Summary
I dette manuskriptet, er implementeringen av en stimulert Raman spredning (SRS) mikroskop, fremstilt ved integrering av en SRS eksperimentell oppsett med en laserskanning mikroskop, beskrevet. SRS-mikroskopet er basert på to femtosecond (FS) laser kilder, en ti-Sapphire (ti: sa) og synkronisert optisk parametrisk oscillator (OPO).
Abstract
Stimulert Raman spredning (SRS) mikroskopi bruker nær-infrarød eksitasjon lys; Derfor, det aksjer mange multi-Foton mikroskopisk Imaging egenskaper. SRS Imaging modalitet kan fås ved hjelp av kommersielle laser-skanning mikroskop ved å utstyre med en ikke-descanned forover detektor med riktig bånd pass filtre og lock-in forsterker (LIA) deteksjon ordningen. Et skjematisk oppsett av et typisk SRS-mikroskop inkluderer følgende: to pulserende laserstråler (dvs. pumpen og sonden som er rettet i et skanne mikroskop), som må overlappes i både rom og tid på bildet flyet, deretter fokusert av et mikroskop objektiv i prøven gjennom to skanning speil (SMs), som raster fokus stedet over et x-y fly. Etter interaksjon med prøven, er overført utgang pulser samlet av en øvre mål og målt ved et fremover deteksjon system satt inn i et invertert mikroskop. Pumpe pulser fjernes av en stabel med optiske filtre, mens sonde pulser som er resultatet av SRS-prosessen som forekommer i det sentrale volumet i prøven måles av en PHOTODIODE (PD). Den avlesning av PD er demodulerte av LIA å trekke ut moduleringshjul dybden. Det oppnås et todimensjonal (2D) bilde ved å synkronisere den fremre deteksjons enheten med skanne enheten i mikroskopet. I dette dokumentet er implementeringen av et SRS-mikroskop beskrevet og vellykket demonstrert, samt rapportering av etikett frie bilder av polystyren perler med diameter på 3 μm. Det er verdt å merke seg at SRS mikroskop ikke er kommersielt tilgjengelig, så for å dra nytte av disse egenskapene, er hjemmelaget konstruksjonen det eneste alternativet. Siden SRS mikroskopi er blitt populær i mange felt, er det antatt at denne nøye beskrivelse av SRS mikroskop gjennomføringen kan være svært nyttig for det vitenskapelige samfunnet.
Introduction
Inne livet vitenskap søknadene, SRS mikroskopi har smaragd idet kraftfull verktøyet for avmerke-ledig tenkelig. Den grunnleggende ideen om SRS mikroskopi er å kombinere styrken på vibrasjonsmedisin kontrast og dens evne til å tilegne seg bilder i løpet av få sekunder.
SRS er en prosess hvor frekvens forskjellen mellom to laserstråler frekvenser (pumpe signal og Stokes signal ved forskjellige frekvenser) matcher den molekylære vibrasjon av en undersøkt prøve, forårsaker stimulert Raman spredning og en betydelig økningen i Stokes-signalet. I motsetning til lineær Raman spektroskopi, viser SRS en ikke-lineær avhengighet av innkommende lys felt og produserer sammenhengende stråling. SRS har to grunnleggende fordeler: 1) hastighet, noe som gjør bildene mindre følsomme for gjenstander som oppstår fra prøve bevegelse eller-degradering, og 2) et utmerket signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg viser SRS et spektrum som er identisk med den spontane Raman, og SRS-signalet er lineært proporsjonal med konsentrasjonen av det kjemiske båndet spent1,2,3,4, fempå.
I vårt mikroskop er en femtosecond (FS) SRS eksperimentell oppsett integrert med en invertert optisk mikroskop utstyrt med en rask speil skanning enhet (figur 1)6,7,8. To pulserende laser kilder brukes til å implementere dette mikroskopet. Den første er en FS-ti: sa med en puls varighet på ca 140 FS, repetisjon rate på 80 MHz, og utslipps bølgelengder i området 680-1080 NM. Den andre, brukes som sonde strålen og pumpes av ti: sa, er en femtosecond synkronisert optisk parametrisk oscillator (SOPO), med en puls varighet på ca 200 FS, repetisjon rate på 80 MHz, og utslipps bølgelengder i området 1000-1600 NM. Det bør bemerkes at minimum Foton energi forskjellen mellom ti: sa og SOPO strålen er 2500 cm-1. Derfor bruker denne kombinasjonen av laser systemer, bare høy frekvens C-H region (2800-3200 cm-1) av Raman Spectra kan utforskes6,7,8.
