Summary
In questo manoscritto, viene descritta l'implementazione di un microscopio stimolato Raman scattering (SRS), ottenuto dall'integrazione di un set-up sperimentale SRS con un microscopio a scansione laser. Il microscopio SRS si basa su due sorgenti laser femtosecondo (fs), un Ti-Sapphire (Ti:Sa) e un oscillatore parametrico ottico sincronizzato (OPO).
Abstract
La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) utilizza la luce di eccitazione vicino all'infrarosso; pertanto, condivide molte proprietà di imaging microscopico multi-fotonico. La modalità di imaging SRS può essere ottenuta utilizzando microscopi a scansione laser commerciali equipaggiando un rilevatore in avanti non sottoposto a scansione con filtri a banda e uno schema di rilevamento dell'amplificatore lock-in (LIA). Un layout schematico di un tipico microscopio SRS include quanto segue: due fasci laser pulsati (cioè la pompa e la sonda diretta in un microscopio a scansione), che devono essere sovrapposti sia nello spazio che nel tempo sul piano dell'immagine, quindi focalizzati da un obiettivo del microscopio il campione attraverso due specchi di scansione (SM), che raster il punto focale attraverso un piano x-y. Dopo l'interazione con il campione, gli impulsi di uscita trasmessi vengono raccolti da un obiettivo superiore e misurati da un sistema di rilevamento in avanti inserito in un microscopio invertito. Gli impulsi della pompa vengono rimossi da una pila di filtri ottici, mentre gli impulsi della sonda che sono il risultato del processo SRS che si verificano nel volume focale del campione sono misurati da un fotodiode (PD). La lettura del PD è demodulata dal LIA per estrarre la profondità di modulazione. Un'immagine bidimensionale (2D) viene ottenuta sincronizzando l'unità di rilevamento in avanti con l'unità di scansione al microscopio. In questo articolo, l'implementazione di un microscopio SRS è descritta e dimostrata con successo, così come la segnalazione di immagini prive di etichette di perline di polistirolo con diametri di 3 m. Vale la pena notare che i microscopi SRS non sono disponibili in commercio, quindi per sfruttare queste caratteristiche, la costruzione fatta in casa è l'unica opzione. Poiché la microscopia SRS sta diventando popolare in molti campi, si ritiene che questa attenta descrizione dell'implementazione del microscopio SRS possa essere molto utile per la comunità scientifica.
Introduction
Nelle applicazioni nel campo delle scienze biologiche, la microscopia SRS è emersa come un potente strumento per l'imaging senza etichette. L'idea di base della microscopia SRS è quella di combinare la forza del contrasto vibrazionale e la sua capacità di acquisire immagini in pochi secondi.
SRS è un processo in cui la differenza di frequenza tra due frequenze di raggi laser (segnale pompa e segnale stokes a frequenze diverse) corrisponde alla vibrazione molecolare di un campione studiato, causando dispersione Raman stimolata e un significativo aumento del segnale Stokes. A differenza della spettroscopia raman lineare, sRS presenta una dipendenza non lineare dai campi luminosi in entrata e produce radiazioni coerenti. SRS ha due vantaggi fondamentali: 1) velocità, che rende le immagini meno sensibili agli artefatti derivanti dal movimento o dalla degradazione del campione, e 2) un eccellente rapporto segnale-rumore (SNR). Inoltre, SRS presenta uno spettro identico al Raman spontaneo, e il segnale SRS è linearmente proporzionale alla concentrazione del legame chimico eccitato1,2,3,4, 5.
