Summary
In dit manuscript wordt de implementatie beschreven van een gestimuleerde Raman verstrooiing (SRS) Microscoop, verkregen door de integratie van een SRS experimentele opstelling met een laser scanning microscoop. De SRS-Microscoop is gebaseerd op twee femtosecondelaser (FS) laserbronnen, een TI-Sapphire (TI: SA) en gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (OPO).
Abstract
Gestimuleerd Raman verstrooiing (SRS) microscopie maakt gebruik van near-infrarood excitatie licht; Daarom deelt het veel multi-photon microscopische Imaging-eigenschappen. SRS Imaging modaliteit kan worden verkregen met behulp van commerciële laserscannende microscopen door het uitrusten met een niet-gedescande voorwaartse detector met de juiste band pass-filters en het detectie schema van de lock-in versterker (LIA). Een schematische lay-out van een typische SRS-Microscoop omvat de volgende: twee gepulseerde laserstralen, (d.w.z. de pomp en sonde in een scan Microscoop), die moet worden overlapt in zowel ruimte en tijd op het beeldvlak, vervolgens gericht door een Microscoop doelstelling in het monster door twee scan spiegels (SMs), die de brandpunt in een x-y-vlak raster. Na interactie met het monster worden verzonden uitgangs pulsen opgevangen door een bovenobjectief en gemeten door een voorwaartse detectiesysteem dat in een omgekeerde Microscoop is ingebracht. Pomp pulsen worden verwijderd door een stapel optische filters, terwijl de sonde pulsen die het resultaat zijn van het SRS-proces dat zich voordoet in het brand volume van het preparaat, worden gemeten met een fotodiode (PD). De aflezen van de PD wordt door de LIA gedemoduleerd om de Modulatiediepte te extraheren. Een tweedimensionale (2D) afbeelding wordt verkregen door de voorwaartse detectie-eenheid te synchroniseren met de Microscoop Scaneenheid. In dit document wordt de implementatie van een SRS-Microscoop beschreven en met succes gedemonstreerd, evenals de rapportage van etiketten vrije beelden van polystyreen kralen met diameters van 3 μm. Het is vermeldenswaard dat SRS microscopen zijn niet commercieel beschikbaar, dus om te profiteren van deze kenmerken, de zelfgemaakte constructie is de enige optie. Aangezien SRS microscopie populair wordt op veel gebieden, wordt aangenomen dat deze zorgvuldige beschrijving van de implementatie van de SRS-Microscoop zeer nuttig kan zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap.
Introduction
In Life Science-toepassingen is SRS microscopie een krachtig hulpmiddel voor label vrije beeldvorming. Het basisidee van SRS microscopie is het combineren van de sterkte van trillational contrast en de mogelijkheid om beelden te verwerven in een paar seconden.
SRS is een proces waarbij het frequentieverschil tussen twee laserstralen frequenties (pomp signaal en Stokes signaal op verschillende frequenties) overeenkomt met de moleculaire trilling van een onderzocht monster, waardoor gestimuleerd Raman verstrooiing en een aanzienlijke verhoging van het Stokes signaal. In tegenstelling tot lineaire Raman-spectroscopie vertoont SRS een niet-lineaire afhankelijkheid van de binnenkomende licht velden en produceert het samenhangende straling. SRS heeft twee fundamentele voordelen: 1) snelheid, waardoor afbeeldingen minder gevoelig zijn voor artefacten die voortvloeien uit monster beweging of degradatie, en 2) een uitstekende signaal-ruis verhouding (SRV). Bovendien vertoont SRS een spectrum dat identiek is aan de spontane Raman, en het SRS-signaal is lineair evenredig aan de concentratie van de chemische obligatie die opgewonden is1,2,3,4, 5.