For å sette opp et SRS-mikroskop, er det tre viktige problemer å vurdere, som er beskrevet i de etterfølgende avsnittene. Den første er gjennomføringen av en høyfrekvent modulerings metode (se figur 2 og trinn 2,1 av protokollen for en beskrivelse). I en SRS eksperimentell undersøkelse er en avgjørende parameter følsomheten til systemet. En SRS-signal oppdages som en liten endring i intensiteten av eksitasjon bjelker; Derfor kan det bli ødelagt av laser intensitet støy og skjøt støy. Dette problemet kan overvinnes ved å integrere dette systemet med en høyfrekvent modulerings metode (se figur 2 og trinn 2,1 av protokollen for detaljer). I denne metoden brukes en elektro-optikk (EOM) til å modulere pumpen. Moduleringen overført til sonden strålen kan deretter oppdages av en PD etter blokkering av pumpen strålen med en stabel av optiske filtre [stimulert Raman Gain (SRG) deteksjon modus]. PD-utgangen er koblet sammen med et low pass-filter til en låse forsterker (LIA), som demodulerer det målte signalet. Ved å øke modulerings frekvensen til strålen til frekvenser over 1 MHz, kan den iboende grensen for PDs skaffes.
Det andre problemet å vurdere er installasjon av en mekanisk montere som tillater å utføre fremover deteksjon og samtidig å bevare mikroskop observasjon i brightfield. I tillegg har det å redusere støyen på grunn av mekanisk vibrasjon under generering av bilder og for å tillate nøyaktig omplassering av deteksjonssystemet (se Figur 3 og trinn 2,2 av protokollen).
Den tredje er synkronisering av signalet ervervet av fase-sensitive deteksjon ordningen, med strålen plassert på prøven overvåkes av skanningen hodet av mikroskopet. For å realisere bilder krever SMs tre TTL-signaler som gjøres tilgjengelig av mikroskop kontrolleren som er koblet til skannehodet heten: Pikselklokke, linje synkronisering og ramme synkronisering. Synkroniseringen oppnås ved å kontrollere ved hjelp av et PCI-kort, de tre TTL-signalene, og oppkjøpet av et spenningssignal ved utgangs kanalen til Lia6,7,8. En hjemmelaget programvare er utviklet og beskrevet tidligere6,7,8, mens maskinvaren i synkroniseringen systemet er rapportert i Figur 4.
En grunnleggende prosedyre ved utføring av SRS-avbildning er justering av mikroskop. Det er realisert i løpet av fire trinn, som er beskrevet i de påfølgende avsnittene. Den første er den romlige overlapping av to bjelker (se trinn 3,1 av protokollen). I denne eksperimentelle satt opp, de to bjelkene var romlig collinearly kombinert med en dichroic speil. Det foreløpige trinnet er justeringen av OPO og ti: sa slik at hver når mikroskopet. Så, vurderer OPO som en referanse bjelke og dra nytte av en posisjon følsom detektor, ti: sa er romlig overlappes til OPO.
Det andre avgjørende aspektet er den timelige overlapping av to bjelker (se trinn 3,2 av protokollen). Selv om pumpen og OPO bjelker er perfekt synkronisert9, siden de følger litt annerledes stråle stier inne i OPO bolig, ved OPO exit de har en tidsforsinkelse på ca 5 NS og romlig forskjell på 5 cm. Derfor krever ti: sa og OPO å bli re-timet optisk for å sikre timelig overlapping ved prøven. Dette oppnås vanligvis med en fin tunable optisk forsinkelses linje, som i dette tilfellet er satt inn mellom ti: sa og mikroskopet (se figur 1). For å oppnå den timelige overlapping av to bjelker, er to teknikker som brukes. Den første er utført ved hjelp av en rask PD og oscilloskop, mens den andre er basert på auto-og kryss-optiske sammenhenger. Ved hjelp av den første teknikken, en grov overlapping av to bjelker er oppnådd (usikkerhet på 10 PS), mens en nøyaktig Temporal overlapping av to bjelker er innhentet ved hjelp av en Cross-multibane korrelator (oppløsning på 1 FS).