Nel nostro microscopio, un set-up sperimentale femtosecondo (fs) SRS è integrato con un microscopio ottico invertito dotato di un'unità di scansione a specchi veloci (Figura 1)6,7,8. Per implementare questo microscopio vengono utilizzate due sorgenti laser pulsate. Il primo è un fs-Ti:Sa con una durata dell'impulso di circa 140 fs, una frequenza di ripetizione di 80 MHz e lunghezze d'onda di emissione nell'intervallo di 680-1080 nm. Il secondo, utilizzato come fascio di sonda e pompato da Ti:Sa, è un oscillatore parametrico ottico sincronizzato a femtosecondo (SOPO), con una durata dell'impulso di circa 200 fs, una frequenza di ripetizione di 80 MHz e lunghezze d'onda di emissione nell'intervallo di 1000-1600 nm. Va notato che la differenza minima di energia fotone tra il fascio Ti:Sa e SOPO è di 2500 cm-1. Pertanto, utilizzando questa combinazione di sistemi laser, solo la regione Ad alta frequenza C-H (2800-3200 cm-1) di spettri Raman può essere esplorata6,7,8.
Al fine di istituire un microscopio SRS, ci sono tre questioni cruciali da considerare, che sono descritte nei paragrafi successivi. Il primo è l'implementazione di un metodo di trasferimento di modulazione ad alta frequenza (vedere Figura 2 e passaggio 2.1 del protocollo per una descrizione). In un'indagine sperimentale SRS, un parametro cruciale è la sensibilità del sistema. Un segnale SRS viene rilevato come un piccolo cambiamento nell'intensità dei raggi di eccitazione; pertanto, può essere danneggiato dal rumore di intensità del laser e dal rumore delle riprese. Questo problema può essere risolto integrando questo sistema con un metodo di trasferimento di modulazione ad alta frequenza (vedere Figura 2 e passaggio 2.1 del protocollo per i dettagli). In questo metodo, un modulatore elettro-ottico (EOM) viene utilizzato per modulare la pompa. La modulazione trasferita al fascio di sonda può quindi essere rilevata da un PD dopo aver bloccato il fascio di pompaggio con una pila di filtri ottici [modalità di rilevamento Raman guadagno Raman stimolato (SRG)]. L'uscita PD è collegata da un filtro passa-basso a un amplificatore lock-in (LIA), che demolazza il segnale misurato. Aumentando la frequenza di modulazione del fascio a frequenze superiori a 1 MHz, è possibile ottenere il limite intrinseco di PD.
La seconda questione da considerare è l'installazione di un supporto meccanico che permette di effettuare il rilevamento in avanti e allo stesso tempo di preservare l'osservazione al microscopio in campo luminoso. Inoltre, deve ridurre il rumore dovuto alle vibrazioni meccaniche durante la generazione di immagini e consentire il riposizionamento preciso del sistema di rilevamento (vedere la Figura 3 e il passaggio 2.2 del protocollo).
Il terzo è la sincronizzazione del segnale acquisito dallo schema di rilevamento sensibile alla fase, con il fascio posizionato sul campione monitorato dalla testina di scansione del microscopio. Per realizzare le immagini, le SM richiedono tre segnali TTL che vengono resi disponibili dal controller del microscopio collegato all'unità di scansione: pixel clock, line sync e frame sync. La sincronizzazione si ottiene controllando utilizzando una scheda PCI, i tre segnali TTL e l'acquisizione di un segnale di tensione sul canale di uscita di LIA6,7,8. Un software fatto in casa è stato sviluppato e descritto in precedenza6,7,8, mentre l'hardware del sistema di sincronizzazione è riportato in Figura 4.
Una procedura fondamentale durante l'esecuzione dell'imaging SRS è l'allineamento al microscopio. Si realizza nel corso di quattro fasi, descritte nei paragrafi successivi. Il primo è la sovrapposizione spaziale di due fasci (vedere il passaggio 3.1 del protocollo). In questo set-up sperimentale, i due fasci sono stati spazialmente collitrati combinati da uno specchio dicroico. La fase preliminare è l'allineamento di OPO e Ti:Sa in modo che ognuno raggiunga il microscopio. Quindi, considerando l'OPO come una trave di riferimento e sfruttando un rilevatore sensibile alla posizione, il Ti:Sa è sovrapposto spazialmente a OPO.
