Summary
Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.
Abstract
Stimüle Raman saçılma (SRS) mikroskopisi yakın kızılötesi uyarma ışığı kullanır; Bu nedenle, birçok multi-foton mikroskobik görüntüleme özelliklerini paylaşır. SRS görüntüleme modalitesi, uygun bant geçiren filtreleri ve kilitleme amplifikatörü (LIA) algılama düzenine sahip, Taramasız bir İleri dedektör ile donatılarak ticari lazer tarama mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Tipik bir SRS mikroskobu Şematik düzeni aşağıdakileri içerir: iki darbeli Lazer kiriş, (yani, pompa ve prob bir tarama mikroskop yönlendirilmiş), hangi görüntü düzleminde hem boşluk ve zaman içinde çakışan olmalıdır, daha sonra içine bir mikroskop amaç odaklı iki tarama aynalar (SMs) ile örnek, hangi raster bir x-y düzlem arasında odak nokta. Numune ile etkileşimden sonra, iletilen çıkış darbeleri üst objektif tarafından toplanır ve ters mikroskopla takılan ileri algılama sistemiyle ölçülür. Pompa darbeleri bir optik filtre yığınıyla kaldırılır, ancak numunenin odak hacminde oluşan SRS sürecinin sonucu olan prob darbeleri bir fotodiyot (PD) ile ölçülür. PD 'nin okuması modülasyon derinliği ayıklamak için LIA tarafından kipi çözülmüş. İki boyutlu (2D) görüntü, ileri algılama birimini mikroskop tarama ünitesi ile senkronize ederek elde edilir. Bu yazıda, SRS mikroskobu uygulanması, 3 μm çapları ile polistiren boncukların etiket içermeyen görüntülerinin raporlanması ve başarıyla gösterilmiştir. Bu SRS mikroskoplar ticari olarak mevcut değildir, bu nedenle bu özelliklerin yararlanmak için, ev yapımı inşaat tek seçenektir dikkati çekiyor. SRS mikroskopisi birçok alanda popüler hale geldiğinden, SRS mikroskop uygulamasının bu dikkatli açıklamasını bilimsel topluluk için çok yararlı olabilir inanılmaktadır.
Introduction
Yaşam bilimi uygulamalarında SRS mikroskobu, etiket içermeyen görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. SRS mikroskobu temel fikri vibrasyonel kontrast gücünü ve birkaç saniye içinde görüntü edinme yeteneğini birleştirmek için.
SRS, iki lazer ışınları frekansları arasındaki frekans farkının (farklı frekanslarda pompa sinyali ve Stokes sinyali) incelendiği bir numunenin moleküler titreşimi ile eşleştiğini, uyarılmış Raman saçılma ve önemli bir Stokes sinyalinde artış. Doğrusal Raman spektroskopisinin aksine SRS, gelen ışık alanlarına doğrusal olmayan bir bağımlılığı sergiler ve tutarlı radyasyon üretir. SRS 'nin iki temel avantajı vardır: 1) hız, hangi görüntüleri örnek hareket veya bozulma kaynaklanan eserler daha az duyarlı hale getirir, ve 2) mükemmel bir sinyal-gürültü oranı (SNR). Buna ek olarak, SRS spontan Raman ile özdeş bir spektrum sergiler ve SRS sinyal kimyasal Bond heyecanlı konsantrasyon ile doğrusal orantılı1,2,3,4, 5' i yapın.
Mikroskobu olarak, femtosaniye (FS) SRS deneysel ayarlama, hızlı aynalar tarama ünitesi (Şekil 1)6,7,8ile donatılmış, ters çevrilmiş bir optik mikroskop ile entegre edilmiştir. Bu mikroskop uygulamak için iki Pulse lazer kaynakları kullanılır. İlk bir FS-Ti: sa yaklaşık 140 FS nabız süresi ile, 80 MHz tekrarlama oranı ve 680-1080 nm aralığında emisyon dalga boyları. İkinci, prob ışını olarak kullanılan ve Ti: SA tarafından pompalanan, bir femtosaniye senkronize optik parametrik osilatör (Sopo), yaklaşık 200 FS nabız süresi ile, 80 MHz tekrarlama oranı, ve emisyon dalga boyları aralığında 1000-1600 Nm. Ti: SA ve SOPO ışını arasındaki asgari foton enerji farkının 2500 cm-1olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle, bu kombinasyonu kullanarak lazer sistemleri, sadece yüksek frekanslı C-H Bölgesi (2800-3200 cm-1) Raman Spectra keşfedilebilir6,7,8.
