Summary
В этой рукописи описана реализация стимулируемого Раманского рассеяния (SRS) микроскопа, полученного путем интеграции экспериментальной установки SRS с лазерным сканющим микроскопом. Микроскоп SRS основан на двух фемтосекундных (fs) лазерных источниках, Ти-Сапфире (Ti:Sa) и синхронизированном оптическом параметрическом осцилляторе (OPO).
Abstract
Стимулируемая Рамана россыпь (SRS) микроскопия использует ближний инфракрасный свет возбуждения; поэтому он разделяет многие свойства мультифотоно-микроскопических изображений. Модальность изображения SRS может быть получена с помощью коммерческих лазерных сканируя микроскопов, оснащая неотнесканированный передний детектор с правильными фильтрами bandpass и схемой обнаружения усилителя блокировки (LIA). Схематическая компоновка типичного микроскопа SRS включает в себя следующее: два импульсных лазерных луча (т.е. насос и зонд, направленные в сканирующий микроскоп), которые должны быть перекрыты как в пространстве, так и во времени на плоскости изображения, а затем сосредоточены на микроскоп цели в образец через два сканирующего зеркала (SMs), которые raster фокусное пятно через x-y плоскости. После взаимодействия с образцом передаваемые выходные импульсы собираются верхней целью и измеряются системой переднего обнаружения, вставленной в перевернутый микроскоп. Импульсы насоса удаляются стеком оптических фильтров, в то время как импульсы зонда, которые являются результатом процесса SRS, происходящего в фокусном томе образца, измеряются фотодиодом (PD). Считывание PD сглажается ЛИА для извлечения глубины модуляции. Двухмерное (2D) изображение получено путем синхронизации переднего блока обнаружения с сканирующим блоком микроскопа. В этой работе описана и успешно продемонстрирована реализация микроскопа SRS, а также отчет о безэтикетках изображениях полистироловых бусинок диаметром 3 мкм. Стоит отметить, что микроскопы SRS не доступны на коммерческой уровне, поэтому для того, чтобы воспользоваться этими характеристиками, самодельная конструкция является единственным вариантом. Поскольку микроскопия SRS становится популярной во многих областях, считается, что это тщательное описание реализации микроскопа SRS может быть очень полезным для научного сообщества.
Introduction
В приложениях науки о жизни микроскопия SRS стала мощным инструментом для визуализации без этикеток. Основная идея микроскопии SRS заключается в том, чтобы объединить силу колебательных контрастов и его способность приобретать изображения в течение нескольких секунд.
SRS это процесс, в котором разница в частотах между двумя частотами лазерных лучей (сигнал насоса и топит сигнал на разных частотах) соответствует молекулярной вибрации исследуемого образца, вызывая стимулируемое рассеяние Раман и значительное увеличение сигнала Стокса. В отличие от линейной Рамане-спектроскопии, СРС обладает нелинейной зависимостью от входящих световых полей и производит когерентное излучение. SRS имеет два основных преимущества: 1) скорость, которая делает изображения менее чувствительными к артефактам, возникающим в результате движения образца или деградации, и 2) отличное соотношение сигнала к шуму (SNR). Кроме того, SRS экспонатов спектра идентичны спонтанным Раман, и сигнал SRS линейно пропорционально концентрации химической связи возбужденных1,2,3,4, 5.
В нашем микроскопе, фемтосекунда (fs) SRS экспериментальная настройка интегрирована с перевернутым оптическим микроскопом оснащен быстрым зеркалом сканирующей единицы(Рисунок 1)6,7,8. Для реализации этого микроскопа используются два импульсных лазерных источника. Первый fs-Ti:Sa с продолжительностью пульса около 140 fs, частотой повторения 80 МГц и длиной волн выбросов в диапазоне 680-1080 нм. Второй, используемый в качестве пучка зонда и накачиваемый Ti:Sa, представляет собой фемтосекундный синхронизированный оптический параметрический осциллятор (SOPO), с пульсом продолжительностью около 200 л.с., частотой повторения 80 МГц и длиной волн выбросов в диапазоне 1000-1600 нм. Следует отметить, что минимальная разница в энергии фотона между пучком Ti:Sa и SOPO составляет 2500 см-1. Поэтому, используя эту комбинацию лазерных систем, можно исследовать только высокочастотную область C-H (2800-3200 см-1) Раманских спектров6,7,8.