In onze Microscoop is een femtosecondelaser (FS) SRS experimentele set-up geïntegreerd met een omgekeerde optische Microscoop uitgerust met een snelle spiegels Scanning Unit (Figuur 1)6,7,8. Twee gepulseerde laserbronnen worden gebruikt om deze Microscoop te implementeren. De eerste is een FS-TI: SA met een puls duur van ongeveer 140 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 680-1080 nm. De tweede, gebruikt als sonde straal en gepompt door TI: SA, is een femtosecondelaser gesynchroniseerde optische parametrische oscillator (SOPO), met een puls duur van ongeveer 200 FS, herhalingssnelheid van 80 MHz, en emissie golflengten in het bereik van 1000-1600 nm. Opgemerkt moet worden dat de minimale foton energieverschil tussen de TI: SA en Sopo Beam is 2500 cm-1. Daarom, met behulp van deze combinatie van lasersystemen, kan alleen de hoge frequentie C-H regio (2800-3200 cm-1) Raman spectra worden verkend6,7,8.
Om een SRS-Microscoop op te zetten, zijn er drie cruciale punten die in de opeenvolgende paragrafen worden beschreven. De eerste is de implementatie van een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor een beschrijving). In een SRS-experimenteel onderzoek is een cruciale parameter de gevoeligheid van het systeem. Een SRS-signaal wordt gedetecteerd als een kleine verandering in de intensiteit van excitatie balken; Daarom kan het worden beschadigd door laserintensiteit ruis en schot ruis. Dit probleem kan worden overwonnen door de integratie van dit systeem met een High-Frequency modulatie overdrachtsmethode (Zie Figuur 2 en stap 2,1 van het protocol voor meer informatie). Bij deze methode wordt een elektro-optische modulator (EOM) gebruikt om de pomp te moduleren. De modulatie overgebracht naar de sonde straal kan vervolgens worden gedetecteerd door een PD na het blokkeren van de pomp balk met een stapel optische filters [gestimuleerd Raman Gain (SRG) detectiemodus]. De PD-uitgang wordt met een low pass-filter verbonden aan een lock-in versterker (LIA), die het gemeten signaal demoduleert. Door de modulatie frequentie van de straal naar frequenties boven 1 MHz te verhogen, kan de intrinsieke limiet van PDs worden verkregen.
Het tweede punt dat u moet overwegen is de installatie van een mechanische steun die het mogelijk maakt om voorwaartse detectie uit te voeren en tegelijkertijd de observatie van de Microscoop in brightfield te behouden. Daarnaast moet het geluid verminderen door mechanische trillingen tijdens het genereren van beelden en om de precieze herpositionering van het detectiesysteem mogelijk te maken (Zie Figuur 3 en stap 2,2 van het Protocol).
De derde is de synchronisatie van het signaal dat door het fase gevoelige detectie schema wordt verkregen, waarbij de straal op het monster wordt geplaatst dat door de scan kop van de Microscoop wordt bewaakt. Om afbeeldingen te realiseren, hebben de SMs drie TTL-signalen nodig die beschikbaar worden gesteld door de Microscoop-controller die is aangesloten op de scan hoofdeenheid: pixel klok, lijn synchronisatie en frame synchronisatie. De synchronisatie wordt bereikt door het besturen van een PCI-kaart, de drie TTL-signalen en het verkrijgen van een spanningssignaal op het uitgangskanaal van Lia6,7,8. Een zelfgemaakte software is ontwikkeld en beschreven eerder6,7,8, terwijl de hardware van het synchronisatie systeem wordt gerapporteerd in Figuur 4.
Een fundamentele procedure bij het uitvoeren van SRS Imaging is Microscoop uitlijning. Het wordt gerealiseerd in de loop van vier stappen, die in de opeenvolgende alinea's worden beschreven. De eerste is de ruimtelijke overlapping van twee stralen (zie stap 3,1 van het Protocol). In deze experimentele opstelling, de twee balken waren ruimtelijk collinearly gecombineerd door een dichroïde spiegel. De voorbereidende stap is de uitlijning van OPO en TI: sa zodat elk de Microscoop bereikt. Dan, gezien OPO als een referentie straal en gebruik te maken van een positie gevoelige detector, de TI: SA is ruimtelijk overlapt naar OPO.