SRS mikroskop ayarlamak için, art arda paragraflarda açıklanan dikkate alınması gereken üç önemli sorunlar vardır. İlk yüksek frekanslı modülasyon transfer yönteminin uygulamasıdır (bkz. Şekil 2 ve adım 2,1 bir açıklama için protokol). SRS deneysel soruşturmada, önemli bir parametre sistemin hassasiyetidir. SRS sinyali, uyarma kirişlerinin yoğunluğunda küçük bir değişiklik olarak algılanır; Bu nedenle, lazer yoğunluğu gürültü ve atış gürültüsü ile bozulabilir. Bu sorun, bu sistemi yüksek frekanslı modülasyon aktarım yöntemiyle bütünleştirerek üstesinden gelebilir (bkz. Şekil 2 ve adım 2,1 Ayrıntılar için protokol). Bu yöntemle pompa modülatmek için bir elektro-optik Modulatör (EOM) kullanılır. Prob ışınına aktarılan modülasyon daha sonra bir PD tarafından optik filtreler yığını ile pompa ışını bloke sonra tespit edilebilir [Raman kazanç uyarılmış (SRG) algılama modu]. PD çıkışı, ölçülen sinyali demodüle eden bir kilit amplifikatörüne (LıA) düşük geçiş filtresine bağlanır. Işın modülasyon sıklığını 1 MHz 'in üzerindeki frekanslara artırarak, PDs 'nin içsel sınırı elde edilebilir.
İkinci konu göz önünde bulundurulması gereken ileri algılama yürütmek ve aynı zamanda Brightfield mikroskop gözlem korumak için izin mekanik bir montaj kurulumu. Ayrıca, görüntü üretimi sırasında mekanik titreşim nedeniyle gürültüyü azaltmak ve algılama sisteminin kesin yeniden konumlandırılmasına izin vermek gerekir (bkz. Şekil 3 ve protokol 2,2 adım).
Üçüncüsü, faz duyarlı algılama şeması tarafından alınan sinyalin senkronizasyon, mikroskobun tarama kafası tarafından izlenen örnek üzerine konumlandırılmış kiriş ile. Görüntüleri gerçekleştirmek için, SMs tarama kafası birimine bağlı mikroskop denetleyici tarafından kullanılabilir hale gelen üç TTL sinyalleri gerektirir: piksel saat, hat senkronizasyonu, ve çerçeve senkronizasyonu. Senkronizasyon, bir PCI kartı, üç TTL sinyalleri ve LIA6,7,8çıkış kanalında bir voltaj sinyalinin alınması kullanılarak kontrol edilerek elde edilir. Ev yapımı bir yazılım geliştirilmiş ve önceden açıklanan6,7,8, senkronizasyon sisteminin donanımı Şekil 4' te rapor edilirken.
SRS görüntüleme yapılırken temel bir prosedür mikroskop hizalaması. Bu, ardışık paragraflarda açıklanan dört adım boyunca gerçekleştirilir. İlk iki kiriş uzamsal çakışıyor (protokol adım 3,1 bakın). Bu deneysel ayarda, iki kiriş, dikrotik bir ayna ile birlikte dağınık bir şekilde birleşmiştir. Ön adım OPO ve TI: sa hizalaması, böylece her mikroskop ulaşır. Daha sonra, bir referans ışını olarak OPO göz önüne alındığında ve bir pozisyon duyarlı Dedektör yararlanarak, TI: sa dağınık OPO için örtüşmesi.