Det tredje avgjørende aspektet er justeringen av de to bjelkene inne i mikroskopet (se trinn 3,3 av protokollen). En foreløpig hvit lys observasjon av prøven gjør det mulig å individuate ønsket synsfelt (FOV). Deretter justeres laserstråler, som går inn i mikroskopet med en side port på mikroskopet, for å nå PD montert på den øvre delen (Figur 3). Hvis du vil ha riktig bilde anskaffelse, må du imidlertid angi en rekke parametere (for eksempel pikseldimensjon og piksel levetid). Sampling frekvensen må respektere begrensningen pålagt av Nyquist ' s setning for å bevare all informasjon i et bilde, mens for en riktig korrespondanse mellom romlige koordinater piksler og SRS-verdien målt i hver piksel, integreringen tid av LIA bør være lik eller sammenlignes med Pixel botid.
I det siste trinnet av mikroskop justering, utføres en rekke tester for å optimalisere den romlige og timelige justeringen (se trinn 3,4 av protokollen). En rekke overføring bilder (TI) for både ti: sa og OPO er ervervet for å optimalisere romlig overlapping. I en TI brukes en enkelt stråle, og den overførte stråle intensiteten fra prøven måles av en PD. I tilfelle av TI realisert ved OPO, PD utgangssignalet er direkte koblet til PCI-kort, mens i tilfelle av TI realisert av ti: sa, er PD utgangssignalet koblet til LIA og analog utgang av LIA er koblet til PCI-kort. Overføring bildene er svært nyttig for å optimalisere FOV, belysningen, fokus plasseringen av mikroskop mål og for å kontrollere om de to bjelkene er romlig overlappes6,7,8.
Optimaliseringen av pumpen og sonden strålen timelige overlapping oppnås ved å skanne forsinkelsen linje med trinn på 0,001 mm som tilsvarer en 3,3 FS tidsforskyvning og utføre en SRS-måling i et enkelt punkt av en polystyren perle sample 3 μm i diameter. Amplituden til et SRS-Signalmåler verdier fra lia, som en funksjon av sonden-pumpen forsinkelse, og gir en maksimal tilsvarende med eksakt Temporal overlapping av de to bjelkene6,7,8. Før avsluttende, bør det bemerkes at alle diskuterte trinnene er obligatoriske for å få et bilde av høy kvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oppstart av Lasersystemet
- Sjekk om temperaturen på kjølere opprettholdes ved eller under 20 ° c.
- Sjekk om luftfuktigheten kontrollenheten fungerer og fuktighet opprettholdes til en verdi rundt 40%.
- Slå på ti: sa laser, strengt følge instruksjonene i manualen.
- Sett bølgelengden til 810 NM.
- Slå på OPO og den tilkoblede mini-datamaskin. Kjør programmet som styrer OPO laser.
- Velg bypass hvis 100% av ti: sa laser utgang er nødvendig ved UTKJØRSELEN av OPO boksen.
- Opphev omgåelse hvis 20% av ti: sa laser utgang og OPO laser utgang er nødvendig ved UTKJØRSELEN av OPO boksen.
- Åpne lukkeren for ti: sa og slipp ti: sa-STRÅLEN til OPO-inngangen.
- Slipp de to laserstråler ved OPO-avkjørselen ved å klikke på signal ut og pumpe ut.
- Vent til både lasere ti: sa og OPO stabiliseres (rundt 45 – 60 min).
- Kontroller strålen flekk ved utkjørselen av OPO boksen for både ti: sa og OPO bruke et papir detektor kort og sjekke strøm ved hjelp av en kraftmåler.
- Tune den OPO laser bølgelengde til 1076 NM.
- Reduser kraften til ~ 10 mW for hver laserstråle for å utføre justering.
2. sette opp mikroskopet
-
Implementering av høyfrekvent modulerings metode
- Utfør den optiske justeringen prosedyre av modulator slik at ti: sa strålen inn og utganger uten forvrengning.
- Slå på funksjonen generator og generere en TTL signal (firkantbølge med amplitude = 5 V, offset = 2,5 V, frekvens = 5 MHz).
- Del TTL-signalet i to deler ved hjelp av et T-kryss; en for EOM og den andre for lock-in forsterker (LIA) (se figur 2).
- Sjekk alle signal nivåer med et oscilloskop.
