש בקרן בודדת, ועוצמת הקרן המועברת מהמדגם נמדדת על-ידי משטרה. במקרה של TI הבינה על-ידי פופו, אות הפלט של PD מחובר ישירות לכרטיס PCI, ואילו במקרה של TI הבינה על-ידי Ti: Sa, אות הפלט של PD מחובר ל-LIA ופלט אנלוגי של LIA מחובר לכרטיס PCI. תמונות השידור שימושיות מאוד כדי למטב את fov, את התאורה, את המיקום המוקד של מטרות מיקרוסקופ וכדי לבדוק אם שתי הקורות הם בעלי שליטת חופפים⁶^,⁷^,⁸.

אופטימיזציה של המשאבה ובדיקת חפיפה הזמני של קרן מושגת על ידי סריקת קו ההשהיה עם שלבים של 0.001 מ"מ המתאימים 3.3 fs זמן משמרת וביצוע מדידה SRS בנקודה אחת של מדגם חרוז בפוליסטירן 3 יקרומטר קוטר. השרעת של אות SRS מודדת ערכים מליה, כפונקציה של עיכוב בדיקת המשאבה, והיא מספקת המקבילה המדויקת לחפיפה בזמן המדויק של שתי הקורות⁶^,⁷^,⁸. לפני הסיכום, יש לציין כי כל הצעדים הנדונים הם חובה כדי לקבל תמונה באיכות גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מפעיל את מערכת הלייזר

בדקו אם הטמפרטורה של הצ נשמרת בשעה או מתחת ל-20 ° c.
בדוק אם יחידת בקרת הלחות פועלת כהלכה והלחות נשמרת בערך סביב 40%.
הפעל את לייזר Ti: Sa באופן מדויק, בהתאם להוראות שבמדריך.
הגדר את אורך הגל כדי 810 ננומטר.
הפעל את ה-פופו ואת המחשב המצומצם המחובר. הפעל את היישום ששולט על לייזר פופו.
בחר באפשרות עקיפה אם 100% מפלט הלייזר של האבטחה הקריטי נדרש ביציאה מהתיבה פופו.
בטלו את הבחירה בעקיפה אם 20% מתפוקת הלייזר של Sa ופלט הלייזר הפופו נדרשים ביציאה מהתיבה פופו.
פתח את התריס של Ti: sa ושחרר את קרן Ti: sa לקלט ה-פופו.
שחררו את שתי קרני הלייזר ביציאת ה- פופו על ידי לחיצה על האות החוצה והמשאבה.
המתן עד שני לייזרים Ti: Sa ו-פופו מיוצב (בסביבות 45-60 דקות).
בדוק את נקודת הקורה ביציאה של תיבת ה-פופו עבור שני הצדדים: Sa ו-פופו באמצעות כרטיס גלאי נייר ובדוק את החשמל באמצעות מד מתח.
לכוונן את אורך הגל לייזר פופו ל 1076 ננומטר.
הפחת את העוצמה ל-~ 10 mW עבור כל קרן לייזר לביצוע יישור.

2. הגדרת המיקרוסקופ

יישום שיטת העברת אפנון בתדר גבוה
1. בצע את הליך היישור האופטי של מודול כך שקרן Ti: Sa נכנסת ויוצאת ללא כל עיוות.
2. הפעל את גנרטור הפונקציה וליצור אות TTL (גל מרובע עם משרעת = 5 V, לקזז = 2.5 V, תדירות = 5 מגה-הרץ).
3. חלק את אות ה-TTL לשני חלקים באמצעות צומת T; אחד עבור EOM והשני עבור מגבר נעילה (ליליה) (ראה איור 2).
4. בדוק את כל רמות האותות באמצעות האולוסקופ.
5. הפעל את ה-LIA וחבר את ערוץ תפוקת הגנרטור לערוץ הייחוס של ה-LIA.
6. חבר את ערוץ פלט הגנרטור למגבר מתח גבוה של EOM.
7. הפעל את המגבר והגדר את המתח כמעט לרמה המרבית. נטר את כוח הקרן ביציאה של EOM.
שילוב של הרכבה מכנית כדי לתקן את PD ולהקצות x ו-y תנועה יחסית
הערה: עם המיקרוסקופ, הר חיצוני מוצג, מצויד במיקרומטר כי יש בקרת תנועה בכיוונים x ו-y.
1. הר שני שלבי תרגום כדי לאפשר תנועות לאורך הכיוונים x ו-y (ראה איור 3).
2. תקן את השלב על 1.5 Ø "פוסט בגובה המתאים.
3. . לטעון את המשטרה להר חיצוני
4. למקסם את כוח הקרן ב-PD, כוונון עמדות PD (קואורדינטות x ו-y) באמצעות מיקרומטר מחובר להר (ראה איור 3).