İkinci önemli yönü iki kiriş temporal çakışıyor (protokol adım 3,2 bakın). Onlar OPO konut içinde biraz farklı kiriş yolları takip beri pompa ve OPO kirişler mükemmel senkronize9, onlar yaklaşık 5 NS ve 5 cm uzamsal fark bir zaman GECIKMESI var OPO çıkışında bile. Bu nedenle, TI: SA ve OPO örnekteki geçici çakışmayı sağlamak için optik yeniden zamanlanmış gerektirir. Bu genellikle, bu durumda Ti: SA ve mikroskop arasında eklenen ince ayarlanabilir optik gecikme hattı ile gerçekleştirilir (bkz. Şekil 1). İki kiriş temporal çakışmayı elde etmek için iki teknik kullanılır. İlki hızlı PD ve osiloskop kullanılarak gerçekleştirilir, ikincisi ise otomatik ve çapraz optik korelasyonlar üzerine kuruludur. İlk tekniği kullanarak, iki kiriş kaba bir çakışma elde edilir (belirsizlik 10 PS), iki kiriş doğru temporal örtüşme bir çapraz-korrelatör (1 FS çözünürlüğü) kullanılarak elde edilir iken.
Üçüncü önemli yönü mikroskop içinde iki kiriş hizalama (protokol 3,3 adım bakın). Örnek bir ön beyaz ışık gözlem istenen görüş alanı (FOV) bireyye sağlar. Daha sonra, mikroskopla bir yan liman tarafından mikroskop giren lazer kirişler, üst parçaya monte edilen PD 'ye ulaşmak için hizalanır (Şekil 3). Ancak, doğru görüntü edinme için, bir dizi parametreyi ayarlamak gereklidir (örneğin, piksel boyutu ve piksel bekleme süresi). Örnekleme sıklığı, bir görüntüdeki tüm bilgileri korumak için Nyquist 'in teoremi tarafından uygulanan kısıtlamaya saygı göstermelidir, ancak her pikselde ölçülen uzamsal koordinatlar ve SRS değerinin arasında doğru bir yazışmalar için, entegrasyon süresi eşit veya piksel bekleme süresi ile karşılaştırılabilir olmalıdır.
Mikroskop hizalama son adımda, çok sayıda testler uzamsal ve temporal hizalama optimize etmek için gerçekleştirilir (protokol adım 3,4 bakın). Bir dizi iletim görüntüleri (TI) her ikisi için Ti: SA ve OPO uzamsal çakışmayı en iyi duruma getirmek için elde edilir. Bir TI 'de, tek bir kiriş kullanılır ve örnekteki iletilen ışın yoğunluğu bir PD ile ölçülür. TI ise OPO tarafından gerçekleştirilen durumda, PD çıkış sinyali doğrudan PCI kartına bağlanır, TI durumunda Ti: SA tarafından gerçekleştirilen durumunda, PD çıkış sinyali LIA bağlı ve LıA analog çıkış PCI kartına bağlanır. İletim görüntüleri FOV optimize etmek için çok yararlıdır, aydınlatma, mikroskop hedefleri odak pozisyonu ve iki kiriş dağınık6,7,8olup olmadığını kontrol etmek.
Pompa ve prob ışınının temporal çakışmanın optimizasyonu, 3,3 FS zaman vardiyasına karşılık gelen 0,001 mm 'lik adımlarla gecikme çizgisini tarayarak ve çapı 3 μm olan polistiren boncuk numunesi tek bir noktada SRS ölçümü gerçekleştirerek elde edilir. Bir SRS sinyalinin amplitüdü, prob pompası gecikmesinin bir işlevi olarak, LIA 'dan değerleri ölçer ve iki kiriş6,7,8ile tam temporal örtüşme ile karşılık gelen maksimum sağlar. Sonuçlandırmadan önce, tüm tartışılan adımlar yüksek kaliteli bir görüntü elde etmek için zorunlu olduğunu unutulmamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lazer sistemini başlatma
- Soğutucular sıcaklığının 20 °C ' de veya altında muhafaza edildiğini kontrol edin.
- Nem kontrol biriminin düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol edin ve nem% 40 civarında bir değere tutulur.
- Kılavuzundaki talimatları kesinlikle izleyerek Ti: sa lazerini açın.
- 810 nm için dalga boyu ayarlayın.
- OPO ve bağlı mini bilgisayarı açın. OPO lazer denetleyen uygulamayı çalıştırın.
- Seçin bypass if 100% TI: sa lazer çıktısı OPO kutusunun çıkışında gereklidir.
- TI: sa lazer çıkışının% 20 ' si ve OPO lazer çıkışı OPO kutusunun çıkışında gerektiğinde bypass seçeneğinin işaretini kaldırın.
- TI: sa 'nın deklanşöre açın ve TI: sa ışını OPO girişine bırakın.
