Summary
في هذه المخطوطة، يتم وصف تنفيذ مجهر رامان المحفز (SRS)، الذي تم الحصول عليه من خلال دمج مجموعة تجريبية SRS مع مجهر المسح الضوئي بالليزر. ويستند المجهر SRS على اثنين من مصادر الليزر femtosecond (FS)، وTi-الياقوت (Ti:Sa) ومتزامنة البصرية مذبذب بارامتري (OPO).
Abstract
يستخدم الفحص المجهري المحفز لتشتت رامان (SRS) ضوء الإثارة شبه بالأشعة تحت الحمراء. لذلك، فإنه يشارك العديد من خصائص التصوير المجهري متعدد الفوتون. ويمكن الحصول على طريقة التصوير SRS باستخدام المجاهر التجارية المسح بالليزر عن طريق تجهيز مع كاشف إلى الأمام غير منزوع المسح الضوئي مع مرشحات شريطية مناسبة وقفل في نظام الكشف عن مكبر للصوت (LIA). يتضمن التخطيط التخطيطي لمجهر SRS النموذجي ما يلي: شعاعين ليزريين نابضين (أي المضخة والمسبار الموجهفي مجهر المسح الضوئي)، والتي يجب أن تتداخل في كل من المكان والوقت في مستوى الصورة، ثم تركز على هدف المجهر في العينة من خلال اثنين من مرايا المسح الضوئي (SMs)، والتي النقطية بقعة التركيز عبر مستوى س-y. بعد التفاعل مع العينة، يتم جمع نبضات الإخراج المنقولة من قبل هدف علوي وتقاس بنظام الكشف الأمامي المدرج في المجهر المقلوب. تتم إزالة نبضات المضخة بواسطة كومة من المرشحات البصرية، في حين يتم قياس نبضات المسبار الناتجة عن عملية SRS التي تحدث في الحجم البؤري للعينة بواسطة الصمام الضوئي (PD). يتم تخفيض قراءة PD من قبل LIA لاستخراج عمق التشكيل. يتم الحصول على صورة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) عن طريق مزامنة وحدة الكشف الأمامي مع وحدة المسح المجهري. في هذه الورقة، يتم وصف تنفيذ مجهر SRS وثبت بنجاح، فضلا عن الإبلاغ عن الصور خالية من التسمية من حبات البوليسترين بأقطار 3 ميكرومتر. ومن الجدير بالذكر أن المجاهر SRS ليست متاحة تجاريا، وذلك من أجل الاستفادة من هذه الخصائص، والبناء محلية الصنع هو الخيار الوحيد. منذ SRS المجهرية أصبحت شعبية في العديد من المجالات، ويعتقد أن هذا الوصف الدقيق لتنفيذ المجهر SRS يمكن أن تكون مفيدة جدا للمجتمع العلمي.
Introduction
في تطبيقات علوم الحياة، ظهرت SRS المجهرية كأداة قوية للتصوير خالية من التسمية. الفكرة الأساسية للميكروسكوب SRS هو الجمع بين قوة التباين الاهتزازي وقدرتهعلى الحصول على الصور في بضع ثوان.
SRS هي عملية يتطابق فيها فرق التردد بين ترددين من أشعة الليزر (إشارة المضخة وإشارة ستوكس في ترددات مختلفة) مع الاهتزاز الجزيئي لعينة تم التحقيق فيها، مما يسبب تشتت رامان المحفز وحدوث تشتت كبير زيادة في إشارة ستوكس. على عكس مطياف رامان الخطي، يعرض SRS اعتمادًا غير خطي على حقول الضوء الواردة وينتج إشعاعًا متماسكًا. SRS له ميزتان أساسيتان: 1) السرعة، مما يجعل الصور أقل حساسية للمصنوعات اليدوية الناشئة عن حركة العينة أو تدهورها، و 2) نسبة ممتازة للإشارة إلى الضوضاء (SNR). وبالإضافة إلى ذلك، SRS يعرض طيف مماثل لرامان عفوية، وإشارة SRSيتناسب خطيا مع تركيز السندات الكيميائية متحمس 1،2،3،4، 5.