3. יישור מיקרוסקופ

חפיפה מרחבית של הקורות
הערה: בהתחשב בקרן הפופו כהפניה ומנצלת גלאי מיקום רגיש, Ti: Sa צריכה להיות חופפת ל-פופו בהתאם להליך הבא:
1. יישר את הקורות ה-פופו ואת קרני הלייזר האלה כדי ששניהם יגיעו למיקרוסקופ.
2. מניחים את קרן הלייזר מיקום חיישנים גלאי בשתי עמדות בין דיקרואיק מראה 1 ומראה 6, המיקום הראשון ממוקם קרוב דיקרואיק mirror 1 והשני הוא קרוב למראה 6. עבור כל תנוחה, השתמש בחיישנים כדי לזהות את הקואורדינטות x ו-y של קרן ה-פופו (בעקבות איור 1).
3. ודא שהקואורדינטות x ו-y של קרן הלייזר של Ti: Sa הן אותו פופו בשני המיקומים של גלאי החיישנים. אם במיקומים מסוימים הקואורדינטות של Ti: Sa ו-פופו אינן חופפים, כוונן את ההטיה של השיקוף הסמוך כדי לפצות את ההפרש (לאחר איור 1).
4. בצע את אותו ההליך כדי ליישר את מיקומי הקרן של Ti: Sa ביחס ל-פופו עבור הנתיב בין M6-M7 (בצע איור 1).
סנכרון זמני של הקורות
1. השימוש בפוטודיודה המהירה בתוספת האולוסקופ:
  1. הפסק את התפשטות הקורות Ti: Sa ו-פופו והציבו גלאי מהיר מול קרן ה-פופו (בין M6 ו-M7).
  2. חבר את אות ההדק שסופק על-ידי תיבת הלייזר Ti: Sa עם היקף בערוץ 2.
  3. חבר את כבל הגלאי עם האולוסקופ בערוץ 1 והמחש את הפרופיל הזמני של ה-פופו.
  4. תעד את הזמן (abscissa) הנמדד על ידי האולוסקופ המתאים לערך המירבי שלה, כלומר t1.
  5. עצור את קרן הפופו ושחרר את קרן Ti: Sa.
  6. המחש את הפרופיל הזמני של Ti: Sa ותעד את הזמן (abscissa) המתאים לערך המירבי שלה, כלומר t2.
  7. מזער את ההפרש בין t1-t2 באמצעות קו ההשהיה כדי לחפוף את שתי הקורות. במקרה שלנו, ההבדל המינימלי למדידה הוא 10 ps.
  8. הסר את הגלאי המהיר בין M6 ו M7.
2. שימוש בטור האוטומטי:
  הערה: בתרשים הסכימטי המוצג באיור 1, מותקנת מחדש מבלי להפריע לנתיבים אופטיים של הקורות. בנוסף, מראה נוספת מוצגת ורכוב על הר פליפ פלופ (המכונה FFM/AM) בין M6 ו M7 כדי להטות את הקרן אל האוטוקורטור.
  1. הפוך את ה-AM לכוון את הקרן אל האוטוקוטור.
  2. עצור את Ti: Sa ושחרר את ה-פופו.
  3. הגדר את מיקרומטר הכוונון של התאמת הקרן למיקום רגיל (8.35 מ"מ).
  4. מתח בבקר האוטוקורטור והפעל את יישום התוכנה במחשב האישי השולט בו.
  5. הפרויקט קרן הפופו מ-FFM/AM לשיקוף הכניסה לתוך האוטוקומטר.
  6. שלוט בנקודת השיקוף (באמצעות כרטיס גלאי נייר) של הקרן על חלון היישור של המחשב האוטומטי.
  7. במקרה של אי-הקרן או בעוצמה נמוכה, להתאים את המיקום ואת הכיוון של FFM/AM במידה אופטימלית, ולנסות להתאים את שיקוף הקלט (רכוב על האוטוקורטור) כדי למקסם את עוצמת הדופק לייזר. האות האוטומטית מתקבל כמוצג באיור 5a.
  8. עצור את ה-פופו ואת הפרוייקט של קרן Ti: Sa מ-FFM/AM כדי להזין מראה לתוך האוטומטית. חזור על שלבים ה3.2.2.6 וה3.2.2.7. האות האוטומטית מתקבל כמוצג באיור 5b.
  9. קבעו את מיקרומטר הכוונון של התאמת הקרן למיקום הרוחב (7.30 מ"מ).
  10. . שחררו את שתי הקורות
  11. סרוק את שורת ההשהיה כדי לקבל את שתי הקורות פופו ו-Ti: Sa חופפים. האות שנוצר מחדש מתקבל כמוצג באיור 6.
  12. הפוך את המראה FFM/AM כך הקורות יכול להגיע M7 ולסרוק את ראש המיקרוסקופ.
מיקרוסקופ
1. בצע התבוננות באור לבן מיקרוסקופיים:
  הערה: לפני התבוננות מיקרוסקופית, ודא שהמיקרוסקופ מיושר כהלכה.