- İki lazer ışınlarını OPO çıkışına basarak sinyal-dışarı ve pompalanarak bırakın .
- Her iki lazer ti kadar bekleyin: SA ve OPO stabilize (yaklaşık 45 – 60 dakika).
- Her iki TI için OPO kutusunun çıkışında ışın spot doğrulayın: SA ve OPO bir kağıt dedektörü kartı kullanarak ve güç ölçer kullanarak gücü kontrol edin.
- 1076 nm için OPO lazer dalga boyu tune.
- Hizalama gerçekleştirmek için her lazer ışını için ~ 10 mW güç azaltın.
2. mikroskop kurma
-
Yüksek frekanslı modülasyon transfer yönteminin uygulanması
- Modülatörün optik hizalama prosedürünü gerçekleştirin, böylece Ti: sa ışını herhangi bir bozulma olmadan girer ve çıkar.
- Fonksiyon jeneratörü açın ve TTL sinyali oluşturmak (amplitüm ile kare dalga = 5 V, ofset = 2,5 V, frekans = 5 MHz).
- TTL sinyalini bir T Kavşağı kullanarak iki parçaya bölün; (bkz. Şekil 2) için bir tane Eom ve diğer kilit AMPLIFIKATÖR (LIA) için.
- Tüm sinyal seviyelerini osiloskop ile kontrol edin.
- LIA 'yı açın ve jeneratör çıkış kanalını LIA 'nın referans kanalına bağlayın.
- Jeneratör çıkış kanalını EOM 'un yüksek voltajlı güç amplifikatörüne bağlayın.
- Amplifikatörü açın ve voltajı neredeyse maksimum seviyeye ayarlayın. EOM çıkışında ışın gücünü izleyin.
-
PD 'yi saptamak ve x ve y göreli hareketi atamak için mekanik montajın entegrasyonu
Not: mikroskop Ile, x ve y yönlerde hareket kontrolü olan bir mikrometre ile donatılmış, harici bir montaj tanıtıldı.- X ve y yönleri boyunca hareketlere izin vermek için iki seyahat çevirisi aşaması bağlayın (bkz. Şekil 3).
- Yüksekliği Ø 1,5 "sonrası uygun yükseklikte düzeltin.
- PD 'yi harici bir montaja bağlayın.
- PD 'de ışın gücünü maksimize edin, montaj bağlı mikrometre kullanarak PD konumlarını (x ve y koordinatları) ayarlayın (bkz. Şekil 3).
3. mikroskop hizalama
- Kirişler uzamsal örtüşme
Not: bir referans olarak OPO ışını göz önüne alındığında ve bir pozisyon duyarlı Dedektör yararlanarak, TI: sa aşağıdaki prosedüre göre OPO için çakışan olmalıdır:- OPO ve TI: sa lazer kirişler her ikisi de mikroskop ulaşmak için hizalayın.
- Lazer ışın pozisyon sensörleri dedektörlerini dikroik Mirror 1 ve Mirror 6 arasında iki pozisyonda konumlandırın, ilk pozisyon dikroik Mirror 1 ' e yakın ve ikincisi ise ayna 6 ' ya yakın. Her pozisyon için, OPO ışını x ve y koordinatlarını algılamak için sensörleri kullanın ( Şekil 1' i izleyin).
- Ti: sa lazer ışını x ve y koordinatlarının, sensörler dedektörlerinin her iki pozisyonunda da aynı OPO olduğunu doğrulayın. Bazı konumlarda Ti: SA ve OPO koordinatlarının çakıştığı takdirde, farkı dengelemek için bitişik aynaya eğim ayarı yapın ( Şekil 1' i izleyin).
- M6-M7 arasındaki yol için tı: sa kiriş konumlarını OPO ile hizalamak için aynı prosedürü izleyin ( Şekil 1' i izleyin).
- Kirişlerin temporal senkronizasyonu
- Hızlı fotodiyot artı osiloskop kullanımı:
- TI: SA ve OPO ışınlarının yayılmasını durdurun ve OPO ışını önünde (M6 ile M7 arasında) hızlı bir dedektör yerleştirin.
- Ti: sa lazer kutusu tarafından sağlanan tetik sinyalini Kanal 2 ' de bir osiloskop ile bağlayın.