Het tweede cruciale aspect is de temporele overlapping van twee stralen (zie stap 3,2 van het Protocol). Zelfs als de pomp en OPO balken zijn perfect gesynchroniseerd9, omdat ze iets verschillende straal paden in de OPO behuizing volgen, bij de OPO exit hebben ze een tijdvertraging van ongeveer 5 NS en ruimtelijke verschil van 5 cm. Daarom moeten TI: SA en OPO worden opnieuw getimede met optisch om te zorgen voor tijdelijke overlapping op het voorbeeld. Dit wordt meestal bereikt met een fijnaftunable optische vertragings lijn, die in dit geval tussen de TI: SA en Microscoop wordt ingebracht (Zie Figuur 1). Om de temporele overlap van twee stralen te verkrijgen, worden twee technieken gebruikt. De eerste wordt uitgevoerd met behulp van een snelle PD en oscilloscoop, terwijl de tweede is gebaseerd op auto-en cross-optische correlaties. Met behulp van de eerste techniek wordt een ruwe overlapping van twee stralen verkregen (onzekerheid van 10 PS), terwijl een nauwkeurige temporele overlap van twee stralen wordt verkregen met behulp van een kruis correlator (resolutie van 1 FS).
Het derde cruciale aspect is de uitlijning van de twee stralen in de Microscoop (zie stap 3,3 van het Protocol). Een voorlopige witte licht observatie van het monster maakt het mogelijk om het gewenste gezichtsveld (FOV) te individueren. Daarna worden laserstralen, die de Microscoop door een zijpoort van de Microscoop binnenkomen, uitgelijnd om de PD te bereiken die op het bovenste deel is gemonteerd (Figuur 3). Voor een correcte beeld verwerving is het instellen van een aantal parameters echter vereist (bijvoorbeeld pixeldimensie en pixel dwelltijd). De bemonsteringsfrequentie moet de door de stelling van Nyquist opgelegde beperking respecteren om alle informatie in een afbeelding te behouden, terwijl voor een juiste correspondentie tussen de ruimtelijke coördinaten van pixels en SRS-waarde, gemeten in elke pixel, de integratie tijd van LIA moet gelijk zijn aan of vergelijkbaar zijn met de pixel dwelltijd.
In de laatste stap van de Microscoop-uitlijning worden tal van tests uitgevoerd om de ruimtelijke en temporele uitlijning te optimaliseren (zie stap 3,4 van het Protocol). Een aantal transmissie beelden (TI) voor zowel TI: SA en OPO worden verworven om de ruimtelijke overlap te optimaliseren. In een TI wordt een enkele straal gebruikt, en de uitgezonden straal intensiteit van het monster wordt gemeten door een PD. In het geval van TI gerealiseerd door OPO, het PD-uitgangssignaal is direct verbonden met PCI-kaart, terwijl in het geval van TI gerealiseerd door TI: SA, het PD-uitgangssignaal is aangesloten op LIA en analoge uitgang van LIA is aangesloten op PCI-kaart. De transmissie beelden zijn zeer nuttig voor het optimaliseren van de FOV, de verlichting, de focale positie van de Microscoop doelstellingen en om te controleren of de twee stralen ruimtelijk overlapt6,7,8.
De optimalisering van de tijds overlap van de pomp en de sonde straal wordt verkregen door het scannen van de vertragings lijn met stappen van 0,001 mm overeenkomend met een 3,3 FS tijdverschuiving en het uitvoeren van een SRS-meting in één punt van een polystyreen kraal monster 3 μm in diameter. De amplitude van een SRS-signaal meetwaarden van Lia, als een functie van de sonde-pomp vertraging, en biedt een maximum overeenkomend met exacte temporele overlapping van de twee stralen6,7,8. Voordat u afsluit, moet worden opgemerkt dat alle besproken stappen verplicht zijn om een beeld van hoge kwaliteit te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het lasersysteem opstarten
- Controleer of de temperatuur van de koelmachines bij of onder 20 °C wordt gehandhaafd.
- Controleer of de vochtigheids regeleenheid goed werkt en of de luchtvochtigheid bij een waarde van ongeveer 40% blijft.
- Zet de TI: sa-laser aan, Volg strikt de instructies in de handleiding.
- Stel de golflengte in op 810 nm.