في المجهر لدينا، يتم دمج فيمتوثانية (FS) SRS التجريبية الإعداد مع المجهر البصري المقلوب مجهزة وحدة مسح المرايا السريعة (الشكل1)6،7،8. يتم استخدام مصدرين ليزر نابض لتنفيذ هذا المجهر. الأول هو fs-Ti:Sa مع مدة نبض تبلغ حوالي 140 fs، ومعدل التكرار من 80 ميغاهيرتز، وموجات الانبعاثات في نطاق 680-1080 نانومتر. والثانية، التي تستخدم كشعاع مسبار وتضخها شركة Ti:Sa، هي مذبذب بارامتري بصري متزامن فيفيتوثانية (SOPO)، مع مدة نبض تبلغ حوالي 200 fs، ومعدل تكرار قدره 80 ميغاهيرتز، وأطوال موجية للانبعاثات في نطاق 1000-1600 نانومتر. وتجدر الإشارة إلى أن الحد الأدنى من فرق الطاقة الفوتون بين تي: سا وسوبو شعاع هو 2500 سم-1. لذلك، باستخدام هذا المزيج من أنظمة الليزر، فقط منطقة C-H عالية التردد (2800-3200 سم-1)من رامان الأطياف يمكن استكشافها 6،7،8.
من أجل إنشاء مجهر SRS، هناك ثلاث قضايا حاسمة للنظر فيها، والتي يرد وصفها في الفقرات المتعاقبة. الأول هو تنفيذ طريقة نقل التشكيل عالية التردد (انظر الشكل 2 والخطوة 2-1 من البروتوكول للاطلاع على وصف). في تحقيق تجريبي SRS، معلمة حاسمة هي حساسية النظام. يتم الكشف عن إشارة SRS كتغيير صغير في شدة الحزم الإثارة; لذلك، يمكن أن يكون معطوبا من قبل الضوضاء كثافة الليزر والضوضاء النار. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق دمج هذا النظام مع طريقة نقل التشكيل عالية التردد (انظر الشكل 2 والخطوة 2-1 من البروتوكول للاطلاع على التفاصيل). في هذه الطريقة، يتم استخدام المغير الكهربائي البصري (EOM) لتعديل المضخة. ويمكن بعد ذلك الكشف عن التشكيل المنقول إلى شعاع التحقيق بواسطة PD بعد حجب شعاع المضخة مع كومة من المرشحات البصرية [حفز رامان كسب (SRG) وضع الكشف]. يتم توصيل إخراج PD بواسطة مرشح تمرير منخفض إلى مكبر للصوت قفل في (LIA)، الذي demodulates الإشارة المقاسة. وبزيادة تردد التشكيل للشعاع إلى ترددات تزيد على MHz 1، يمكن الحصول على الحد الجوهري للبارافيات الانسيابية.
المسألة الثانية للنظر هو تركيب جبل الميكانيكية التي تسمح لتنفيذ الكشف إلى الأمام وفي الوقت نفسه للحفاظ على مراقبة المجهر في برايتفيلد. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتعين عليه اخفاخ الضوضاء الناجمة عن الاهتزاز الميكانيكي أثناء توليد الصور والسماح بإعادة تحديد موضع نظام الكشف بدقة (انظر الشكل 3 والخطوة 2-2 من البروتوكول).
وثالثها هو تزامن الإشارة التي اكتسبها نظام الكشف الحساس للمرحلة، مع وضع الحزمة على العينة التي يرصدها رأس المسح الضوئي للمجهر. من أجل تحقيق الصور، تتطلب SMs ثلاث إشارات TTL التي يتم توفيرها من قبل وحدة تحكم المجهر المتصلة بوحدة رأس المسح الضوئي: ساعة بكسل، ومزامنة الخط، ومزامنة الإطار. يتم تحقيق التزامن عن طريق التحكم باستخدام بطاقة PCI، وإشارات TTL الثلاث، والحصول على إشارة الجهد في قناة الإخراج من LIA6،7،8. وقد تم تطوير برنامج محلي الصنع ووصف سابقا6،7،8، في حين يتم الإبلاغ عن الأجهزة من نظام التزامن في الشكل 4.