- Dedektör kablosunu Kanal 1 ' deki osiloskop ile bağlayın ve OPO temporal profilini görselleştirin.
- Zaman (abscissa) maksimum değerine karşılık gelen osiloskop tarafından ölçülen, yani T1 kaydedin.
- OPO ışını durdurun ve Ti: sa ışını serbest bırakın.
- Ti: sa geçici profilini görselleştirin ve saat (abscissa) en büyük değerine karşılık gelen, yani T2 kaydedin.
- İki kiriş çakışıyor gecikme satırını kullanarak T1-T2 arasındaki farkı en aza indirin. Bizim durumumuzda minimum ölçülebilir fark 10 PS 'dir.
- M6 ve M7 arasındaki hızlı dedektörü çıkarın.
- Otokemanın kullanımı:
Not: Şekil 1 ' de gösterilen şematik diyagramda, kirişlerin optik yollarına müdahale etmeden bir otomatik düzeltme yüklenir. Ek olarak, ek bir ayna, Beam 'i otomatik geçişe aktarmak için M6 ve M7 arasında Flip-flop montajına (FFM/AM olarak adlandırılır) takılır ve monte edilir.- Işını otomatik geçişe yönlendirmek için ' ı çevirin.
- TI: sa durdurun ve OPO bırakın.
- Otomatik Işınlayıcının kiriş uzaklık ayarı vida mikrometre normal konuma (8,35 mm) ayarlayın.
- Otomatik değiştirme denetleyicisindeki güç ve yazılım uygulamasını kontrol kişisel bilgisayar üzerinde başlatın.
- The OPO ışını FFM/AM 'dan giriş aynadan otomatik geçişe yansıtın.
- Otomatik ışınlayıcıyı hizalama penceresindeki ışın bir yansıma spot (bir kağıt Dedektör kartı kullanarak) kontrol.
- Kiriş veya düşük ışın yoğunluğu durumunda, FFM/AM 'nin konumunu ve yönünü optimum ölçüde ayarlayın ve lazer darbe sinyalini maksimize etmek için giriş aynasını (otomatik geçiþ üzerine monte edilmiş) ayarlamaya çalışın. Aplikasyon sinyali Şekil 5A'da gösterildiği gibi elde edilir.
- Dur OPO ve proje Ti: sa Beam FFM/AM gelen otomatik olarak giriş ayna içine. 3.2.2.6 ve 3.2.2.7 adımları yineleyin. Otomatik değiştirme sinyali, Şekil 5B'de gösterildiği gibi elde edilir.
- Kiriş uzaklık ayarı vida mikrometre konumunu çapraz konuma (7,30 mm) ayarlayın.
- İki kiriş de serbest bırakın.
- İki kiriş OPO ve TI: sa çakışan elde etmek için gecikme satırını tarayın. Çapraz-korrelatör sinyali Şekil 6' da gösterildiği gibi elde edilir.
- Ayna çevir FFM/AM böylece kirişler M7 ulaşabilir ve mikroskop baş tarama.
- Hızlı fotodiyot artı osiloskop kullanımı:
- Mikroskop hizalama
- Beyaz ışık mikroskobik gözlem gerçekleştirin:
Not: mikroskobik gözlem öncesinde, mikroskobun düzgün hizalandığından emin olun.- 3 μm çapları ile polistiren boncuklar dağılmış olan bir fosfat tampon çözeltisi oluşan test örneğini hazırlayın. Çözüm iki cam slaytlar bir sandviç içine yerleştirilir.
- Mikroskop ve beyaz ışığın güç kaynağını açın. Beyaz ışık altında gözlem için Kılavuzu izleyin.
- Numuneyi aydınlatmak için bir kondansatör kullanın. Işık toplamak için 60x amacı kullanın. Numuneyi sahne alanı üzerine yerleştirin. 60x mikroskop hedefin odak konumunu optimize edin.
- İlgi FOV seçin. Numunenin CCD görüntüsünü alın (Şekil 7).
- Beyaz ışığın güç kaynağını kapatın.
-
Femtosaniye lazer kirişler ile mikroskop hizalama: OPO ve TI: SA
- 60x mikroskop objektif objektifi geçici olarak geri çekmek için Escape düğmesini kullanarak kondansatörü çıkarın. 60x mikroskop objektif objektif optik yol kapalı hareket, nosepiece döndürme.