Il secondo aspetto cruciale è la sovrapposizione temporale di due fasci (vedere il passaggio 3.2 del protocollo). Anche se la pompa e le travi OPO sono perfettamente sincronizzate9, dal momento che seguono percorsi di fascio leggermente diversi all'interno dell'alloggiamento OPO, all'uscita OPO hanno un ritardo di tempo di circa 5 ns e differenza spaziale di 5 cm. Pertanto, Ti:Sa e OPO richiedono di essere riprogrammati otticamente per garantire la sovrapposizione temporale sul campione. Questa operazione viene in genere eseguita con una linea di ritardo ottica finemente regolabile, che in questo caso viene inserita tra il Ti:Sa e il microscopio (vedere la figura 1). Per ottenere la sovrapposizione temporale di due travi, vengono utilizzate due tecniche. Il primo viene effettuato utilizzando una PD veloce e oscilloscopio, mentre il secondo si basa su correlazioni auto e cross-ottiche. Utilizzando la prima tecnica, si ottiene una sovrapposizione approssimativa di due travi (incertezza di 10 ps), mentre una sovrapposizione temporale accurata di due travi si ottiene utilizzando un correlato recorrelato incrociato (risoluzione di 1 fs).
Il terzo aspetto cruciale è l'allineamento dei due fasci all'interno del microscopio (vedere la fase 3.3 del protocollo). Un'osservazione preliminare a luce bianca del campione permette di individuare il campo visivo desiderato (FOV). Successivamente, i raggi laser, che entrano nel microscopio da una porta laterale del microscopio, sono allineati per raggiungere il PD montato sulla parte superiore (Figura 3). Tuttavia, per una corretta acquisizione dell'immagine, è necessario impostare una serie di parametri (ad esempio, dimensione in pixel e tempo di peritura dei pixel). La frequenza di campionamento deve rispettare il vincolo imposto dal teorema di Nyquist al fine di conservare tutte le informazioni in un'immagine, mentre per una corretta corrispondenza tra le coordinate spaziali dei pixel e il valore SRS misurato in ogni pixel, il tempo di integrazione di LIA dovrebbe essere uguale o paragonabile al tempo di dimora dei pixel.
Nella fase finale dell'allineamento al microscopio, vengono effettuati numerosi test per ottimizzare l'allineamento spaziale e temporale (vedere il passaggio 3.4 del protocollo). Un certo numero di immagini di trasmissione (TI) sia per Ti:Sa che per OPO vengono acquisite al fine di ottimizzare la sovrapposizione spaziale. In un TI, viene utilizzato un singolo fascio e l'intensità del fascio trasmesso dal campione viene misurata da una PD. Nel caso di TI realizzato da OPO, il segnale di uscita PD è collegato direttamente alla scheda PCI, mentre nel caso di TI realizzato da Ti:Sa, il segnale di uscita PD è collegato a LIA e l'uscita analogica di LIA è collegata alla scheda PCI. Le immagini di trasmissione sono molto utili per ottimizzare il FOV, l'illuminazione, la posizione focale degli obiettivi del microscopio e per verificare se i due fasci sono sovrapposti spazialmente6,7,8.
L'ottimizzazione della sovrapposizione temporale della pompa e della trave della sonda si ottiene scansionando la linea di ritardo con passi di 0,001 mm corrispondenti a uno spostamento temporale di 3,3 fs ed effettuando una misurazione SRS in un unico punto di un campione di perline di polistirolo di 3 m di diametro. L'ampiezza di un segnale SRS misura i valori di LIA, in funzione del ritardo sonda-pompa, e fornisce un massimo corrispondente con l'esatta sovrapposizione temporale delle due travi6,7,8. Prima di concludere, va notato che tutti i passaggi discussi sono obbligatori per ottenere un'immagine di alta qualità.
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Protocol
1. Avvio del sistema laser
- Controllare se la temperatura dei refrigeratori è mantenuta a o al di sotto dei 20 gradi centigradi.
- Controllare se l'unità di controllo dell'umidità funziona correttamente e l'umidità viene mantenuta a un valore intorno al 40%.
- Accendere il laser Ti:Sa, seguendo rigorosamente le istruzioni nel manuale.
- Impostare la lunghezza d'onda su 810 nm.
- Accendere l'OPO e il mini-computer collegato. Eseguire l'applicazione che controlla il laser OPO.