  1. הכינו את דגימת הבדיקה, המורכבת מתמיסה של מאגר פוספט בו מפוזרים חרוזי פוליסטירן עם קוטר של 3 יקרומטר. הפתרון ממוקם בתוך כריך של שתי שקופיות זכוכית.
  2. הפעל את המיקרוסקופ ואת אספקת החשמל של אור לבן. עקבו אחר המדריך להתבוננות תחת אור לבן.
  3. השתמש בעבה כדי להאיר את המדגם. השתמש במטרה של 60x כדי לאסוף את האור. הניחו את הדגימה על הבמה. מיטוב המיקום המוקד של המטרה מיקרוסקופ 60x.
  4. בחר את FOV הריבית. קח תמונת CCD של המדגם (איור 7).
  5. כבה את אספקת החשמל. של האור הלבן
2. מיקרוסקופ ויישור עם קרני לייזר השני של הקרן: פופו ו-Ti: Sa
  1. הסר את העבה באמצעות לחצן escape כדי לבטל זמנית את העדשה מיקרוסקופ 60x המטרה. להעביר את המטרה 60x מטרת העדשה מהנתיב האופטי, סיבוב את פיסת האף.
  2. הר את הגלאי לחלק העליון של המיקרוסקופ באמצעות הר מכני חיצוני. חבר את פלט הגלאי באמצעות מסנן מעבר נמוך של 50 Ω לאולוסקופ ונטר את אות ה-פופו.
  3. הפעל את המעבד השולט בראש הסורק. הפרויקט קרן הפופו לתוך ראש הסורק של המיקרוסקופ.
  4. בדוק את מיקום הקרן בתוך המיקרוסקופ, ודא כי מיקום הקרן נמצא במרכז או ליד המרכז.
  5. בדוק שמיקום הקרן בתוך. ראש המשטרה נמצא במרכז
  6. הגדל את העוצמה הנמדדת על-ידי הגלאי באמצעות מתרגם x-y.
  7. החלף את הקרן מ-פופו ל Ti: Sa וודא שהאות המקסימלי מתקבל גם עבור לייזר טיטניום-ספיר. הדבר מעיד על כך ששתי הקורות מיושרות היטב.
  8. להשלים את היישור הקרן, החדרת עדשת מיקרוסקופ 60x המטרה מסתובבת בחזרה את פיסת האף.
  9. השתמש בלחצן מוקד מיקוד על המיקרוסקופ כדי להחזיר את המוקד הסופי לעדשת המיקרוסקופ 60x היעד.
  10. מניחים את המטרה עם הגדלת 40x במקום העבה בלי לגעת או להפריע את המדגם.
אופטימיזציה של סינכרונים מרחביים וזמני של קורות
1. סנכרון זמני
  1. הגדר את העוצמה של Ti: Sa ו-פופו נמדד לפני המיקרוסקופ ל-30 mW עבור שתי הקורות. להגדיר את אורך הגל של פופו לערך שונה ביחס הקודם, כך המשאבה ובדיקה אינם בתהודה עם תדירות הרטט של החרוזים.
  2. שחרר את שתי הקורות (Ti: Sa ו-פופו) כך שהם ייכנסו למיקרוסקופ.
  3. הפעל את קו עיכוב הסריקה מתרגם ממוחשב ותעד את העוצמה הנמדדת של LIA עבור כל מיקום של קו ההשהיה. המתן עד להשלמת סריקת שורת ההשהיה. הפרופיל הזמני שהושג הוא דמיינו באיור 8a.
  4. להגדיר את אורך הגל של פופו כדי 1076 ננומטר שוב כך משאבה ובדיקה הם בתהודה עם תדירות הרטט של החרוזים. חזור על השלב 3.4.1.3 (הפרופיל הזמני שהושג הוא דמיינו באיור 8b).
  5. הגדר את מיקום קרן החפיפה שהושג בשורת ההשהיה כדי לרכוש תמונות SRS.
2. סנכרון מרחבי של הקורות
  הערה: תמונות שידור שימושיות כדי לייעל את FOV, תאורה, מיקום מוקד של מטרות המיקרוסקופ, וכלה לבדוק אם שתי הקורות הם חופפים.
  1. רכישת תמונת תמסורת של פופו
    1. עצור את הקרן Ti: Sa והפחת את עוצמת ה-פופו ל-8 mW.
    2. חבר את הבדיקה הבודק לכרטיס רכישת הנתונים.
    3. הפעל את תוכנית רכישת הנתונים יחד עם קונסולת סריקת מיקרוסקופ.
    4. שמור את הקובץ ועבד את הנתונים כדי לקבל את התמונה. התמונה הגולמית מופיעה כמוצג באיור 9a.
  2. רכישת תמונת שידור של Ti: Sa
    1. עצור את קרן ה-פופו והפחת את העוצמה Ti: Sa בגודל 2.5 – 4.5 mW.
    2. חבר את הגלאי עם הקריאות LIA ו-LIA עם כרטיס רכישת הנתונים.
    3. חזור על שלבים ה3.4.2.1.3 וה3.4.2.1.4. התמונה הגולמית מופיעה כמוצג באיור 9b.