- Dedektör harici mekanik montaj kullanarak mikroskop üst kısmına monte edin. Dedektör çıkışını 50 Ω düşük geçişli filtreden osiloskop 'a bağlayın ve OPO sinyalini izleyin.
- Tarayıcı kafasını denetleyen işlemciyi açın. OPO ışını mikroskop tarayıcı kafası içine proje.
- Mikroskop içindeki ışın konumunu kontrol edin, ışın konumu merkezi veya merkezi yakınında olduğundan emin olun.
- PD 'nin kafasının içindeki ışın konumunun merkezde olduğunu kontrol edin.
- Bir x-y çevirmen kullanarak Dedektör tarafından ölçülen gücü maksimize edin.
- Işını OPO 'dan TI: sa 'ya geçin ve titanyum Safir lazer için maksimum sinyalin de elde edildiğini doğrulayın. Bu, her iki kiriş iyi hizalanır gösterir.
- Işın hizalamasını tamamlayın, 60x mikroskop objektif objektifi tanıtın ve nosepiece geri döndürme.
- 60x mikroskop objektif objektif sonuçlandırılmış odak kazanmak için mikroskop üzerinde yönlendirmesi düğmesini kullanın.
- Numune dokunmadan veya rahatsız etmeden kondansatör yerine büyütme 40X ile hedefi yerleştirin.
- Beyaz ışık mikroskobik gözlem gerçekleştirin:
- Kirişler uzamsal ve temporal eşitlemeler optimizasyonu
- Geçici senkronizasyon
- Her iki kiriş için mikroskopla 30 mW 'a kadar ölçülen TI: SA ve OPO gücünü ayarlayın. Eğer pompa ve prob boncuklar vibrasyonel frekansı ile rezonans değildir, böylece bir önceki göre farklı bir değere OPO dalga boyu ayarlayın.
- Her iki kirişleri (TI: SA ve OPO) mikroskop girmek için serbest bırakın.
- Tarama gecikmesi hattı bilgisayarlı Çeviriciyi çalıştırın ve gecikme satırının her konumu için ölçülen yoğunluğu LıA tarafından kaydedin. Gecikme çizgisi taraması tamamlanıncaya kadar bekleyin. Elde edilen temporal profil Şekil 8A'da görselleştirilir.
- Eğer pompa ve prob boncuklar vibrasyonel frekansı ile rezonans içinde böylece tekrar 1076 nm için OPO dalga boyu ayarlayın. Adım 3.4.1.3 tekrarlayın (elde edilen temporal profil Şekil 8B'de görselleştirilir).
- SRS görüntüleri almak için gecikme satırında elde edilen örtüşme ışın konumunu ayarlayın.
- Kirişler uzamsal senkronizasyon
Not: iletim görüntüleri FOV optimize etmek için yararlıdır, aydınlatma, ve mikroskop hedefleri odak pozisyonu, ve iki kiriş dağınık çakışan olup olmadığını kontrol etmek.- OPO iletim görüntü edinme
- Ti: sa ışını durdurun ve 8 mW için OPO gücünü azaltın.
- Dedektör okumayı veri edinme kartına bağlayın.
- Mikroskop tarama konsolu ile birlikte veri edinme programı çalıştırın.
- Dosyayı kaydedin ve görüntüyü almak için verileri işlemek. Ham görüntü Şekil 9a'de gösterildiği gibi görünür.
- TI: sa 'nın iletim Görüntü alımı
- OPO ışını Durdur ve Ti: sa gücünü 2,5 – 4.5 mW 'a azaltın.
- Dedektörü, veri edinme kartı ile LıA ve LıA okuma çıkışları ile bağlayın.
- 3.4.2.1.3 ve 3.4.2.1.4 adımları yineleyin. RAW görüntü Şekil 9B'de gösterildiği gibi görünür.
- OPO iletim görüntü edinme
- Geçici senkronizasyon
4. SRS görüntü edinme
Not: veri depolamak için adanmış bir algoritma gerçekleştirildi. Bu aşağıdaki görüntü formatlarını destekler: 512 px x 512 px ve 256 px x 256 px, 16 s, 8 s, 4 s ve 2 s edinme süreleri ile.
- Pompa darbeleri (TI: sa) çıkarmak ve sadece Stokes sinyalini (OPO) elde etmek için 40X objektif ve PD arasında bir filtre yığını tanıtın.