- Schakel de OPO en de aangesloten mini-computer in. Voer de toepassing die de OPO-Laser bestuurt.
- Selecteer bypass als 100% van de TI: sa Laser uitgang vereist is bij de uitgang van de OPO doos.
- Deselecteer bypass als 20% van de TI: sa Laser output en de OPO Laser uitgang nodig zijn bij de uitgang van de OPO doos.
- Open de sluiter van TI: SA en laat de TI: sa Beam los naar de OPO ingang.
- Laat de twee laserstralen op de OPO-uitgang los door op Signal-out en Pump-outte klikken.
- Wacht tot beide lasers TI: SA en OPO gestabiliseerd zijn (ongeveer 45 – 60 min).
- Controleer de beamspot bij de uitgang van de OPO box voor zowel TI: SA en OPO met behulp van een papier detector kaart en controleer de stroom met behulp van een Vermogensmeter.
- Tune de OPO Laser golflengte tot 1076 nm.
- Verminder het vermogen tot ~ 10 mW voor elke laserstraal om de uitlijning uit te voeren.
2. de Microscoop instellen
-
Implementatie van hoge frequentiemodulatie overdrachtsmethode
- Voer de optische uitlijnings procedure van de modulator zodanig uit dat de TI: sa Beam zonder vervorming binnenkomt en verlaat.
- Schakel de functiegenerator in en Genereer een TTL-signaal (vierkante Golf met amplitude = 5 V, offset = 2,5 V, frequentie = 5 MHz).
- Verdeel het TTL-signaal in twee delen met behulp van een T-splitsing; een voor EOM en de andere voor de lock-in versterker (LIA) (Zie Figuur 2).
- Controleer alle signaalniveaus met een oscilloscoop.
- Schakel de LIA in en verbind het generator-uitgangskanaal met het referentie kanaal van de LIA.
- Sluit het generator-uitgangskanaal aan op de hoogspannings versterker van EOM.
- Zet de versterker aan en stel de spanning in op bijna het maximale niveau. Monitor de straalstroom bij de uitgang van EOM.
-
Integratie van mechanische montage om PD te bevestigen en x-en y-relatieve beweging toe te wijzen
Opmerking: met de Microscoop wordt een externe steun geïntroduceerd, uitgerust met een micrometer die bewegingscontrole heeft in x-en y-richtingen.- Monteer twee reis vertalings stadia om bewegingen langs de x-en y-richtingen mogelijk te maken (Zie Figuur 3).
- Bevestig het podium op een Ø 1,5 "paal van de juiste hoogte.
- Monteer de PD op een externe steun.
- Maximaliseer het vermogen van de straal bij PD, stel de PD-posities (x-en y-coördinaten) in met behulp van de micrometers die aan de steun zijn bevestigd (Zie Figuur 3).
3. uitlijning van de Microscoop
- Ruimtelijke overlapping van de stralen
Opmerking: gezien de OPO Beam als referentie en gebruik te maken van een positie gevoelige detector, de TI: sa moet worden overlapt naar OPO volgens de volgende procedure:- Lijn de OPO en de TI: sa laserstralen zodat ze beide de Microscoop bereiken.
- Plaats de laserstraal positiesensoren detectoren in twee standen tussen dichroïde spiegel 1 en spiegel 6, de eerste positie bevindt zich dicht bij de dichroïde spiegel 1 en de tweede bevindt zich dicht bij spiegel 6. Gebruik voor elke positie de sensoren om de x-en y-coördinaten van de OPO Beam te detecteren (Volg afbeelding 1).
- Controleer of de x-en y-coördinaten van de TI: sa-laserstraal dezelfde OPO zijn in beide posities van de detectoren van de sensoren. Als in sommige posities de coördinaten van TI: SA en OPO niet samenvallen, Tune de Tilt van de aangrenzende spiegel om het verschil te compenseren (Volg Figuur 1).
- Volg dezelfde procedure om de TI: sa Beam posities uit te lijnen met betrekking tot OPO voor het pad tussen M6-M7 (Volg Figuur 1).
- Tijdelijke synchronisatie van de stralen
- Gebruik van de Fast fotodiode plus oscilloscoop:
- Stop propagatie van de TI: SA en OPO balken en plaats een snelle detector voor de OPO Beam (tussen M6 en M7).