إجراء أساسي عند تنفيذ التصوير SRS هو محاذاة المجهر. ويتحقق ذلك على مدى أربع خطوات، يرد وصفها في الفقرات المتعاقبة. الأول هو التداخل المكاني لشعاعين (انظر الخطوة 3-1 من البروتوكول). في هذا الإعداد التجريبي، تم الجمع بين الحزمين مكانياً بواسطة مرآة ثنائية. الخطوة الأولية هي محاذاة OPO وTi:Sa بحيث يصل كل المجهر. ثم، بالنظر إلى OPO كشعاع مرجعي والاستفادة من كاشف موقف حساسة، يتم تداخل Ti:Sa مكانيا إلى OPO.
والجانب الحاسم الثاني هو التداخل الزمني لشعاعين (انظر الخطوة 3-2 من البروتوكول). حتى لو كانت المضخةوالحزم OPO متزامنة تماما 9، لأنها تتبع مسارات شعاع مختلفة قليلا داخل السكن OPO، في خروج OPO لديهم تأخير الوقت من حوالي 5 NS والفرق المكاني من 5 سم. لذلك، يتطلب Ti:Sa وOPO إعادة توقيت بصري لضمان التداخل الزمني في العينة. ويتم ذلك عادة مع خط تأخير بصري قابل للضبط بدقة، والذي يتم إدراجه في هذه الحالة بين تي: سا والمجهر (انظر الشكل1). من أجل الحصول على التداخل الزمني لشعاعين، يتم استخدام اثنين من التقنيات. يتم تنفيذ الأول باستخدام PD سريع ومنظار الذبذبات، في حين أن الثاني يستند إلى الارتباطات التلقائية والبصرية. باستخدام التقنية الأولى، يتم الحصول على تداخل تقريبي من شعاعين (عدم اليقين من 10 PS)، في حين يتم الحصول على تداخل زمني دقيق من اثنين من الحزم باستخدام عبر correlator (القرار من 1 fs).
الجانب الحاسم الثالث هو محاذاة الحزم اثنين داخل المجهر (انظر الخطوة 3.3 من البروتوكول). تسمح المراقبة الأولية للضوء الأبيض للعينة بتقسيم مجال الرؤية المطلوب (FOV). بعد ذلك، يتم محاذاة أشعة الليزر، ودخول المجهر عن طريق منفذ جانبيمن المجهر، من أجل الوصول إلى PD شنت على الجزء العلوي (الشكل 3). ومع ذلك، للحصول على صورة صحيحة، يلزم تعيين عدد من المعلمات (على سبيل المثال، بُعد البكسل ووقت البكسل). يجب أن يحترم تردد أخذ العينات القيد الذي تفرضه مفرق Nyquist من أجل الحفاظ على جميع المعلومات في صورة، في حين أن المراسلات الصحيحة بين الإحداثيات المكانية للبيكسلات وقيمة SRS تقاس في كل بكسل، ووقت التكامل من LIA يجب أن تكون مساوية أو مماثلة لوقت يسكن بكسل.
في الخطوة الأخيرة من محاذاة المجهر، يتم إجراء العديد من الاختبارات لتحسين المحاذاة المكانية والزمنية (انظر الخطوة 3.4 من البروتوكول). يتم الحصول على عدد من صور الإرسال (TI) لكل من Ti:Sa وOPO من أجل تحسين التداخل المكاني. في TI، يتم استخدام شعاع واحد، ويتم قياس كثافة شعاع المرسلة من العينة بواسطة PD. في حالة TI التي حققتها OPO، يتم توصيل إشارة إخراج PD مباشرة إلى بطاقة PCI، في حين أنه في حالة TI التي حققتها Ti: Sa، يتم توصيل إشارة إخراج PD إلى LIA ويتم توصيل الإخراج التناظرية من LIA إلى بطاقة PCI. صور الإرسال مفيدة جدا لتحسين FOV، والإضاءة، والموقف البؤري لأهداف المجهر والتحقق مما إذاكانت تتداخل الحزم اثنين من الناحية المكانية 6،7،8.