- Pompa sinyalini 810 nm 'ye 8 mW odaklı güç ile ayarlayın ve tipik bir C-H bağı olan Polistiren (Raman kayması, 3054 cm− 1) araştırılması Için 8 MW odaklı güç ile 1076 nm 'ye kadar prob sinyali ver.
- Dedektör, LIA ve LIA okuma ile veri edinme kartına bağlayın.
- Görüntü edinme piksel biçimini gereksinim uyarınca ayarlayın ve edinme süresini ayarlayın.
- Mikroskop denetleyicisini denetleyen programı çalıştırın.
- Mikroskop denetleyici, algılama sistemi ve DAQ arasında senkronizasyon gibi davranan adanmış algoritma programını çalıştırın (bkz. Şekil 4).
- Toplama tamamlandıktan sonra matris dosyasını kaydedin.
- RAW veri dosyasını içe aktarın ve görüntüyü ımagej yazılımını kullanarak gerekli formatta (genellikle. tif formatında kaydedilmiş) kaydedin. Görüntü Şekil 10' da gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 7' de SRS ölçümü (örneğin tek BIR noktada SRS ölçümü) örneği bildirilir. Kirişler zaman veya uzayda örtüşmez olduğunda, elde edilen sonuç Şekil 8A'da bildirilir. Off-rezonansta, LıA tarafından ölçülen sinyalin genliği sıfırdır, ancak LıA tarafından ölçülen sinyal faz negatif ve pozitif değerler arasında atlar. Ancak, kirişler uzayda örtüşürken, gecikme çizgisini uygun bir aralıkta hareket ettirirken, elde edilen sonuçlar Şekil 8B'de bildirilir. LıA tarafından ölçülen sinyal, kirişler zaman içinde mükemmel bir şekilde örtüştüğinde maksimum seviyeye ulaşırken, fazlar zaman içinde örtüşen zaman içinde sabit bir değer elde etmeye başlar.
Aynı polistiren boncuk tek bir kiriş (TI: sa veya OPO) kullanılarak elde edilen emilim görüntüleri Şekil 9a, b ölçek çubukları 6 μm ile temsil edilir. SRS görüntülerini elde etmek için gecikme çizgisi şekil 7b'de elde edilen konuma ayarlanmıştır, tipik bir SRG görüntüsü Şekil 10 ' da 6 μm ' lık bir ölçek çubuğu ile gösterilir.
Şekil 1: f-SRS mikroskop sisteminin Şematik düzeni. OPO = optik parametrik osilör; TI: sa = titanyum-Safir lazer; M1-M7 = femtosaniye genişbant aynalar; FFM/AM = Flip-flop aynası/otomatik Relator aynası; DM1, DM2 = dikroik aynalar; DL = gecikme çizgisi; AC = otomatik değiştirme; EOM = elektro-optik modülatör; FG = fonksiyon jeneratörü; GM = Galvo aynası; OBJ1, Obj2 = mikroskop hedefleri; PD = fotodiyot; DAQ = veri edinme sistemi; PC = kişisel bilgisayar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: yüksek frekanslı modülasyon transfer yönteminin şeması. Ankastre figürü içinde, iki lazer, numune içinde etkileşimden önce kiriş ve prob etkileşimleri nedeniyle modifiye prob ve numune içinde pompa temsil edilir. Zaman NS temsil edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: mekanik montaj sistemiyle fotodiyot montajı gösterimi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: veri toplama sisteminin şematik. PD = fotodiyot, LıA = kilitleme amplifikatörü, DS = algılama sistemi, MC = mikroskop kontrolü, DAQ = veri edinme sistemi, PC = kişisel bilgisayar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: OPO (a) ve TI: sa (b) ' nın otomatik olarak işlevidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: OPO ve TI: sa 'Nın çapraz korelasyon işlevi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Polistiren boncuk CCD görüntü.