- Verbind het triggersignaal dat door de TI: sa laser box met een oscilloscoop in kanaal 2 wordt geleverd.
- Verbind de detector kabel met de oscilloscoop in kanaal 1 en visualiseer de OPO temporele profiel.
- Noteer de tijd (abscissa) gemeten door de oscilloscoop die overeenkomt met de maximale waarde, namelijk T1.
- Stop de OPO Beam en laat de TI: sa Beam los.
- Visualiseer de TI: sa temporele profiel en noteer de tijd (abscissa) die overeenkomt met de maximale waarde, namelijk T2.
- Minimaliseer het verschil tussen T1-T2 met behulp van de delay-lijn om de twee stralen te overlappen. In ons geval is het minimale meetbare verschil 10 PS.
- Verwijder de snelle detector tussen M6 en M7.
- Gebruik van de autocorrelator:
Opmerking: in het schematische diagram in Figuur 1 wordt een autocorrelator geïnstalleerd zonder dat de optische paden van de balken worden verstoord. Daarnaast wordt een extra spiegel geïntroduceerd en gemonteerd op een flip-flop mount (aangeduid als FFM/AM) tussen M6 en M7 om de straal in de autocorrelator af te leiden.- Draai de AM om de straal naar de autocorrelator te richten.
- Stop de TI: SA en laat de OPO.
- Stel de straal afstand instelschroef micrometer van de autocorrelator in op normale positie (8,35 mm).
- Schakel de autocorrelatorcontroller in en start de softwaretoepassing op de personal computer die deze bestuurt.
- Projecteer de OPO Beam van FFM/AM naar de input mirror in de autocorrelator.
- Bedien de reflectie spot (met behulp van een papieren detector kaart) van de balk op het uitlijnings venster van de autocorrelator.
- In het geval van een no-Beam of een lage bundelintensiteit, pas de positie en oriëntatie van FFM/AM in de optimale mate, en proberen om de input mirror aan te passen (gemonteerd op de autocorrelator) om het laserpuls signaal te maximaliseren. Het autocorrelatorsignaal wordt verkregen zoals weergegeven in figuur 5a.
- Stop de OPO en het project van de TI: sa Beam van FFM/AM naar input mirror in de autocorrelator. Herhaal de stappen 3.2.2.6 en 3.2.2.7. Het autocorrelatorsignaal wordt verkregen zoals weergegeven in Figuur 5b.
- Stel de bundel afstand instelschroef micrometer in op Kruis positie (7,30 mm).
- Laat beide bundels los.
- Scan de vertragings lijn om de twee stralen te verkrijgen OPO en TI: sa overlapt. Het cross-correlatorsignaal wordt verkregen zoals weergegeven in Figuur 6.
- Flip de spiegel FFM/AM zodat de balken M7 en scan hoofd van de microscoop kan bereiken.
- Gebruik van de Fast fotodiode plus oscilloscoop:
- Microscoop uitlijning
- Voer witte licht microscopische observatie uit:
Opmerking: zorg er vóór de microscopische observatie voor dat de Microscoop goed is uitgelijnd.- Bereid het testmonster, dat bestaat uit een fosfaatbufferoplossing waarbij polystyreen kralen met een diameter van 3 μm worden gedispergeerd. De oplossing is geplaatst in een sandwich van twee glazen dia's.
- Schakel de Microscoop en de voeding van wit licht in. Volg de handleiding voor observatie onder wit licht.
- Gebruik een condensor om het monster te verlichten. Gebruik de doelstelling van 60x om licht te verzamelen. Plaats het monster op het podium. Optimaliseer de focale positie van de 60x-Microscoop doelstelling.
- Selecteer de FOV van belang. Neem een CCD-beeld van het monster (Figuur 7).
- Schakel de voeding van wit licht uit.
-
Microscoop uitlijning met femtosecondelaser laserstralen: OPO en TI: SA
- Verwijder de condensor met behulp van de ontsnappings knop om de 60x Microscoop objectief lens tijdelijk op te trekken. Verplaats de 60x Microscoop objectief lens van het optische pad, draai het neusstuk.