- Selezionare bypass se è richiesto il 100% dell'uscita laser Ti:Sa all'uscita della scatola OPO.
- Deselezionare bypass se il 20% dell'uscita laser Ti:Sa e l'uscita laser OPO sono necessari all'uscita della scatola OPO.
- Aprire l'otturatore di Ti:Sa e rilasciare il fascio Ti:Sa per l'ingresso OPO.
- Rilasciare i due raggi laser all'uscita OPO facendo clic su segnale di uscita e pompaggio.
- Attendere che entrambi i laser Ti:Sa e OPO siano stabilizzati (circa 45-60 min).
- Verificare il punto del raggio all'uscita della scatola OPO sia per Ti:Sa che per OPO utilizzando una scheda di rilevamento carta e controllare l'alimentazione utilizzando un misuratore di potenza.
- Sintonizzare la lunghezza d'onda laser OPO a 1076 nm.
- Ridurre la potenza a 10 mW per ogni raggio laser per eseguire l'allineamento.
2. Impostazione del microscopio
-
Implementazione del metodo di trasferimento della modulazione ad alta frequenza
- Eseguire la procedura di allineamento ottico del modulatore in modo che il fascio Ti:Sa entra ed esce senza alcuna distorsione.
- Accendere il generatore di funzioni e generare un segnale TTL (onda quadra con ampiezza : 5 V, scostamento : 2,5 V, frequenza - 5 MHz).
- Dividere il segnale TTL in due parti utilizzando una giunzione T; uno per la teM e l'altro per l'amplificatore di blocco (LIA) (vedere la figura 2).
- Controllare tutti i livelli di segnale con un oscilloscopio.
- Accendere il LIA e collegare il canale di uscita del generatore al canale di riferimento del LIA.
- Collegare il canale di uscita del generatore all'amplificatore di alimentazione ad alta tensione di EOM.
- Accendere l'amplificatore e impostare la tensione a quasi il livello massimo. Monitorare la potenza del fascio all'uscita di EOM.
-
Integrazione del montaggio meccanico per fissare il PD e assegnare movimenti relativi x e y
NOTA: Con il microscopio viene introdotto un supporto esterno, dotato di un micrometro con controllo del movimento in direzioni x e y.- Montare due fasi di traslazione di viaggio per consentire i movimenti lungo le direzioni x e y (vedere la figura 3).
- Fissare il palco su un palo da 1,5" di altezza appropriata.
- Montare il PD su un supporto esterno.
- Massimizzare la potenza del fascio al PD, regolando le posizioni del PD (coordinate x e y) utilizzando i micrometri collegati al supporto (vedere La figura3).
3. Allineamento del microscopio
- Sovrapposizione spaziale delle travi
NOTA: considerando il fascio OPO come riferimento e sfruttando un rilevatore sensibile alla posizione, il Ti:Sa deve essere sovrapposto a OPO secondo la seguente procedura:- Allineare l'OPO e i raggi laser Ti:Sa in modo che entrambi raggiungano il microscopio.
- Posizionare i rilevatori di posizione del fascio laser in due posizioni tra lo specchio dicrotrico 1 e lo specchio 6, la prima posizione si trova vicino allo specchio dicroico 1 e la seconda è vicina allo specchio 6. Per ogni posizione, utilizzare i sensori per rilevare le coordinate x e y del fascio OPO (seguire la Figura 1).
- Verificare che le coordinate x e y del raggio laser Ti:Sa siano le stesse OPO in entrambe le posizioni dei rilevatori di sensori. Se in alcune posizioni le coordinate di Ti:Sa e OPO non coincidono, regolare l'inclinazione dello specchio adiacente per compensare la differenza (seguire la figura 1).
- Seguire la stessa procedura per allineare le posizioni delle travi Ti:Sa rispetto a OPO per il percorso tra M6-M7 (seguire la Figura 1).
- Sincronizzazione temporale delle travi
- Uso del fotodiode veloce più oscilloscopio:
- Interrompere la propagazione delle travi Ti:Sa e OPO e posizionare un rilevatore veloce davanti al fascio OPO (tra M6 e M7).