- Slå på LIA og koble generatoren utgang kanal til referanse kanal for LIA.
- Koble generator kanalen til høyspennings forsterkeren til EOM.
- Slå på forsterkeren og sett spenningen til nesten maksimalt nivå. Overvåk stråle kraften ved utkjørselen av EOM.
-
Integrasjon av mekanisk montering for å fikse PD og tildele x og y relativ bevegelse
Merk: med mikroskopet introduseres et eksternt feste som er utstyrt med en mikrometer som har bevegelseskontroll i x-og y-retninger.- Monter to reise Oversettelses etapper for å tillate bevegelser langs x-og y-retningene (se Figur 3).
- Fest scenen på en Ø 1,5 "innlegg av passende høyde.
- Monter PD-en på en ekstern brakett.
- Maksimer stråle kraften ved PD ved å justere PD-posisjonene (x og y-koordinater) ved hjelp av mikrometer som er festet til braketten (se Figur 3).
3. justering av mikroskop
- Romlig overlapping av bjelkene
Merk: med tanke på OPO strålen som referanse og dra nytte av en posisjon følsom detektor, må ti: sa overlappes til OPO i henhold til følgende fremgangsmåte:- Rett inn OPO og ti: sa laserstråler slik at de begge når mikroskopet.
- Plasser laser strålen posisjon sensorer detektorer i to posisjoner i mellom dichroic speil 1 og speil 6, første posisjon er plassert nær dichroic speil 1 og den andre er nær speilet 6. For hver posisjon bruker du sensorene til å oppdage x-og y-koordinatene til OPO-strålen (Følg figur 1).
- Kontroller at x-og y-koordinatene i ti: sa-laserstrålen er de samme OPO i begge posisjonene til sensor detektoren. Hvis koordinatene til ti: sa og OPO i enkelte posisjoner ikke sammenfaller, justerer du vinkelen på det tilstøtende speilet for å kompensere forskjellen (Følg figur 1).
- Følg samme fremgangsmåte for å justere ti: sa-stråle posisjonene med hensyn til OPO for banen mellom M6-M7 (Følg figur 1).
- Temporal synkronisering av bjelkene
- Bruk av rask PHOTODIODE pluss oscilloskop:
- Stopp forplantning av ti: sa og OPO bjelker og plassere en rask detektor foran OPO strålen (mellom M6 og M7).
- Koble trigger signalet fra ti: sa laser boks med et oscilloskop i kanal 2.
- Koble detektor kabelen med oscilloskop i kanal 1 og visualisere OPO Temporal profil.
- Record tiden (abscissa) målt ved oscilloskop som tilsvarer den maksimale verdien, nemlig T1.
- Stopp OPO strålen og slipp ti: sa strålen.
- Visualiser ti: sa Temporal profil og registrere tiden (abscissa) tilsvarende den maksimale verdien, nemlig T2.
- Minimer forskjellen mellom T1-T2 ved å bruke forsinkelses linjen til å overlappe de to bjelkene. I vårt tilfelle er minimum målbar forskjell 10 PS.
- Fjern den raske detektoren mellom M6 og M7.
- Bruk av autocorrelator:
Merk: i skjematisk diagram vist i figur 1, en autocorrelator er installert uten forstyrrer optiske stier av bjelkene. I tillegg er en ekstra speil introdusert og montert på en flip-flop Mount (referert til som FFM/AM) i mellom M6 og M7 å avlede strålen inn i autocorrelator.- Vend AM for å dirigere strålen inn i autocorrelator.
- Stopp ti: sa og slipp opp OPO.
- Still justeringsskruen for stråle avstands mikrometer på autocorrelator til normal posisjon (8,35 mm).
- Slå på autocorrelator kontrolleren, og start programmet på den personlige datamaskinen som kontrollerer den.
- Prosjekt den OPO strålen fra FFM/AM til input speilet inn i autocorrelator.
- Kontroller refleksjon stedet (ved hjelp av et papir detektor kort) på strålen på justerings vinduet til autocorrelator.
- Når det gjelder intensitet uten stråle eller lav stråle, justerer du posisjonen og orienteringen til FFM/AM i den optimale utstrekning, og prøver å justere inngangs speilet (montert på autocorrelator) for å maksimere laser pulssignalet. Autocorrelator signalet er innhentet som vist i figur 5a.