Для создания микроскопа СРС необходимо рассмотреть три важнейших вопроса, которые описаны в последовательных пунктах. Во-первых, это внедрение высокочастотного метода передачи модуляции (см. рисунок 2 и шаг 2.1 протокола для описания). В экспериментальном исследовании SRS важнейшим параметром является чувствительность системы. Сигнал SRS обнаруживается как небольшое изменение интенсивности лучей возбуждения; таким образом, он может быть поврежден лазерным шумом интенсивности и выстрелом. Эту проблему можно решить путем интеграции этой системы с высокочастотным методом передачи модуляции (см. рисунок 2 и шаг 2.1 протокола для деталей). В этом методе используется электрооптический модулятор (EOM) для модулировать насос. Модуляция, передаваемый на пучок зонда, может быть обнаружена PD после блокирования пучка насоса стеком оптических фильтров (стимулировал обретение Рамана (SRG) режим обнаружения». Выход PD соединен фильтром низкого прохода с усилителем блокировки (LIA), который демонополирует измеренный сигнал. Увеличивая частоту модуляции луча на частоты выше 1 МГц, можно получить внутренний предел ПД.
Вторым вопросом, который необходимо рассмотреть, является установка механической крепления, которая позволяет осуществлять дальновидное обнаружение и в то же время сохранять микроскопическую наблюдение в ярком поле. Кроме того, он должен уменьшить шум из-за механической вибрации во время генерации изображений и обеспечить точное перепозиционирование системы обнаружения (см. рисунок 3 и шаг 2.2 протокола).
Третьим является синхронизация сигнала, полученного по схеме фазочувствительного обнаружения, при этом луч расположен на образце, контролируемом сканирующей головкой микроскопа. Для реализации изображений SMs требуются три сигнала TTL, которые доступны контроллером микроскопа, подключенным к головному блоку сканирования: пиксельные часы, синхронизация линии и синхронизация кадра. Синхронизация достигается путем управления с помощью карты PCI, трех сигналов TTL и приобретения сигналанапряжения на выходном канале LIA 6,7,8. Домашнее программное обеспечение былоразработано и описано ранее 6,7,8, в то время как оборудование системы синхронизации сообщается в рисунке 4.
Фундаментальной процедурой при проведении sRS-изображения является выравнивание микроскопа. Она реализуется в течение четырех этапов, которые описаны в последовательных пунктах. Во-первых, это пространственное перекрытие двух лучей (см. шаг 3.1 протокола). В этой экспериментальной настройки, два луча были пространственно collinearly сочетании дихроического зеркала. Предварительный шаг является выравнивание OPO и Ti:Sa так, что каждый достигает микроскопа. Затем, рассматривая OPO в качестве эталонного луча и пользуясь детектором чувствительного к позиции, Ti:Sa пространственно перекрывается с OPO.
Вторым важным аспектом является временное перекрытие двух лучей (см. шаг 3.2 протокола). Даже если пучки насоса и OPO идеально синхронизированы9, так как они следуют несколько иными путями пучка внутри корпуса OPO, при выходе OPO они имеют задержку во времени около 5 нс и пространственную разницу в 5 см. Поэтому Ti:Sa и OPO требуют повторного времени оптически для обеспечения временного перекрытия в выборке. Это обычно достигается с тонко настраиваемым оптической линией задержки, которая в этом случае вставляется между Ti:Sa и микроскопом (см. рисунок 1). Для получения временного перекрытия двух лучей используются два метода. Первый осуществляется с использованием быстрого PD и осциллоскопа, в то время как второй основан на авто- и кросс-оптических корреляциях. Используя первый метод, получается грубое перекрытие двух лучей (неопределенность 10 сц), в то время как точное временное перекрытие двух лучей получается с помощью кросс-коррелятора (разрешение 1 fs).