يتم الحصول على التحسين من المضخة والتداخل الزمني لشعاع المسبار عن طريق مسح خط التأخير مع خطوات 0.001 مم المقابلة ل3.3 fs التحول الزمني وتنفيذ قياس SRS في نقطة واحدة من عينة حبة البوليسترين 3 ميكرومتر في القطر. السعة من إشارة SRS يقيس القيم من ليا، كدالة لتأخير مضخة التحقيق، ويوفر الحد الأقصىالمقابلة مع التداخل الزمني الدقيق من الحزم اثنين 6،7،8. قبل أن تختتم، تجدر الإشارة إلى أن جميع الخطوات التي نوقشت إلزامية للحصول على صورة عالية الجودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. بدء تشغيل نظام الليزر
- تحقق مما إذا كانت درجة حرارة المبردات يتم الاحتفاظ بها عند أو أقل من 20 درجة مئوية.
- تحقق مما إذا كانت وحدة التحكم في الرطوبة تعمل بشكل صحيح ويتم الحفاظ على الرطوبة في قيمة حوالي 40٪.
- تشغيل الليزر Ti:Sa، اتباع بدقة الإرشادات في الدليل.
- تعيين الطول الموجي إلى 810 نانومتر.
- قم بتشغيل OPO والكمبيوتر المصغر المتصل. تشغيل التطبيق الذي يتحكم في ليزر OPO.
- حدد الالتفافية إذا كان هناك حاجة إلى 100٪ من إخراج الليزر Ti:Sa عند الخروج من مربع OPO.
- قم بإلغاء تحديد الالتفافية إذا كانت هناك حاجة إلى 20% من إخراج الليزر Ti:Sa وإخراج الليزر OPO عند الخروج من مربع OPO.
- فتح مصراع Ti:Sa والإفراج عن شعاع Ti:Sa إلى إدخال OPO.
- الافراج عن اثنين من أشعة الليزر في خروج OPO عن طريق النقر على إشارة الخروج ومضخة خارج.
- انتظر حتى تستقر كل من الليزر Ti:Sa وOPO (حوالي 45-60 دقيقة).
- تحقق من بقعة الحزمة عند مخرج مربع OPO لكل من Ti:Sa وOPO باستخدام بطاقة كشف الورق وتحقق من الطاقة باستخدام عداد الطاقة.
- ضبط الطول الموجي الليزر OPO إلى 1076 نانومتر.
- تقليل الطاقة إلى ~ 10 mW لكل شعاع ليزر لأداء المحاذاة.
2. إعداد المجهر
-
تنفيذ طريقة نقل التشكيل عالية التردد
- تنفيذ إجراء المحاذاة البصرية لمغير بحيث يدخل شعاع Ti:Sa ويخرج دون أي تشويه.
- تشغيل مولد وظيفة وتوليد إشارة TTL (موجة مربعة مع السعة = 5 V، أوضو = 2.5 V، تردد = 5 ميغاهيرتز).
- تقسيم إشارة TTL إلى جزأين باستخدام تقاطع T; واحدة ل [إم] والأخرى ل ال [لوك-ين] مضخم ([ليا]) (رأيت رقم 2).
- تحقق من جميع مستويات الإشارة مع الذبذبات.
- تشغيل LIA وربط قناة إخراج مولد إلى القناة المرجعية LIA.
- توصيل قناة إخراج مولد إلى مكبر للصوت الطاقة الجهد العالي من EOM.