- Stopp OPO og prosjekt av ti: sa stråle fra FFM/AM til input speilet inn i autocorrelator. Gjenta trinn 3.2.2.6 og 3.2.2.7. Autocorrelator signalet oppnås som vist i figuren 5B.
- Sett justeringsskruen for stråle avstands mikrometer til tverr stilling (7,30 mm).
- Slipp begge bjelkene.
- Skann forsinkelses linjen for å få de to bjelkene OPO og ti: sa overlappet. Multibane korrelator signalet oppnås som vist i figur 6.
- Vend speilet FFM/AM slik at bjelkene kan nå M7 og skannehodet av mikroskopet.
- Bruk av rask PHOTODIODE pluss oscilloskop:
- Justering av mikroskop
- Utfør hvit lys mikroskopisk observasjon:
Merk: før mikroskopisk observasjon må du sørge for at mikroskopet er riktig justert.- Forbered testen prøven, som består av en fosfat buffer løsning der polystyren perler med diameter på 3 μm er spredt. Løsningen er plassert inne i en sandwich av to glass lysbilder.
- Slå på mikroskopet og strømforsyningen til hvitt lys. Følg manualen for observasjon under hvitt lys.
- Bruk en kondensator til å belyse prøven. Bruk mål for 60x å samle lys. Plasser prøven på scenen. Optimaliser fokusposisjonen til målsettingen for 60x-mikroskopet.
- Velg FOV av interesse. Ta et CCD-bilde av prøven (figur 7).
- Slå av strømforsyningen av hvitt lys.
-
Mikroskop justering med femtosecond laserstråler: OPO og ti: sa
- Fjern kondensatoren ved hjelp av Escape -knappen for å trekke tilbake objektivlinsen til 60x-mikroskopet midlertidig. Beveg objektivlinsen til 60x-mikroskopet av den optiske banen, og roter revolveren.
- Monter detektoren på den øvre delen av mikroskopet ved hjelp av den eksterne mekaniske braketten. Koble detektoren utgang gjennom et low-pass filter på 50 Ω til oscilloskop og overvåke OPO signalet.
- Slå på prosessoren som styrer Skannerhodet. Prosjekt OPO strålen inn i skanneren hodet av mikroskopet.
- Kontroller plasseringen av bjelken inne i mikroskopet, sørg for at plasseringen av bjelken er i midten eller nær sentrum.
- Kontroller at plasseringen av bjelken inne i hodet av PD er i sentrum.
- Maksimer kraften målt ved detektoren ved hjelp av en x-y oversetter.
- Slå strålen fra OPO til ti: sa og kontroller at et maksimalt signal er også innhentet for Titan-safir laser. Dette indikerer at begge bjelkene er godt justert.
- Fullfør stråle justeringen, innføre objektivlinsen på 60x-mikroskopet og rotere tilbake revolveren.
- Bruk fokus knappen på mikroskopet for å gjenvinne det endelige fokuset til objektivlinsen på 60x-mikroskopet.
- Plasser målsettingen med forstørrelse 40x i stedet for kondensatoren uten å berøre eller forstyrre prøven.
- Utfør hvit lys mikroskopisk observasjon:
- Optimalisering av romlige og timelige synkroniseringer av bjelker
- Temporal synkronisering
- Sett kraften i ti: sa og OPO målt før mikroskopet til 30 mW for begge bjelker. Sett bølgelengden til OPO til en annen verdi med hensyn til den forrige, slik at pumpen og sonden er ikke i resonans med vibrasjonsmedisin hyppigheten av perlene.
- Slipp begge bjelkene (ti: sa og OPO) slik at de kommer inn i mikroskopet.
- Løpe skanningen forsinkelsen line datastyrt oversetteren og fortegnelse det målt intensiteten av LIA for hver holdning av forsinkelsen line. Vent til skanningen av forsinkelses linjen er fullført. Den oppnådde timelige profilen er i figur 8a.
- Sett bølgelengden til OPO til 1076 NM igjen slik at pumpen og sonden er i resonans med vibrasjonsmedisin frekvensen av perlene. Gjenta trinn 3.4.1.3 (den oppnådde timelige profilen er i figur 8B).
- Still inn den oppnådde overlappings stråle posisjonen i forsinkelses linjen for å hente SRS-bilder.