- Monteer de detector op het bovenste deel van de microscoop met behulp van de externe mechanische steun. Verbind de detector uitgang via een low-pass filter van 50 Ω op de oscilloscoop en bewaak het OPO signaal.
- Schakel de processor in die de hoofd van de scanner bestuurt. Projecteer de OPO Beam in de scanner hoofd van de Microscoop.
- Controleer de positie van de straal in de Microscoop, zorg ervoor dat de locatie van de straal zich in het midden of in de buurt van het centrum bevindt.
- Controleer of de positie van de straal binnenin het hoofd van de PD in het midden staat.
- Maximaliseer het vermogen gemeten door de detector met behulp van een x-y vertaler.
- Schakel de straal van OPO naar TI: SA en controleer of er ook een maximum signaal wordt verkregen voor de Titanium-saffier laser. Dit geeft aan dat beide balken goed zijn uitgelijnd.
- Voltooi de uitlijning van de ligger, maak kennis met de 60x Microscoop objectief lens en draai het neusstuk terug.
- Gebruik de knop heroriënteren op de Microscoop om de gefinaliseerde focus terug te krijgen op de 60x Microscoop objectief lens.
- Plaats het objectief met vergroting 40x in plaats van de condensor zonder het monster aan te raken of te verstoren.
- Voer witte licht microscopische observatie uit:
- Optimalisatie van ruimtelijke en temporele synchronisaties van liggers
- Tijdelijke synchronisatie
- Stel de kracht van TI: SA en OPO gemeten voor de Microscoop tot 30 mW voor beide stralen. Stel de golflengte van OPO in op een andere waarde ten opzichte van de vorige, zodat de pomp en sonde niet in resonantie zijn met de trillationale frequentie van de kralen.
- Laat beide stralen (TI: SA en OPO) los zodat ze in de Microscoop komen.
- Voer de computergestuurde vertaler scan delay line uit en noteer de gemeten intensiteit door LIA voor elke positie van de vertragings lijn. Wacht tot het scannen van de delay-lijn is voltooid. Het verkregen temporele profiel wordt gevisualiseerd in figuur 8a.
- Stel de golflengte van OPO weer in op 1076 nm zodat de pomp en de sonde in resonantie zijn met de trillationale frequentie van de kralen. Herhaal stap 3.4.1.3 (het verkregen temporele profiel wordt gevisualiseerd in figuur 8b).
- Stel de verkregen overlappings positie in de vertragings lijn in om SRS-afbeeldingen te verkrijgen.
- Ruimtelijke synchronisatie van de stralen
Opmerking: de transmissie beelden zijn nuttig om de FOV, belichting en focale positie van de Microscoop doelstellingen te optimaliseren en om te controleren of de twee stralen ruimtelijk overlapt zijn.- Transmissie image acquisitie van OPO
- Stop de TI: sa Beam en verminder de OPO-kracht naar 8 mW.
- Sluit de melder uitlezen aan op de Data Acquisition Card.
- Voer het programma voor het verzamelen van gegevens uit samen met de Microscoop-scan console.
- Sla het bestand op en verwerk de gegevens om de afbeelding op te halen. De onbewerkte afbeelding wordt weergegeven zoals weergegeven in afbeelding 9a.
- Overdracht image acquisitie van TI: SA
- Stop de OPO Beam en verminder de TI: sa vermogen tot 2,5 – 4,5 mW.
- Verbind de detector met LIA en LIA-uitlezingen met de Data Acquisition Card.
- Herhaal de stappen 3.4.2.1.3 en 3.4.2.1.4. De onbewerkte afbeelding wordt weergegeven zoals weergegeven in figuur 9b.
- Transmissie image acquisitie van OPO
- Tijdelijke synchronisatie
4. SRS Image Acquisition
Opmerking: er is een specifiek algoritme gerealiseerd om gegevens op te slaan. Het ondersteunt de volgende beeldformaten: 512 PX x 512 PX en 256 PX x 256 px, met acquisitie tijden van 16 s, 8 s, 4 s, en 2 s.