- تشغيل مكبر للصوت وتعيين الجهد إلى مستوى أقصى تقريبا. مراقبة قوة الحزمة عند مخرج EOM.
-
دمج التركيب الميكانيكي لإصلاح PD وتعيين س وy الحركة النسبية
ملاحظة: مع المجهر، يتم إدخال جبل خارجي، ومجهزة ميكرومتر التي لديها التحكم في الحركة في x و y الاتجاهات.- قم بجبل مرحلتين لترجمة السفر للسماح بالحركات على طول الاتجاهين س وy (انظر الشكل3).
- إصلاح المرحلة على وظيفة Ø1.5 "من الارتفاع المناسب.
- قم بتحميل PD إلى تحميل خارجي.
- زيادة طاقة الحزمة الشعاعية إلى أقصى حد في PD، وضبط مواضع PD (إحداثيات x وy) باستخدام الميكرومترات المرفقة بالتركيب (انظر الشكل3).
3. محاذاة المجهر
- التداخل المكاني للعوارض
ملاحظة: بالنظر إلى شعاع OPO كمرجع والاستفادة من كاشف موقف حساسة، يجب أن تتداخل Ti:Sa إلى OPO وفقا للإجراء التالي:- محاذاة OPO وأشعة الليزر Ti:Sa بحيث تصل إلى المجهر على حد سواء.
- وضع أجهزة استشعار موقف شعاع الليزر في موقعين في بين مرآة dichroic 1 ومرآة 6، ويقع الموقف الأول على مقربة من مرآة dichroic 1 والثاني هو قريب من مرآة 6. لكل موقف، استخدم أجهزة الاستشعار للكشف عن إحداثيات x و y لشعاع OPO (اتبع الشكل1).
- تحقق من أن إحداثيات x و y لشعاع الليزر Ti:Sa هي نفس OPO في كلا الموقعين من أجهزة الكشف عن أجهزة الاستشعار. إذا لم تتطابق إحداثيات Ti:Sa وOPO في بعض المواقف، قم بضبط إمالة المرآة المجاورة لتعويض الفرق (اتبع الشكل1).
- اتبع نفس الإجراء لمحاذاة مواضع شعاع Ti:Sa فيما يتعلق بـ OPO للمسار بين M6-M7 (اتبع الشكل1).
- تزامن مؤقّتة من الحزم
- استخدام الصمام الضوئي السريع بالإضافة إلى الذبذبات:
- إيقاف انتشار الحزم Ti:Sa وOPO ووضع كاشف سريع أمام شعاع OPO (بين M6 و M7).
- قم بتوصيل إشارة الزناد التي يوفرها مربع الليزر Ti:Sa مع منظار الذبذبات في القناة 2.
- قم بتوصيل كابل الكاشف بمنظار الذبذبات في القناة 1 وتصور الملف الشخصي الزمني OPO.
- تسجيل الوقت (abscissa) تقاس من قبل الذبذبات المقابلة لقيمتها القصوى، وهي t1.
- وقف شعاع OPO والإفراج عن شعاع Ti:Sa.
- تصور التشكيل الجانبي الزمني Ti:Sa وتسجيل الوقت (abscissa) المقابلة لقيمتها القصوى، وهي t2.
- تقليل الفرق بين t1-t2 باستخدام خط التأخير لتراكب الحزم اثنين. في حالتنا، الحد الأدنى للفرق قابل للقياس هو 10 PS.
- إزالة كاشف سريع بين M6 و M7.
- استخدام autocorrelator:
ملاحظة: في الرسم التخطيطي الموضح في الشكل 1، يتم تثبيت autocorrelator دون التداخل مع المسارات البصرية للحزم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إدخال مرآة إضافية وشنت على جبل الوجه بالتخبط (يشار إليها باسم بعثة تقصي الحقائق / AM) بين M6 و M7 لتحويل شعاع إلى autocorrelator.- الوجه AM لتوجيه شعاع في autocorrelator.
- إيقاف Ti:Sa والإفراج عن OPO.