- Romlig synkronisering av bjelkene
Merk: overføring bildene er nyttige for å optimalisere FOV, belysning, og fokus posisjon av mikroskop mål, og for å kontrollere om de to bjelkene er romlig overlappes.- Overføring bilde oppkjøpet av OPO
- Stoppe ti: sa strålen og redusere OPO strøm til 8 mW.
- Koble detektor avlesning til datainnsamlings kortet.
- Kjør datainnsamling programmet sammen med mikroskop skanning konsollen.
- Lagre filen og behandle dataene for å få bildet. Det rå bildet vises som vist i figur 9a.
- Overføring bilde oppkjøpet av ti: sa
- Stopp OPO strålen og redusere ti: sa strøm til 2.5-4.5 mW.
- Koble detektoren til LIA og LIA readouts med datainnsamlings kortet.
- Gjenta trinn 3.4.2.1.3 og 3.4.2.1.4. Det rå bildet vises som vist i figur 9B.
- Overføring bilde oppkjøpet av OPO
- Temporal synkronisering
4. innhenting av SRS-avbildninger
Merk: en dedikert algoritme er realisert for å lagre data. Den støtter følgende bildeformater: 512 px x 512 px og 256 px x 256 px, med oppkjøpet ganger 16 s, 8 s, 4 s, og 2 s.
- Introduser en stabel med filtre mellom 40x-målet og PD for å fjerne pumpe pulser (ti: sa) og anskaffe bare Stokes-signalet (OPO).
- Sett pumpe signalet til 810 NM med en fokusert effekt på 8 mW og sonden signal til 1076 NM med en fokusert effekt på 8 mW å undersøke en typisk C-H bånd av polystyren (Raman forskyvning av 3054 cm− 1).
- Koble detektoren med LIA og LIA avlesning til datainnsamling kortet.
- Angi piksel formatet for bildeinnhenting som per krav, og angi anskaffelses tiden.
- Kjør programmet som styrer mikroskop kontrolleren.
- Kjør det dedikerte algoritme programmet som fungerer som synkronisering mellom mikroskop kontrolleren, deteksjonssystemet og DAQ (se Figur 4).
- Lagre Matrix-filen når anskaffelsen er fullført.
- Importer rå datafilen og lagre bildet i ønsket format (vanligvis lagret i TIF-format) ved hjelp av ImageJ programvare. Bildet vises i Figur 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på SRS-måling (dvs. SRS-måling i ett enkelt punkt av prøven) rapporteres i figur 7. Når bjelkene ikke overlappes i tid eller rom, det oppnådde resultatet er rapportert i figur 8a. I off-resonans, amplituden av signalet målt ved LIA er null, mens den fasen av signalet målt ved LIA hopper mellom negative og positive verdier. Mens, når bjelkene er overlappet i rommet, flytte forsinkelsen linjen i et passende område, de oppnådde resultatene er rapportert i figur 8B. Signalet målt ved LIA øker og når sitt maksimum når bjelkene er perfekt overlappet i tid, mens fasen begynner å oppnå en fast verdi i løpet av tiden der bjelkene overlappes i tid.
Absorpsjon bilder innhentet ved hjelp av en enkelt bjelke (ti: sa eller OPO) av samme polystyren perler er representert i figur 9a, b med skala barer på 6 μm. For å erverve SRS-bilder, er forsinkelsen linjen satt til stillingen oppnådd i figur 7b, et typisk SRG bilde vises i Figur 10 med en skala bar på 6 μm.
Figur 1: skjematisk utforming av mikroskop systemet f-SRS. OPO = optisk parametrisk oscillator; Ti: sa = Titanium-Sapphire laser; M1-M7 = femtosecond bredbånd speil; FFM/AM = flip-flop speil/Autocorrelator Mirror; DM1, DM2 = dichroic speil; DL = forsinkelse linje; AC = autocorrelator; EOM = elektro-optikk modulator; FG = funksjon generator; GM = Galvo speil; Obj1, Obj2 = mål for mikroskop; PD = PHOTODIODE; DAQ = datainnsamlingssystem; PC = personlig datamaskin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ordningen med høyfrekvent modulerings metode. I den innfelte figuren representeres de to laserstråler før interaksjon inne i prøven og den modifiserte sonden på grunn av interaksjoner av sonden og pumpen inne i prøven. Tid er representert i NS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bilde 3: representasjon av PHOTODIODE montere med mekanisk monterings system. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk datainnsamlingssystem. PD = PHOTODIODE, LIA = lock-in forsterker, DS = deteksjons system, MC = mikroskop kontroll, DAQ = data innsamlingssystem, PC = personlig datamaskin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Autocorrelator funksjon av OPO (a) og ti: sa (b). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: kryss korrelasjon funksjon av OPO og ti: sa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: CCD bilde av polystyren perler.