- Introduceer een stapel filters tussen de 40x-doelstelling en PD om de pomp pulsen (TI: SA) te verwijderen en alleen het Stokes-signaal (OPO) te verwerven.
- Stel het pomp signaal in op 810 nm met een gefocust vermogen van 8 mW en het sonde signaal naar 1076 nm met een gefocust vermogen van 8 mW om een typische C-H-binding van polystyreen te onderzoeken (Raman-verschuiving van 3054 cm− 1).
- Verbind de detector met de LIA en LIA uitlezen tot de Data Acquisition Card.
- Stel de pixelindeling voor afbeeldings verwerving in volgens de vereiste en stel de aanschaf tijd in.
- Voer het programma uit dat de Microscoop-controller bestuurt.
- Voer het speciale algoritme programma uit dat fungeert als synchronisatie tussen de Microscoop controller, het detectiesysteem en de DAQ (Zie Figuur 4).
- Sla het matrix bestand op zodra de overname is voltooid.
- Importeer het onbewerkte gegevensbestand en sla de afbeelding op in de vereiste indeling (meestal opgeslagen in. TIF-indeling) met behulp van ImageJ-software. De afbeelding wordt weergegeven in afbeelding 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van SRS-meting (d.w.z. SRS-meting in één punt van het monster) wordt gerapporteerd in Figuur 7. Wanneer de balken niet in tijd of ruimte worden overlapt, wordt het verkregen resultaat gerapporteerd in figuur 8a. In Off-Resonance, de amplitude van het signaal gemeten door LIA is nul, terwijl de fase van het signaal gemeten door LIA springt tussen negatieve en positieve waarden. Overwegende dat, wanneer de liggers in de ruimte worden overlapt, de vertragings lijn in een passend bereik beweegt, de verkregen resultaten worden gerapporteerd in figuur 8b. Het signaal gemeten door LIA verhoogt en bereikt zijn maximum wanneer de balken perfect overlapt in de tijd, terwijl de fase begint te bereiken van een vaste waarde in de tijd waarin de balken worden overlapt in de tijd.
De absorptie beelden verkregen met behulp van een enkele straal (TI: SA of OPO) van dezelfde polystyreen kralen worden weergegeven in figuur 9a, b met schaal staven van 6 μm. Om de SRS-beelden te verwerven, wordt de vertragings lijn ingesteld op de positie die is bereikt in afbeelding 7b, wordt een typisch srg-beeld weergegeven in afbeelding 10 met een schaalbalk van 6 μm.
Figuur 1: schematische indeling van het f-SRS-Microscoop systeem. OPO = optische parametrische oscillator; TI: sa = Titanium-saffier laser; M1-M7 = femtotweede breedband spiegels; FFM/AM = flip-flop spiegel/Autocorrelator spiegel; DM1, DM2 = dichroïde spiegels; DL = vertragings lijn; AC = autocorrelator; EOM = elektro-optische modulator; FG = functiegenerator; GM = galvo spiegel; Obj1, Obj2 = Microscoop doelstellingen; PD = fotodiode; DAQ = data-acquisitie systeem; PC = Personal computer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schema van de overdrachtsmethode met hoge frequentiemodulatie. In de inzet figuur, de twee lasers stralen vóór de interactie in het monster en de gemodificeerde sonde als gevolg van interacties van de sonde en de pomp in het monster worden weergegeven. Tijd wordt weergegeven in NS. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: weergave van de fotodiode bevestiging met mechanisch bevestigingssysteem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: schematische voorstelling van het systeem voor gegevens acquisitie. PD = fotodiode, LIA = lock-in versterker, DS = detectiesysteem, MC = Microscoop regeling, DAQ = data-acquisitie systeem, PC = Personal computer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Autocorrelatorfunctie van Opo (a) en TI: SA (b). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: kruiscorrelatie functie van Opo en TI: SA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 7: CCD beeld van polystyreen kralen.