- تعيين شعاع المسافة تعديل المسمار ميكرومتر من autocorrelator إلى موقف عادي (8.35 ملم).
- السلطة على وحدة تحكم autocorrelator وبدء تطبيق البرنامج على الكمبيوتر الشخصي السيطرة عليه.
- قم بإظهار شعاع OPO من بعثة تقصي الحقائق/AM إلى مرآة الإدخال في autocorrelator.
- التحكم في بقعة انعكاس (باستخدام بطاقة كشف ورقة) من شعاع على نافذة محاذاة autocorrelator.
- في حالة عدم وجود شعاع أو كثافة شعاع منخفض، وضبط موقف واتجاه بعثة تقصي الحقائق / صباحا إلى الحد الأمثل، ومحاولة لضبط مرآة الإدخال (شنت على autocorrelator) لتحقيق أقصى قدر من إشارة نبض الليزر. يتم الحصول على إشارة autocorrelator كما هو موضح في الشكل 5a.
- إيقاف OPO ومشروع شعاع Ti:Sa من بعثة تقصي الحقائق /AM لإدخال مرآة في autocorrelator. كرر الخطوتين 3-2-2-6 و3-2-2-7. يتم الحصول على إشارة autocorrelator كما هو موضح في الشكل 5b.
- تعيين شعاع المسافة تعديل المسمار ميكرومتر إلى موقف الصليب (7.30 مم).
- حرر كلا الحزم.
- مسح خط التأخير للحصول على اثنين من الحزم OPO وTi:Sa متراكبة. يتم الحصول على إشارة عبر correlator كما هو مبين في الشكل 6.
- الوجه مرآة بعثة تقصي الحقائق / صباحا بحيث يمكن أن تصل الحزم M7 وتفحص رأس المجهر.
- استخدام الصمام الضوئي السريع بالإضافة إلى الذبذبات:
- محاذاة المجهر
- إجراء المراقبة المجهرية الضوء الأبيض:
ملاحظة: قبل المراقبة المجهرية، تأكد من محاذاة المجهر بشكل صحيح.- إعداد عينة الاختبار، والتي تتكون من محلول عازلة الفوسفات التي يتم تفريق حبات البوليسترين بأقطار 3 ميكرومتر. يتم وضع الحل داخل شطيرة من اثنين من الشرائح الزجاجية.
- تشغيل المجهر وإمدادات الطاقة من الضوء الأبيض. اتبع دليل المراقبة تحت الضوء الأبيض.
- استخدام مكثف لإلقاء الضوء على العينة. استخدام الهدف من 60X لجمع الضوء. ضع العينة على المسرح. تحسين الموقف البؤري لهدف المجهر 60x.
- حدد FOV من الفائدة. التقاط صورة CCD منالعينة (الشكل 7).
- إيقاف إمدادات الطاقة من الضوء الأبيض.
-
محاذاة المجهر مع أشعة الليزر femtosecond: OPO وTi:Sa
- قم بإزالة المكثف باستخدام زر الهروب لسحب العدسة الموضوعية للمجهر 60x مؤقتًا. نقل عدسة الهدف المجهر 60X قبالة المسار البصري، وتناوب أنف.
- جبل كاشف إلى الجزء العلوي من المجهر باستخدام جبل الميكانيكية الخارجية. قم بتوصيل خرج كاشف من خلال مرشح تمرير منخفض من 50Ω إلى الذبذبات ومراقبة إشارة OPO.
- قم بتشغيل المعالج الذي يتحكم في رأس الماسح الضوئي. إسقاط شعاع OPO في رأس الماسح الضوئي من المجهر.
- تحقق من موقع شعاع داخل المجهر، تأكد من أن موقع شعاع في المركز أو بالقرب من المركز.
- تحقق من أن موقف شعاع داخل رئيس PD هو في المركز.
- قم بزيادة الطاقة التي يقيسها الكاشف باستخدام مترجم x-y.