4. רכישת תמונת SRS

הערה: אלגוריתם ייעודי התממש כדי לאחסן נתונים. הוא תומך בתבניות התמונה הבאות: 512 px x 512 px ו 256 px x 256 px, עם זמני הרכישה של 16 s, 8 s, 4 s, ו 2 s.

להציג ערימה של מסננים בין המטרה 40x ו PD כדי להסיר את פולסים המשאבה (Ti: Sa) ולרכוש רק את האות סטוקס (פופו).
הגדר את אות המשאבה ל 810 ננומטר עם כוח ממוקד של 8 mW ואת האות בדיקה ל 1076 nm עם כוח ממוקד של 8 mW לחקור את הקשר האופייני C-H של פוליסטירן (ראמאן שינוי של 3054 ס מ¹).
חבר את הגלאי באמצעות הבדיקה LIA ו-LIA לכרטיס רכישת הנתונים.
הגדר את תבנית הפיקסלים של רכישת תמונה לפי דרישה והגדר את זמן הרכישה.
הפעל את התוכנית השולטת בבקר המיקרוסקופ.
הפעל את תוכנית האלגוריתם הייעודי הפועלת כסנכרון בין בקר המיקרוסקופ, מערכת האיתור והDAQ (ראה איור 4).
שמור את קובץ המטריצה לאחר השלמת הרכישה.
יבא את קובץ הנתונים הגולמיים ושמור את התמונה בתבנית הדרושה (שנשמרה בדרך כלל בתבנית. tif) באמצעות תוכנת ImageJ. התמונה מוצגת באיור 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דוגמה למדידה SRS (כלומר, מדידת SRS בנקודה אחת של המדגם) מדווחת באיור 7. כאשר הקורות אינם חופפים בזמן או במרחב, התוצאה המתקבלת מדווחת באיור 8a. בתהודה מרחוק, משרעת האות הנמדדת על ידי LIA היא אפס, בעוד שהשלב של האות שנמדד על ידי לוליה מדלג בין ערכים שליליים וחיוביים. בעוד, כאשר הקורות חופפים בחלל, הזזת קו ההשהיה בטווח המתאים, התוצאות המתקבלות מדווחות באיור 8b. האות שנמדד על ידי LIA מגדיל ומגיע למקסימום כאשר הקורות מסודרים בצורה מושלמת בזמן, בעוד השלב מתחיל להשיג ערך קבוע במהלך הזמן שבו הקורות חופפים בזמן.