Figuur 8: amplitude en fase van het SRS-signaal gemeten door lock-in versterker: uit resonantie (links) en in resonantie (rechts) . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 9: transmissie beelden van polystyreen kralen die worden behaald door OPO (a) en TI: SA (b). Schaalbalk = 16 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 10: SRS afbeelding van polystyreen kralen. Schaalbalk = 12 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SRS microscopie heeft label-vrije beeldvorming naar nieuwe hoogten, vooral in studies van complexe biologische structuren zoals lipiden, die fundamenteel zijn voor cellen en cellulaire architectuur. Lipiden zijn betrokken bij meerdere fysiologische trajecten zoals productie van biologische membranen, en ze dienen als biosynthetische precursoren en signaal transducers10. Lipiden zijn verpakt in gespecialiseerde intracellulaire organellen, ook wel lipide druppeltjes (LDs). Hun diameters variëren van enkele tientallen nanometers tot tientallen micrometers11,12. LDs deel niet alleen overvloedig in adipose-en steroïde-producerende cellen, maar zijn ook aanwezig in andere cellijnen. LDs werkt samen in een aantal fysiologische processen zoals lipide-opslag. Ze zijn prominent aanwezig in gemeenschappelijke pathologieën (bijv. veranderde cholesterol metabolisme)13,14.
Traditioneel, visualisatie van lipiden wordt bereikt met behulp van fluorescentiemicroscopie en neutrale lipide-specifieke kleurstof-gelabelde vaste cellen10. Opgemerkt moet worden dat als lipiden kleiner zijn in vergelijking met eiwitten en DNA, structurele en functionele veranderingen en ongewenste artefacten kunnen optreden bij het toevoegen van fluorophores15,16. SRS is aangetoond dat ze krachtig zijn voor het bestuderen van lipide-rijke structuren. Lipiden zijn overvloedig in C-H2 groepen. Daarom bieden de relatief geïsoleerde pieken in verband met de vibrationele toestanden van de C-H-Bond op 2845 cm-1 in hun Raman-spectra een unieke handtekening voor lipiden in een cel. Helaas, omdat de differentieerbaar vibrationele handtekeningen eindig zijn, is het nogal moeilijk om een doel biomolecule te onderscheiden van de andere verwante soorten binnen cellen die vergelijkbare chemische obligaties delen. Het is echter mogelijk om kleine Raman-actieve tril voelers (bijv. alkynen en stabiele isotopen) toe te voegen om specificiteit te verkrijgen voor de beeldvorming van kleine biomoleules17.
Voor biologische en biomedische toepassingen in vivo is gelijktijdige mapping van verschillende chemische soorten in een bepaald monster noodzakelijk voor het beleggen van de co-distributie en dynamische correlaties tussen paren van biomoleules18,19. Daarom zijn er veel inspanningen geleverd om meerdere chemische contrasten te verkrijgen. In de eenvoudigste optie van Multicolor Imaging, om verschillende Raman-modi van een monster te maken, zijn de frequentie van de pomp straal of Stokes Beam in sequentiële scans op elkaar afgestemd18. Echter, met behulp van de golflengte afstemmen benadering kan leiden tot verlies van co-lokalisatie informatie van verschillende Raman modi, vooral wanneer het voorbeeld in een dynamische omgeving18.
Als gevolg van niet-lineaire excitatie biedt SRS intrinsieke 3D-oplossend vermogen van de geselecteerde chemische binding binnen biologische monsters20. Volume reconstructie van de geselecteerde chemische binding en de ruimtelijke verdelingen kan eenvoudig worden bereikt door het verzamelen van SRS beelden op verschillende brandvlak langs de z-as. Aangezien de beelden worden verworven met hoge ruimtelijke en temporele resoluties, kunnen andere stukjes belangrijke informatie (d.w.z. 3D-structuur, chemische samenstelling, enz.) over het biologisch monster worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij waarderen V. Tufano van IMM CNR voor zijn waardevolle technische assistentie en Giacomo Cozzi, product specialist van Nikon Instruments, voor nuttige discussies en voortdurende ondersteuning. Dit werk werd deels gesteund door Italiaanse nationale operatieve Programma's PONa3 00025 (BIOforIU) en door euro-Bioimaging grootschalig panEuropean onderzoeksinfrastructuurproject.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