- Collegare il segnale di innesco fornito dalla scatola laser Ti:Sa con un oscilloscopio nel canale 2.
- Collegare il cavo del rilevatore con l'oscilloscopio nel canale 1 e visualizzare il profilo temporale OPO.
- Registrare il tempo (abscissa) misurato dall'oscilloscopio corrispondente al suo valore massimo, vale a dire t1.
- Arrestare la trave OPO e rilasciare il fascio Ti:Sa.
- Visualizza il profilo temporale Ti:Sa e registra il tempo (abscissa) corrispondente al suo valore massimo, vale a dire t2.
- Ridurre al minimo la differenza tra t1-t2 utilizzando la linea di ritardo per sovrapporre le due travi. Nel nostro caso, la differenza minima misurabile è 10 ps.
- Rimuovere il rilevatore veloce tra M6 e M7.
- Uso dell'autocorrelatore:
NOTA: Nel diagramma schematico illustrato nella Figura 1, viene installato un autocorrelato senza interferire con i percorsi ottici delle travi. Inoltre, viene introdotto uno specchio aggiuntivo e montato su un supporto flip-flop (noto come FFM/AM) tra M6 e M7 per deviare la trave nell'autocorrelatore.- Capovolgere l'AM per dirigere la trave nell'autocorrelatore.
- Arrestare il Ti:Sa e rilasciare l'OPO.
- Impostare il micrometro a vite di regolazione della distanza del fascio dell'autocorrelatore in posizione normale (8,35 mm).
- Accendere il controller autocorrelatore e avviare l'applicazione software sul personal computer che lo controlla.
- Proiettare la trave OPO da FFM/AM allo specchio di ingresso nell'autocorrelatore.
- Controllare il punto di riflessione (utilizzando una scheda di rilevamento carta) del fascio nella finestra di allineamento dell'autocorrelatore.
- Nel caso di no-beam o bassa intensità del fascio, regolare la posizione e l'orientamento di FFM/AM all'estensione ottimale e cercare di regolare lo specchio di ingresso (montato sull'autocorrelato) per massimizzare il segnale di impulso laser. Il segnale di autocorrelatore viene ottenuto come illustrato nella figura 5a.
- Arrestare l'OPO e il progetto del fascio Ti:Sa da FFM/AM per inserire specchio nell'autocorrelatore. Ripetere i passaggi 3.2.2.6 e 3.2.2.7. Il segnale di autocorrelatore viene ottenuto come illustrato nella figura 5b.
- Impostare il micrometro della vite di regolazione della distanza del fascio su Posizione trasversale (7,30 mm).
- Rilasciare entrambe le travi.
- Eseguire la scansione della linea di ritardo per ottenere le due travi OPO e Ti:Sa sovrapposte. Il segnale cross-correlatore si ottiene come illustrato nella figura 6.
- Capovolgere lo specchio FFM/AM in modo che i fasci possano raggiungere M7 e scansionare la testa del microscopio.
- Uso del fotodiode veloce più oscilloscopio:
- Allineamento al microscopio
- Eseguire l'osservazione microscopica a luce bianca:
NOTA: Prima dell'osservazione microscopica, assicurarsi che il microscopio sia correttamente allineato.- Preparare il campione di prova, che consiste in una soluzione di cuscinetto per fosfati in cui vengono disperse perline di polistirolo con diametri di 3 m. La soluzione viene posizionata all'interno di un panino di due vetrini di vetro.
- Accendere il microscopio e l'alimentazione della luce bianca. Seguire il manuale per l'osservazione sotto la luce bianca.
- Utilizzare un condensatore per illuminare il campione. Utilizzare l'obiettivo di 60x per raccogliere la luce. Posizionare il campione sullo stage. Ottimizzare la posizione focale dell'obiettivo del microscopio 60x.
- Selezionare il FOV di interesse. Prendere un'immagine CCD dell'esempio (Figura 7).
- Spegnere l'alimentatore di luce bianca.