Третьим важным аспектом является выравнивание двух лучей внутри микроскопа (см. шаг 3.3 протокола). Предварительное наблюдение белого света образца позволяет индивидуовать желаемое поле зрения (FOV). После этого лазерные лучи, попадая в микроскоп по боковому порту микроскопа, выравниваются для того, чтобы достичь PD, установленного на верхней части(рисунок 3). Однако для правильного приобретения изображения требуется установка ряда параметров (например, размер пикселя и время обитать пикселей). Частота выборки должна соблюдать ограничения, наложенные теорему Нюквиста для сохранения всей информации в изображении, в то время как для правильного соответствия между пространственными координатами пикселей и значением SRS измеряется в каждом пикселе, время интеграции LIA должен быть равным или сопоставимым с пиксельным временем пребывания.
На заключительном этапе выравнивания микроскопа проводятся многочисленные тесты для оптимизации пространственного и временного выравнивания (см. шаг 3.4 протокола). Для оптимизации пространственного перекрытия приобретен ряд изображений передачи (TI) для Ti:Sa и OPO. В TI используется один луч, а интенсивность передаваемого луча из образца измеряется PD. В случае TI реализованo OPO, сигнал выхода PD непосредственно подключен к карте PCI, в то время как в случае TI реализованы Ti:Sa, pd выходной сигнал подключен к LIA и аналоговый выход LIA подключен к карте PCI. Передача изображения очень полезны для оптимизации FOV, освещение, фокусное положение целей микроскопа и проверить, если двалуча пространственно перекрываются 6,7,8.
Оптимизация височного перекрытия насоса и пера пучка зонда осуществляется путем сканирования линии задержки с помощью ступеней 0,001 мм, соответствующих сдвигу в 3,3 fs, и проведения измерения SRS в одной точке образца полистирола 3 мкм в диаметре. Амплитуда сигнала SRS измеряет значения от LIA, как функция задержки зонд-насоса, и обеспечивает максимальное соответствие с точным временным перекрытием двух лучей6,7,8. Прежде чем завершить, следует отметить, что все обсуждаемые шаги являются обязательными для получения высококачественного изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Запуск лазерной системы
- Проверьте, поддерживается ли температура охладителей при температуре или ниже 20 градусов по Цельсию.
- Проверьте, работает ли блок контроля влажности должным образом, а влажность поддерживается на уровне около 40%.
- Включите лазер Ti:Sa, строго следуя инструкциям в руководстве.
- Установите длину волны до 810 нм.
- Включите OPO и подключенный мини-компьютер. Запустите приложение, которое управляет лазером OPO.
- Выберите обход, если при выходе из коробки OPO требуется 100% лазерного выхода Ti:Sa.
- Отбрасуйте шунтирование, если 20% лазерного выхода Ti:Sa и лазерного выхода OPO необходимы при выходе из коробки OPO.
- Откройте затвор Ti:Sa и отпустите балку Ti:Sa на вход OPO.
- Освободите два лазерных луча на выходе OPO, нажав сигнал-аут и выкачивание.
- Подождите, пока оба лазера Ti:Sa и OPO стабилизируются (около 45–60 мин).
- Проверьте место луча на выходе из окна OPO для Ti:Sa и OPO с помощью карты детектора бумаги и проверьте мощность с помощью счетчика питания.
- Настройте длину лазерной волны OPO до 1076 нм.
- Уменьшите мощность до 10 мВт для каждого лазерного луча для выполнения выравнивания.
2. Настройка микроскопа
-
Внедрение высокочастотного метода передачи модуляции
- Выполняйте оптическую процедуру выравнивания модулятора таким образом, чтобы луч Ti:Sa входил и выходил без каких-либо искажений.
- Включите генератор функции и создайте сигнал TTL (квадратная волна с амплитудой No 5 В, смещение 2,5 В, частота 5 МГц).
- Разделите сигнал TTL на две части с помощью T-соединения; один для EOM, а другой для усилителя блокировки (LIA) (см. Рисунок2).
- Проверьте все уровни сигнала с помощью осциллоскопа.
- Включите LIA и подключите канал выхода генератора к справочному каналу LIA.