התמונות הספיגה שהתקבלו באמצעות קרן אחת (Ti: Sa או פופו) של חרוזי פוליסטירן זהה מיוצגים באיור 9a, b עם ברים סולם של 6 μm. כדי לרכוש את תמונות SRS, קו ההשהיה מוגדר למיקום שהושג באיור 7b, תמונת srg טיפוסית מוצגת באיור 10 עם סרגל בקנה מידה של 6 μm.

איור 1: הפריסה הסכמטית של מערכת המיקרוסקופ f-SRS. פופו = מתנד פרמטרי אופטי; Ti: Sa = טיטניום ספיר לייזר; M1-M7 = מראות פס רחב לנשים שניות; FFM/AM = היפוך-פלופ ראי/מראה אוטוקורטור; DM1, DM2 = דיקרואיק מראות; DL = שורת השהיה; AC = מוניטור אוטומטי; EOM = מאפנן אלקטרו-אופטיים; FG = גנרטור פונקציה; GM מראה Galvo; Obj1, Obj2 = יעדי מיקרוסקופ; משטרה = פוטודיודה DAQ = מערכת רכישת נתונים; PC = מחשב אישי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ערכה של שיטת העברת אפנון בתדר גבוה. בדמות הכניסה, לייזרים שתי קורות לפני האינטראקציה בתוך המדגם שונה הבדיקה עקב אינטראקציות של הגשוש ומשאבה בתוך המדגם מיוצגים. הזמן מיוצג ב-ns. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ייצוג הר פוטודיודה עם מערכת הרכבה מכנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: סכמטית של מערכת רכישת נתונים. PD = מגבר נעילה למנעול, לינה = מחשב מנעול, DS = מערכת איתור, MC = בקרת מיקרוסקופ, DAQ = מערכת רכישת נתונים, PC = המחשב האישי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: פונקציית Autocorrelator של פופו (א) ו-Ti: SA (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: פונקציית הקורלציה הצולבת של פופו ו-Ti: Sa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: תמונת מצלמות של חרוזי פוליסטירן.

איור 8: משרעת ושלב של אות SRS הנמדד על-ידי מגבר מנעול: מחוץ לתהודה (בצד שמאל) ובתהודה (מימין) . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: תמונות שידור של פוליסטירן מוקצף מושגת על ידי פופו (א) ו Ti: Sa (ב). סרגל בקנה מידה = 16 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: תמונת SRS של חרוזי פוליסטירן. סרגל קנה מידה = 12 μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מיקרוסקופ SRS לקח הדמיה ללא תווית לגבהים חדשים, במיוחד במחקרים של מבנים ביולוגיים מורכבים כגון שומנים, שהם בסיסיים לתאים ולארכיטקטורה סלולרית. שומנים מעורבים במסלולים פיזיולוגיים מרובים כגון ייצור של ממברנות ביולוגיים, והם משמשים כלסמנים biosynthetic ו מתמרים אותות¹⁰. שומנים הם ארוזים לתוך האורגתאי תאיים מיוחדים, נקרא גם טיפות שומנים (מקרא). הקטרים שלהם משתנים ממספר עשרות נאנמטרים לעשרות מיקרומטר¹¹^,¹². המולד לא רק משתתף בשפע בתאי האדיפוז-ו-סטרואידים, אך הם נמצאים גם בקווי תאים אחרים. האדם משתף פעולה בתהליכים פיזיולוגיים כגון אחסון ליפיד. הם מוצעים בהבלטה בפתווגיות נפוצות (לדוגמה, מטבוליזם כולסטרול משתנה)¹³^,¹⁴.