Şekil 8: kilit amplifikatör ile ölçülen SRS sinyalinin genlik ve faz: kapalı rezonans (solda) ve rezonans (sağda) . Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 9: OPO (a) ve TI: sa (b) tarafından elde edilen polistiren boncuk iletim görüntüleri. Ölçek çubuğu = 16 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 10: Polistiren boncuk SRS görüntü. Ölçek çubuğu = 12 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SRS mikroskopisi, özellikle hücreler ve hücresel mimari için temel olan lipidler gibi kompleks biyolojik yapıların çalışmalarda, yeni yüksekliklere etiket içermeyen görüntüleme aldı. Lipidler biyolojik membranların üretimi gibi birden fazla fizyolojik yol içinde yer alan ve biyosentetik öncüleri ve sinyal Dönüştürücüsü olarak hizmet10. Lipidler, lipid damlacıkları (LDs) olarak da adlandırılan özel hücre içi organellere paketlenmiştir. Çapları birkaç onlarca nanometreden onlarca mikrometre11,12arasında değişmektedir. LDs sadece Adipose ve steroid üreten hücrelerde oldukça katılmak değil, aynı zamanda diğer hücre hatlarında da mevcut. LDs lipid depolama gibi çeşitli fizyolojik süreçlerde işbirliği. Onlar yaygın patolojiler (örneğin, değiştirilmiş kolesterol metabolizması)13,14belirgin özellikli vardır.
Geleneksel olarak, lipidlerin görselleştirilmesi floresans mikroskobu ve nötr lipid özel boya etiketli sabit hücreler kullanılarak elde edilir10. Bu lipid proteinleri ve DNA ile karşılaştırıldığında daha küçük boyutlarda olduğu gibi, yapısal ve fonksiyonel değişiklikler ve istenmeyen eserler fluorophores eklendiğinde oluşabilir unutulmamalıdır15,16. SRS lipid açısından zengin yapıları incelemek için güçlü olduğu gösterilmiştir. Lipidler C-H2 gruplarında bol miktarda bulunmaktadır. Bu nedenle, 2845 cm-1 ' de Raman spektrumlarında C-H Bond vibrasyonel durumları ile ilişkili nispeten izole doruklarında bir hücrenin içindeki lipidler için benzersiz bir imza sağlar. Ne yazık ki, farklılaşabilir titreşim imzaları sonlu olduğundan, benzer kimyasal bağları paylaşan hücrelerin içindeki diğer ilgili türlerinden bir hedef biyomolekül ayırt etmek oldukça zordur. Bununla birlikte, küçük Raman-aktif vibrasyon probları (örn., alkinler ve istikrarlı izotoplar) eklemek için, düşük biomoleküller17' nin görüntülenmesi için özgüllüğü elde etmek mümkündür.
Biyolojik ve Biyomedikal in vivo uygulamalar için, belirli bir örnekteki çeşitli kimyasal türlerin eşzamanlı haritalama biyomoleküllerin çiftleri arasında Co-dağıtım ve dinamik korelasyonlar yatırım için gereklidir18,19. Bu nedenle, birden fazla kimyasal kontrastlar elde etmek için birçok çaba yapılmıştır. Çok renkli görüntüleme en basit seçeneğinde, bir numunenin farklı Raman modları görüntü için, pompa ışını veya Stokes ışın frekansı sıralı taramalar18ayarlanır. Ancak, dalga boyu ayarlama yaklaşımının kullanılması, özellikle örnek dinamik bir ortamda18olduğunda, farklı Raman modlarının ortak yerelleştirme bilgilerinin kaybına neden olabilir.
Doğrusal olmayan uyarılma sonucu olarak, SRS biyolojik numuneler içinde seçilen kimyasal bağın içsel 3D çözme yeteneklerini sunar20. Seçilen kimyasal bağın ve uzamsal dağılımlarının hacim yeniden oluşturulması, z ekseni boyunca farklı odak düzleminde SRS görüntüleri toplayarak elde edilebilir. Görüntü yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüklerde elde edildiği için, biyolojik numune hakkında diğer önemli bilgiler (örn., 3D yapı, kimyasal kompozisyon, vb.) elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.
Acknowledgments
Değerli teknik yardımları için ıMM CNR 'dan V. Tufano 'Yu ve kullanışlı tartışmalar ve sürekli destek için Nikon Instruments 'ın ürün uzmanı Giacomo Cozzi 'i takdir ediyoruz. Bu çalışmanın kısmen Italyan Ulusal operatif programlar PONa3 00025 (BIOforIU) ve Euro-Bioımaging büyük ölçekli panEuropean araştırma altyapı projesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T.
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