- Подключите выходной канал генератора к усилитель энергии высокого напряжения EOM.
- Включите усилитель и установите напряжение почти до максимального уровня. Мониторинг мощности луча на выходе из EOM.
-
Интеграция механического монтажа для фиксации PD и присвоения x и y относительного движения
ПРИМЕЧАНИЕ: С микроскопом вводится внешнее крепление, оснащенное микрометром, который имеет управление движением в направлениях x и y.- Маунт два этапа перевода путешествия, чтобы позволить движения вдоль x и y направления (см. Рисунок 3).
- Зафиксите сцену на столбе 1,5 "соответствующей высоты".
- Установите PD на внешнее горе.
- Увеличьте мощность луча в PD, регулируя позиции PD (x и y координаты) с помощью микрометров, прикрепленных к креплению (см. рисунок3).
3. Выравнивание микроскопа
- Пространственное перекрытие балок
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассматривая луч OPO в качестве эталона и пользуясь детектором, чувствительным к положению, Ti:Sa должен быть перекрыт С OPO в соответствии со следующей процедурой:- Выровнять OPO и Ti:Sa лазерных лучей так, чтобы они оба достигают микроскопа.
- Поместите детекторы датчиков положения лазерного луча в двух положениях между дихроческим зеркалом 1 и зеркалом 6, первое положение расположено близко к дихромного зеркалу 1, а второе близко к зеркалу 6. Для каждой позиции используйте датчики для обнаружения x и y координат луча OPO (следовать на рисунке1).
- Убедитесь, что x и y координаты лазерного луча Ti:Sa являются одинаковыми OPO в обоих положениях детекторов датчиков. Если в некоторых позициях координаты Ti:Sa и OPO не совпадают, настройте наклон соседнего зеркала, чтобы компенсировать разницу (следовать на рисунке 1).
- Следуйте той же процедуре, чтобы выровнять позиции Ti:Sa пучка по отношению к OPO для пути между M6-M7 (следовать рисунок 1).
- Временная синхронизация балок
- Использование быстрого фотодиода плюс осциллоскоп:
- Остановить распространение балок Ti:Sa и OPO и поместить быстрый детектор перед лучом OPO (между M6 и M7).
- Подключите сигнал триггера, предоставляемый лазерной коробкой Ti:Sa с осциллоскопом в канале 2.
- Подключите кабель детектора к осциллоскопу в канале 1 и визуализировать временный профиль OPO.
- Запись времени (abscissa), измеренного осциллоскопом, соответствующим его максимальному значению, а именно t1.
- Остановите луч OPO и отпустите луч Ti:Sa.
- Визуализируйте височной профиль Ti:Sa и запишите время (abscissa), соответствующее его максимальному значению, а именно t2.
- Свести к минимуму разницу между t1-t2, используя линию задержки для перекрытия двух лучей. В нашем случае минимальная измеримая разница составляет 10 с.
- Удалите быстрый детектор между M6 и M7.
- Использование автокоррелятора:
ПРИМЕЧАНИЕ: На схематической диаграмме, показанной на рисунке 1, устанавливается автокоррелатор, не мешая оптическим путям балок. Кроме того, дополнительное зеркало вводится и устанавливается на флип-флопе горе (называется FFM / AM) между M6 и M7, чтобы отвлечь луч в автокоррелатор.- Переверните AM, чтобы направить луч в автокоррелатор.
- Остановите Ti:Sa и освободите OPO.
- Установите пучка регулировки расстояния винт акортерелятор в нормальное положение (8,35 мм).
- Питание на контроллере автокоррелятора и запустить программное приложение на персональном компьютере, контролируя его.
- Проект OPO луч от FFM / AM к вхотворной зеркало в автокоррелатор.
- Управление пятном отражения (с помощью карты детектора бумаги) луча на окне выравнивания автокоррелатора.
- В случае нелучевой или низкой интенсивности пучка отрегулируйте положение и ориентацию FFM/AM в оптимальной степени и попытайтесь настроить входное зеркало (установленное на автокоррелаторе) для максимального лазерного импульсного сигнала. Сигнал автокоррелатора получен, как показано на рисунке 5a.