Figur 8: amplitude og fase av SRS signal målt ved lock-in forsterker: av resonans (til venstre) og i resonans (til høyre) . Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: overføring bilder av polystyren perler oppnås ved OPO (a) og ti: sa (b). Scale bar = 16 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: SRS bilde av polystyren perler. Scale bar = 12 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SRS mikroskopi har tatt etikett fri avbildning til nye høyder, spesielt i studier av komplekse biologiske strukturer som lipider, som er grunnleggende for celler og cellulær arkitektur. Lipider er involvert i flere fysiologiske veier som produksjon av biologiske membraner, og de fungerer som biosyntetiske forløpere og signal transdusere10. Lipider er pakket inn i spesialiserte intracellulære organeller, også kalt lipid dråper (LDs). Deres diameter varierer fra noen titalls nanometer til titalls mikrometer11,12. LDs ikke bare delta rikelig i fett-og steroid-produserende celler, men er også til stede i andre cellelinjer. LDs samarbeider i en rekke fysiologiske prosesser som lipid lagring. De er kjennetegnet fremtredende i vanlige patologi (f. eks, endret kolesterol metabolisme)13,14.
Tradisjonelt er visualisering av lipider oppnås ved hjelp av fluorescens mikroskopi og nøytrale lipid-spesifikke fargestoff-merket faste celler10. Det bør bemerkes at som lipider er mindre størrelse i forhold til proteiner og DNA, strukturelle og funksjonelle endringer og uønskede gjenstander kan oppstå når du legger fluorophores15,16. SRS har vist å være kraftig for å studere lipid-rike strukturer. Lipider er rikelig i C-H2 grupper. Derfor, de relativt isolerte toppene knyttet til C-H obligasjons vibrasjonen stater på 2845 cm-1 i deres Raman Spectra gi en unik signatur for lipider i en celle. Dessverre, siden deriverbare vibrasjonen signaturer er endelig, er det ganske vanskelig å skille et mål biomolekyler fra andre relaterte arter i celler som deler lignende kjemiske obligasjoner. Det er imidlertid mulig å legge små Raman-aktive vibrasjonsmedisin sonder (f. eks, alkynes og stabile isotoper) for å få spesifisitet for avbildning av små biomolekyler17.
For biologiske og biomedisinsk i vivo-applikasjoner er simultan kartlegging av ulike kjemiske arter i et gitt utvalg nødvendig for å investere co-distribusjon og dynamiske sammenhenger mellom parene av biomolekyler18,19. Derfor er det gjort mange anstrengelser for å oppnå flere kjemiske kontraster. I det enkleste alternativet av flerfarget bildebehandling, til bilde forskjellige Raman moduser av en prøve, frekvensen av pumpen strålen eller Stokes strålen er innstilt i sekvensiell skanninger18. Men ved hjelp av bølgelengde tuning tilnærmingen kan føre til tap av co-lokalisering informasjon av ulike Raman moduser, spesielt når prøven er i et dynamisk miljø18.
Som en konsekvens av ikke-lineær eksitasjon, gir SRS egen verdi 3D løse egenskapene til den valgte kjemiske bindingen innen biologiske prøver20. Volum rekonstruksjon av det valgte kjemiske båndet og dens romlige distribusjoner kan enkelt oppnås ved å samle inn SRS-bilder i ulike fokal plan langs z-aksen. Siden bildene er ervervet med høy romlige og timelige oppløsninger, andre deler av viktig informasjon (dvs. 3D-struktur, kjemisk sammensetning, etc.) om biologisk prøven kan fås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi setter pris på V. Tufano fra IMM CNR for hans verdifulle tekniske assistanse og Giacomo Cozzi, produkt spesialist fra Nikon Instruments, for nyttige diskusjoner og kontinuerlig støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av italienske nasjonale operative programmer PONa3 00025 (BIOforIU) og av euro-Bioimaging stor skala Europas forskning infrastruktur prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