-
Allineamento al microscopio con raggi laser femtosecondi: OPO e Ti:Sa
- Rimuovere il condensatore utilizzando il pulsante di fuga per ritrarre temporaneamente la lente obiettivo del microscopio 60x. Spostare la lente obiettivo al microscopio 60x fuori dal percorso ottico, ruotando il naso.
- Montare il rilevatore nella parte superiore del microscopio utilizzando il supporto meccanico esterno. Collegare l'uscita del rilevatore attraverso un filtro a passata bassa di 50 oscilloscopio e monitorare il segnale OPO.
- Accendere il processore che controlla la testina dello scanner. Proiettare il fascio OPO nella testa dello scanner del microscopio.
- Controllare la posizione del fascio all'interno del microscopio, assicurarsi che la posizione del fascio è al centro o vicino al centro.
- Verificare che la posizione della trave all'interno della testa della PD sia al centro.
- Massimizzare la potenza misurata dal rilevatore utilizzando un traduttore x-y.
- Passare il fascio da OPO a Ti:Sa e verificare che si ottenga un segnale massimo anche per il laser in titanio-zaffiro. THis indica che entrambe le travi sono ben allineate.
- Finalizzare l'allineamento del fascio, introducendo la lente obiettivo del microscopio 60x e ruotando indietro il naso.
- Utilizzare il pulsante di rifocalizzazione sul microscopio per riottenere la messa a fuoco finalizzata alla lente obiettivo del microscopio 60x.
- Posizionare l'obiettivo con ingrandimento 40x al posto del condensatore senza toccare o disturbare il campione.
- Eseguire l'osservazione microscopica a luce bianca:
- Ottimizzazione delle sincronizzazioni spaziali e temporali dei raggi
- Sincronizzazione temporale
- Impostare la potenza di Ti:Sa e OPO misurata prima del microscopio a 30 mW per entrambi i fasci. Impostare la lunghezza d'onda di OPO su un valore diverso rispetto a quello precedente in modo che la pompa e la sonda non siano in risonanza con la frequenza vibrazionale delle perline.
- Rilasciare entrambi i fasci (Ti:Sa e OPO) in modo che entrino nel microscopio.
- Eseguire la linea di ritardo di scansione traduttore computerizzato e registrare l'intensità misurata da LIA per ogni posizione della linea di ritardo. Attendere il completamento dell'analisi della linea di ritardo. Il profilo temporale ottenuto viene visualizzato nella figura 8a.
- Impostare la lunghezza d'onda di OPO a 1076 nm di nuovo in modo che la pompa e la sonda sono in risonanza con la frequenza vibrazionale delle perline. Ripetere il passaggio 3.4.1.3 (il profilo temporale ottenuto viene visualizzato nella figura 8b).
- Impostare la posizione della trave di sovrapposizione ottenuta nella riga di ritardo per acquisire le immagini SRS.
- Sincronizzazione spaziale delle travi
NOTA: Le immagini di trasmissione sono utili per ottimizzare il FOV, l'illuminazione e la posizione focale degli obiettivi del microscopio e per verificare se i due fasci sono sovrapposti spazialmente.- Acquisizione dell'immagine di trasmissione di OPO
- Arrestare il fascio Ti:Sa e ridurre la potenza OPO a 8 mW.
- Collegare la lettura del rilevatore alla scheda di acquisizione dati.
- Eseguire il programma di acquisizione dati con la console di scansione al microscopio.
- Salvare il file ed elaborare i dati per ottenere l'immagine. L'immagine raw viene visualizzata come illustrato nella figura 9a.
- Acquisizione di un'immagine di trasmissione di Ti:Sa
- Arrestare il fascio OPO e ridurre la potenza Ti:Sa a 2,5–4,5 mW.
- Collegare il rilevatore con le letture LIA e LIA con la scheda di acquisizione dati.
- Ripetere i passaggi 3.4.2.1.3 e 3.4.2.1.4. L'immagine raw viene visualizzata come illustrato nella figura 9b.