- Остановите OPO и проект пучка Ti:Sa от FFM/AM для ввода зеркала в автокоррелатор. Повторите шаги 3.2.2.6 и 3.2.2.7. Сигнал автокоррелатора получен, как показано на рисунке 5b.
- Установите пучка регулировки расстояния винт амепорирования микрометр крест позиции (7,30 мм).
- Отпустите оба луча.
- Сканирование линии задержки для получения двух лучей OPO и Ti:Sa перекрывается. Сигнал кросс-коррелятора получен, как показано на рисунке 6.
- Переверните зеркало FFM/AM, чтобы лучи могли достигать M7 и сканировать головку микроскопа.
- Использование быстрого фотодиода плюс осциллоскоп:
- Выравнивание микроскопа
- Выполните белое световое микроскопическое наблюдение:
ПРИМЕЧАНИЕ: До микроскопических наблюдений убедитесь, что микроскоп правильно выровнен.- Подготовьте испытательный образец, который состоит из фосфатного буферного раствора, в котором рассеиваются полистирол-бусы диаметром 3 мкм. Раствор помещается внутри бутерброда из двух стеклянных горок.
- Включите микроскоп и источник питания белого света. Следуйте инструкции по наблюдению под белым светом.
- Используйте конденсатор для освещения образца. Используйте цель 60x для сбора света. Поместите образец на сцену. Оптимизируйте фокусное положение цели микроскопа 60x.
- Выберите интерес fOV. Возьмите CCD изображение образца(Рисунок 7).
- Выключите источник питания белого света.
-
Выравнивание микроскопа с фемтосекундными лазерными лучами: OPO и Ti:Sa
- Удалите конденсатор с помощью кнопки эвакуации, чтобы временно втянуть объектив объективного микроскопа 60x. Сместите объектив объективного микроскопа 60x с оптического пути, вращая носовой части.
- Установите детектор к верхней части микроскопа с помощью внешнего механического крепления. Подключите выход детектора через фильтр с низким проходом 50 -10 с осциллоскопом и мониторинг сигнала OPO.
- Включите процессор, который управляет головой сканера. Проект луча OPO в головку сканера микроскопа.
- Проверьте положение луча внутри микроскопа, убедитесь, что расположение луча находится в центре или вблизи центра.
- Убедитесь, что положение луча внутри головы PD находится в центре.
- Увеличьте мощность, измеряемую детектором с помощью переводчика x-y.
- Переключите луч от OPO к Ti:Sa и убедитесь, что максимальный сигнал также получен для титаново-сапфирового лазера. THis указывает на то, что оба луча хорошо выровнены.
- Завершите выравнивание луча, вводя объектив объективного объектива 60x микроскопа и вращая назад носовой части.
- Используйте кнопку перефокусировки на микроскопе, чтобы восстановить завершенный фокус на объектив еленки 60x микроскопа.
- Поместите цель с увеличением 40x вместо конденсатора, не касаясь или нарушая образец.
- Выполните белое световое микроскопическое наблюдение:
- Оптимизация пространственной и временной синхронизации балок
- Временная синхронизация
- Установите мощность Ti:Sa и OPO, измеренную перед микроскопом, до 30 мВт для обоих лучей. Установите длину волны OPO в другое значение по отношению к предыдущему, так что насос и зонд не находятся в резонансе с колебателивой частотой бисера.
- Выпустите оба луча (Ti:Sa и OPO), чтобы они вошли в микроскоп.
- Запустите линию сканирования компьютеризированной переводчика и запишите измеренную интенсивность ПО LIA для каждой позиции линии задержки. Подождите, пока сканирование строки задержки не будет завершено. Полученный височно-временной профиль визуализирован на рисунке 8а.
- Установите длину волны OPO до 1076 нм снова так, что насос и зонд находятся в резонансе с частотой колебаний бисера. Повторите шаг 3.4.1.3 (полученный височной профиль визуализирован на рисунке 8b).
- Установите полученное положение перекрываемого луча в линии задержки для получения изображений SRS.