באופן מסורתי, ויזואליזציה של שומנים מושגת באמצעות מיקרוסקופ הפלואורסצנטית ו נייטרלי ליפיד ספציפי תאים קבוע מתויג צבע¹⁰. יצוין כי כמו שומנים קטנים בגודל בהשוואה חלבונים ו-DNA, שינויים מבניים ופונקציונלי ממצאים לא רצויים יכולים להתרחש בעת הוספת fluorophores¹⁵^,¹⁶. SRS הוכח להיות רב עוצמה ללימוד מבנים עשירים השומנים. שומנים הם בשפע ב-C-H₂ קבוצות. לכן, פסגות מבודדים יחסית הקשורים C-H בונד מדינות ויברליות ב 2845 ס מ^-1 בספקטרום ראמאן שלהם לספק חתימה ייחודית עבור שומנים בתוך תא. למרבה הצער, מאז חתימות הרטט הדיפרנציליות הן סופיים, קשה מאוד להבחין בין ביוקיים מטרה לבין המינים הנלווים האחרים בתוך תאים החולקים קשרים כימיים דומים. עם זאת, ניתן להוסיף הזעיר ראמאן-active בדיקה ויברtional (g., האלגיים ו איזוטופים יציבים) כדי לקבל ספציפיות עבור הדמיה של biomolecules קטן¹⁷.

מיפוי סימולטני של מינים כימיים שונים במדגם מסוים הוא הכרחי להשקיע את החלוקה הvivo והדינמית בין זוגות של biomolecules¹⁸^,¹⁹. לכן, מאמצים רבים נעשו כדי להשיג ניגודים כימיים מרובים. באפשרות הפשוטה ביותר של הדמיה ססגוניות, תמונה שונה מצבי ראמאן של מדגם, את התדירות של קרן המשאבה או קרן סטוקס מכוונים סריקות רציפים¹⁸. עם זאת, שימוש בגישה כוונון אורך הגל עלול לגרום לאובדן מידע שיתוף לוקליזציה של מצבי ראמאן שונים, במיוחד כאשר המדגם הוא בסביבה דינמית¹⁸.

כתוצאה של עירור לא לינארית, SRS מציע יכולות פנימיות 3D בפתרון של הקשר הכימי שנבחר בתוך דגימות ביולוגיות²⁰. שחזור היקף של הקשר הכימי שנבחר והפצות המרחבי שלה ניתן להשיג רק על ידי איסוף תמונות SRS במישור מוקד שונים לאורך ציר z. מאז התמונות נרכשים עם החלטות מרחבי וזמני גבוהה, חלקים אחרים של מידע מפתח (כלומר, מבנה 3D, הרכב כימי, וכו ') על המדגם הביולוגי ניתן להשיג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מעריכים V. Tufano מ IMM CNR עבור סיוע טכני יקר שלו ג'אקומו Cozzi, מומחה מוצר ממכשירים ניקון, עבור דיונים שימושיים תמיכה רציפה. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי האיטלקי הלאומי תוכניות PONa3 00025 (BIOforIU) ועל ידי היורו-Bioדימות פרויקט בקנה מידה גדול של תשתית מחקר panEuropean.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisation tool	Nikon	Nikon C2Tool	Acquisation supported tool
APE Pulse link control software	APE-	APE Pulse link control software	software control
Autocorrelator	APE	APE PulseCheck USB 50	Autocorrelator
Detector	Thorlabs	Thorlabs DET10A	Photodiode
Detector card	Thorlabs	Thorlabs VRC	IR detector Card
Dichroic mirror	Semrock	Semrock FF875-Di01-25X36	Dichroic mirror
Dichroic mirror	Semrock	FF875-Di01-25x36	Dichroic mirror
EOM	Conoptics	(EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P).	Pockels cell
Fast detector	Thorlabs	Thorlabs DET025AL/M	Photodiode
Fast mirror scanning unit	Nikon	C2	Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA	Coherent	Coherent Chameleon Ultra II	Chameleon Ultra II
Function generator	TTi	TG5011 AIM – TTi	Function generator
Inverted optical microscope	Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon	Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier	Standford Research System	SR844-200 MHz dual phase	A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter,	Semrock	NF03-808E-25	Notch filter
Optical delay line	Newport	Newport M-ILS200CC	Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator	Coherent	Coherent Compact OPO	Coherent Compact OPO
Oscilloscope	WaveRunner	640Zi 4GHz OSC/LeCroy	Digital Oscilloscope
PCI Card	National instrument	NI PCIe 6363	Data acquisation card
Position Sensors Detectors	Newport	Newport Conex PSD9	Position detector sensor
Power meter head	Coherent	PowerMax PM10,	Laser power detector
Translation Stages	Thorlabs	Thorlabs PT1/M	Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).

Engineering

יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.