- Acquisizione dell'immagine di trasmissione di OPO
- Sincronizzazione temporale
4. Acquisizione di immagini SRS
NOTA: è stato realizzato un algoritmo dedicato per memorizzare i dati. Supporta i seguenti formati di immagine: 512 px x 512 px e 256 px x 256 px, con tempi di acquisizione di 16 s, 8 s, 4 s e 2 s.
- Introdurre una pila di filtri tra l'obiettivo 40x e PD per rimuovere gli impulsi della pompa (Ti:Sa) e acquisire solo il segnale Stokes (OPO).
- Impostare il segnale della pompa a 810 nm con una potenza focalizzata di 8 mW e il segnale della sonda a 1076 nm conuna potenza mirata di 8 mW per indagare su un tipico legame C-H di polistirolo (spostamento Raman di 3054 cm )
- Collegare il rilevatore con la lettura LIA e LIA alla scheda di acquisizione dati.
- Imposta il formato pixel di acquisizione dell'immagine in base al requisito e imposta il tempo di acquisizione.
- Eseguire il programma che controlla il controller del microscopio.
- Eseguire il programma di algoritmi dedicato che funge da sincronizzazione tra il controller del microscopio, il sistema di rilevamento e DAQ (vedere la Figura 4).
- Salvare il file della matrice una volta completata l'acquisizione.
- Importare il file di dati non elaborati e salvare l'immagine nel formato richiesto (in genere salvato in formato .tif) utilizzando il software ImageJ. L'immagine è illustrata nella figura 10.
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Representative Results
Un esempio di misurazione SRS (cioè la misurazione SRS in un singolo punto del campione) è riportato nella figura 7. Quando le travi non sono sovrapposte nel tempo o nello spazio, il risultato ottenuto è riportato nella figura 8a. In off-resonance, l'ampiezza del segnale misurata da LIA è pari a zero, mentre la fase del segnale misurata da LIA salta tra valori negativi e positivi. Mentre, quando le travi sono sovrapposte nello spazio, spostando la linea di ritardo in un intervallo appropriato, i risultati ottenuti sono riportati nella figura 8b. Il segnale misurato da LIA aumenta e raggiunge il suo massimo quando le travi sono perfettamente sovrapposte nel tempo, mentre la fase inizia a raggiungere un valore fisso durante il momento in cui le travi sono sovrapposte nel tempo.
Le immagini di assorbimento ottenute utilizzando un singolo fascio (Ti:Sa o OPO) delle stesse perle di polistirolo sono rappresentate nella Figura 9a,b con barre di scala di 6 m. Per acquisire le immagini SRS, la linea di ritardo viene impostata sulla posizione ottenuta nella Figura 7b, una tipica immagine SRG è illustrata nella Figura 10 con una barra in scala di 6 m.
Figura 1: Layout schematico del sistema di microscopio f-SRS. OPO - oscillatore parametrico ottico; Ti:Sa - Laser Titanium-Sapphire; Specchi a banda larga femtosecondi minofonici; FFM/AM - Specchio Flip-Flop/AutocorrelatoR Mirror; DM1, DM2 - specchi dicroici; DL - Riga di ritardo; AC - autocorrelatore ; EOM - modulatore elettro-ottico; FG - generatore di funzioni; GM - Specchio Galvo; Obj1, Obj2 - obiettivi del microscopio; PD - fotodiode; DAQ - sistema di acquisizione dati; PC - personal computer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del metodo di trasferimento della modulazione ad alta frequenza. Nella figura interna, i due raggi laser prima dell'interazione all'interno del campione e della sonda modificata a causa delle interazioni della sonda e della pompa all'interno del campione sono rappresentati. Il tempo è rappresentato in ns. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione del supporto fotodiodo con sistema di montaggio meccanico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Schematica del sistema di acquisizione dei dati. PD - fotodiode, LIA - amplificatore lock-in, DS , sistema di rilevamento, controllo del microscopio MC, sistema di acquisizione dati DAQ, PC e personal computer. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Funzione autocorrelatore di OPO (a) e Ti:SA (b). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Funzione di correlazione incrociata di OPO e Ti:Sa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagine CCD di perline di polistirolo.