- Пространственная синхронизация балок
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения передачи полезны для оптимизации FOV, освещения и координационного положения целей микроскопа, а также для проверки, если два луча пространственно перекрываются.- Приобретение изображения передачи OPO
- Остановите балку Ti:Sa и уменьшите мощность OPO до 8 мВт.
- Подключите считыватель детектора к карте получения данных.
- Запустите программу сбора данных вместе с консолью сканирования микроскопа.
- Сохранить файл и обработать данные, чтобы получить изображение. Необработанное изображение отображается на рисунке 9a.
- Передача изображения приобретение Ti:Sa
- Остановите балку OPO и уменьшите мощность Ti:Sa до 2,5-4,5 мВт.
- Подключите детектор к считыванию LIA и LIA с картой для сбора данных.
- Повторите шаги 3.4.2.1.3 и 3.4.2.1.4. Необработанное изображение отображается на рисунке 9b.
- Приобретение изображения передачи OPO
- Временная синхронизация
4. Приобретение изображений SRS
ПРИМЕЧАНИЕ: Для хранения данных реализован специальный алгоритм. Он поддерживает следующие форматы изображения: 512 px x 512 px и 256 px x 256 px, со временем приобретения 16 s, 8 s, 4 s и 2 s.
- Введите стопку фильтров между 40x цель юбиляра и PD для удаления импульсов насоса (Ti:Sa) и приобрести только сигнал Стокса (OPO).
- Установите сигнал насоса до 810 нм с сфокусированной мощностью 8 мВт и сигналом зонда до 1076 нм с сфокусированной мощностью 8 мВт, чтобы исследовать типичную связь C-H полистирола (Раман сдвиг 3054 смNo1).
- Подключите детектор к считыванию LIA и LIA к карте сбора данных.
- Установите формат пикселей приобретения изображения в рамках требования и установите время приобретения.
- Запустите программу, управляюую контроллером микроскопа.
- Запустите специальную программу алгоритма, которая действует как синхронизация между контроллером микроскопа, системой обнаружения и DA ( см. рисунок4).
- Сохранить файл матрицы после завершения приобретения.
- Импортируйте файл необработанных данных и сохраняйте изображение в требуемом формате (обычно сохраненном в формате .tif) с помощью программного обеспечения ImageJ. Изображение показано на рисунке 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример измерения SRS (т.е. измерение SRS в одной точке выборки) сообщается на рисунке 7. Когда лучи не перекрываются во времени или пространстве, полученный результат сообщается на рисунке 8a. Внерезонанс амплитуда сигнала, измеренного LIA, равна нулю, в то время как фаза сигнала измеряется скачками LIA между отрицательными и положительными значениями. В то время как, когда лучи перекрываются в пространстве, перемещая линию задержки в соответствующем диапазоне, полученные результаты сообщаются на рисунке 8b. Сигнал, измеряемый LIA, увеличивается и достигает своего максимума, когда лучи идеально перекрываются во времени, в то время как фаза начинает достигать фиксированного значения во время, когда балки перекрываются во времени.
Изображения поглощения, полученные с помощью одного луча (Ti:Sa или OPO) одного и того же полистирола, представлены на рисунке 9a, с прутьями масштаба 6 мкм. Для того, чтобы получить изображения SRS, линия задержки устанавливается в положение, достигнутое на рисунке 7b,типичное изображение SRG отображается на рисунке 10 с баром масштаба 6 мкм.
Рисунок 1: Схематическая компоновка системы микроскопа f-SRS. OPO - оптический параметрический осциллятор; Ти:Са - титано-сапфировый лазер; M1-M7' фемтосекундные широкополосные зеркала; FFM/AM - Флип-Флоп Зеркало / Зеркало автокоррелатора; DM1, DM2 - дихроические зеркала; DL - Линия задержки; Ac и автокоррелатор ; EOM - электрооптический модулятор; FG - генератор функций; ГМ и зеркало Гальво; Obj1, Obj2 - цели микроскопа; PD - фотодиод; Система сбора данных ДаЗ; ПК и персональный компьютер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема высокочастотного метода передачи модуляции. На рисунке всета представлены два лазерных луча перед взаимодействием внутри образца и модифицированный зонд из-за взаимодействия зонда и насоса внутри образца. Время представлено в n. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представление фотодиодного крепления с механической системой крепления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Схема системы сбора данных. PD - фотодиод, LIA - усилитель блокировки, система обнаружения DS, MC - управление микроскопом, система сбора данных, ПК и персональный компьютер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Функция автокоррелятора OPO (a) и Ti:SA (b). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Функция перекрестной корреляции OPO и Ti:Sa. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: CCD изображение полистирола шарики.
Рисунок 8: Амплитуда и фаза сигнала SRS, измеряемого усилителем блокировки: от резонанса (слева) и в резонансе (справа) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 9: Передача изображений полистирола, достигнутых OPO (a) и Ti:Sa (b). Шкала бар No 16 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 10: SRS изображение полистирола бусы. Шкала бар No 12 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроскопия SRS вывела изображения без этикетки на новые высоты, особенно в исследованиясложных биологических структурах, таких как липиды, которые имеют основополагающее значение для клеток и клеточной архитектуры. Липиды участвуют в нескольких физиологических путей, таких как производство биологических мембран, и они служат в качестве биосинтетических прекурсоров и преобразователей сигналов10. Липиды упаковываются в специализированные внутриклеточные органеллы, также называемые липидными каплями (ЛД). Их диаметры варьируются от нескольких десятков нанометров до десятков микрометров11,12. LDs не только участвовать в изобилии в жировой и стероидных производства клеток, но также присутствуют в других клеточных линий. LDs сотрудничать в нескольких физиологических процессов, таких как липидное хранение. Они занимают видное место в общих патологий (например, измененный метаболизм холестерина)13,14.
Традиционно визуализация липидов достигается с помощью флуоресценционной микроскопии и нейтральной липидной специфической маркировки фиксированных клеток10. Следует отметить, что, как липиды меньшего размера по сравнению с белками и ДНК, структурные и функциональные изменения и нежелательные артефакты могут произойти при добавлении флюорофоров15,16. SRS было показано, чтобы быть мощным для изучения липидов богатых структур. Липиды в изобилии в C-H2 групп. Таким образом, относительно изолированные пики, связанные с C-H облигаций колебательных состояний на 2845 см-1 в их Раман спектры обеспечивают уникальную подпись для липидов внутри клетки. К сожалению, поскольку дифферезационные вибрационные сигнатуры конечны, довольно трудно отличить биомолекулу-мишень от других родственных видов внутри клеток, которые имеют аналогичные химические связи. Тем не менее, можно добавить крошечные Раман-активные вибрационные зонды (например, алкины и стабильные изотопы) для получения специфичности для визуализации малых биомолекул17.
Для биологических и биомедицинских in vivo приложений, одновременное отображение различных химических видов в данном образце необходимо для инвестирования совместного распределения и динамических корреляций между парами биомолекул18,19. Поэтому было прилагано много усилий для получения многочисленных химических контрастов. В простейших варианте многоцветной визуализации, для изображения различных режимов Рамэн образца, частота пучка насоса или Пучков пучка настроены в последовательных сканах18. Однако использование подхода к настройке длины волны может привести к потере информации о совместной локализации различных режимов Рамына, особенно когда образец находится в динамической среде18.
Как следствие нелинейного возбуждения, SRS предлагает внутренние 3D-разрешительные возможности выбранной химической связи в биологических образцах20. Реконструкция объема выбранной химической связи и ее пространственного распределения может быть просто достигнута путем сбора изображений SRS на различных фокусных плоскостях вдоль оси z. Поскольку изображения приобретаются с высоким пространственным и временным разрешением, могут быть получены другие части ключевой информации (например, 3D-структура, химический состав и т.д.) о биологическом образце.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Мы признательны В. Туфано из IMM CNR за его ценную техническую помощь и Джакомо Коцци, специалистпоув по продуктам от Nikon Instruments, за полезные обсуждения и постоянную поддержку. Эта работа была частично поддержана итальянскими национальными оперативными программами PONa3 00025 (BIOforIU) и крупномасштабным проектом общеевропейской исследовательской инфраструктуры Euro-Bioimaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