Figura 8: Ampiezza e fase del segnale SRS misurato dall'amplificatore lock-in: risonanza spenta (a sinistra) e in risonanza (a destra) . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Trasmissione immagini di perline di polistirolo ottenute da OPO (a) e Ti:Sa (b). Barra di scala : 16 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Immagine SRS di perline di polistirolo. Barra della scala: 12 m.
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Discussion
La microscopia SRS ha portato l'imaging senza etichette a nuove altezze, in particolare negli studi di strutture biologiche complesse come i lipidi, fondamentali per le cellule e l'architettura cellulare. I lipidi sono coinvolti in molteplici percorsi fisiologici come la produzione di membrane biologiche, e servono come precursori biosintetici e trasduttori di segnale10. I lipidi sono confezionati in organelli intracellulari specializzati, chiamati anche goccioline lipidiche (LD). I loro diametri variano da poche decine di nanometri a decine di micrometri11,12. LDs non solo partecipano abbondantemente in adipose- e steroide-producendo cellule, ma sono presenti anche in altre linee cellulari. Gli LD cooperano in diversi processi fisiologici come l'immagazzinamento dei lipidi. Essi sono presenti in primo piano nelle patologie comuni (ad esempio, metabolismo alterato del colesterolo)13,14.
Tradizionalmente, la visualizzazione dei lipidi si ottiene utilizzando la microscopia a fluorescenza e le cellule fisse con etichettatura a coloranti neutro specifico per i lipidi10. Va notato che, poiché i lipidi sono di dimensioni inferiori rispetto alle proteine e al DNA, possono verificarsi cambiamenti strutturali e funzionali e artefatti indesiderati quando si aggiungono fluorofori15,16. SRS ha dimostrato di essere potente per studiare strutture ricche di lipidi. I lipidi sono abbondanti nei gruppi C-H2. Pertanto, i picchi relativamente isolati associati agli stati vibrazionali del legame C-H a 2845 cm-1 nei loro spettri Raman forniscono una firma unica per i lipidi all'interno di una cellula. Sfortunatamente, poiché le firme vibrazionali differenziabili sono finite, è piuttosto difficile distinguere una biomolecola bersaglio dalle altre specie correlate all'interno di cellule che condividono legami chimici simili. Tuttavia, è possibile aggiungere piccole sonde vibrazionali Raman-attivo (ad esempio, alchine e isotopi stabili) per ottenere la specificità per l'imaging di piccole biomolecole17.
Per le applicazioni biologiche e biomediche in vivo, la mappatura simultanea di varie specie chimiche in un dato campione è necessaria per investire la co-distribuzione e le correlazioni dinamiche tra coppie di biomolecole18,19. Pertanto, sono stati fatti molti sforzi per ottenere più contrasti chimici. Nell'opzione più semplice di imaging multicolore, per immaginare diverse modalità Raman di un campione, la frequenza del fascio di pompaggio o Stokes sono sintonizzati in scansioni sequenziali18. Tuttavia, l'utilizzo dell'approccio di ottimizzazione della lunghezza d'onda può causare la perdita di informazioni di co-localizzazione di diverse modalità Raman, soprattutto quando il campione si trova in un ambiente dinamico18.
Come conseguenza dell'eccitazione non lineare, SRS offre capacità intrinseche di risoluzione 3D del legame chimico selezionato all'interno di campioni biologici20. La ricostruzione del volume del legame chimico selezionato e delle sue distribuzioni spaziali può essere ottenuta semplicemente raccogliendo immagini SRS in un piano focale diverso lungo l'asse z. Poiché le immagini vengono acquisite con elevate risoluzioni spaziali e temporali, è possibile ottenere altri pezzi di informazioni chiave (ad esempio, struttura 3D, composizione chimica, ecc.) sul campione biologico.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Apprezziamo V. Tufano di IMM CNR per la sua preziosa assistenza tecnica e Giacomo Cozzi, product specialist di Nikon Instruments, per discussioni utili e supporto continuo. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dai programmi operativi nazionali italiani PONa3 00025 (BIOforIU) e dal progetto euro-Bioimaging sulle infrastrutture di ricerca paneuropee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
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