- قم بتبديل الحزمة من OPO إلى Ti:Sa وتحقق من الحصول على إشارة قصوى أيضًا لليزر التيتانيوم والياقوت. THis يشير إلى أن كلا الحزم هي محاذاة بشكل جيد.
- الانتهاء من محاذاة شعاع، وإدخال عدسة الهدف المجهر 60X وتناوب الظهر أنف.
- استخدام زر إعادة التركيز على المجهر لاستعادة التركيز النهائي إلى عدسة الهدف المجهر 60X.
- ضع الهدف مع التكبير 40x بدلا من المكثف دون لمس أو إزعاج العينة.
- إجراء المراقبة المجهرية الضوء الأبيض:
- تحسين التزامن المكاني والزمني للعوارض
- التزامن الزمني
- تعيين قوة Ti:Sa وOPO تقاس قبل المجهر إلى 30 م.م.م.لكلتا الحزم. تعيين الطول الموجي من OPO إلى قيمة مختلفة فيما يتعلق السابقة بحيث المضخة والتحقيق ليست في الرنين مع التردد الاهتزازي من الخرز.
- الإفراج عن كلا الحزم (Ti:Sa وOPO) بحيث تدخل المجهر.
- قم بتشغيل مترجم محوسبة لخط تأخير المسح الضوئي وسجل الكثافة المقاسة بواسطة LIA لكل موضع من موضع خط التأخير. انتظر حتى يكتمل مسح خط التأخير. يتم تصور الملف الزمني الذي تم الحصول عليه في الشكل 8a.
- تعيين الطول الموجي من OPO إلى 1076 نانومتر مرة أخرى بحيث مضخة والتحقيق هي في الرنين مع تردد الاهتزاز من الخرز. كرر الخطوة 3.4.1.3 (يتم تصور التشكيل الجانبي الزمني الذي تم الحصول عليه في الشكل 8b).
- تعيين موضع شعاع التداخل الذي تم الحصول عليه في خط التأخير للحصول على صور SRS.
- التزامن المكاني للعوارض
ملاحظة: صور الإرسال مفيدة لتحسين FOV، والإضاءة، والموقف البؤري لأهداف المجهر، وللتحقق مما إذا كانت الحزم اثنين متداخلة مكانيا.- نقل صورة الحصول على OPO
- إيقاف شعاع Ti:Sa وتقليل الطاقة OPO إلى 8 mW.
- قم بتوصيل قراءة كاشف ببطاقة الحصول على البيانات.
- تشغيل برنامج الحصول على البيانات جنبا إلى جنب مع وحدة التحكم المسح المجهر.
- حفظ الملف ومعالجة البيانات للحصول على الصورة. تظهر الصورة الأولية كما هو موضح في الشكل 9a.
- نقل صورة اكتساب Ti:Sa
- أوقف شعاع OPO وقلّل طاقة Ti:Sa إلى 2.5-4.5 م.م.5.
- قم بتوصيل جهاز الكشف بقراءة LIA وLIA ببطاقة الحصول على البيانات.
- كرر الخطوتين 3-4-2-1-3 و3-4-2-1-4. تظهر الصورة الأولية كما هو موضح في الشكل 9ب.
- نقل صورة الحصول على OPO
- التزامن الزمني
4. SRS الحصول على صورة
ملاحظة: تم تحقيق خوارزمية مخصصة لتخزين البيانات. وهو يدعم تنسيقات الصور التالية: 512 بكسل × 512 بكسل و 256 بكسل × 256 بكسل، مع أوقات اكتساب 16 s و 8 s و 4 s و 2 s.
- إدخال كومة من المرشحات في ما بين الهدف 40X وPD لإزالة نبضات المضخة (Ti:Sa) والحصول على إشارة ستوكس فقط (OPO).
- تعيين إشارة المضخة إلى 810 نانومتر مع قوة مركزة من 8 mW وإشارة التحقيق إلى 1076 نانومتر مع قوة مركزة من 8 mW للتحقيق في السندات C-H نموذجية من البوليسترين (رامان التحول من 3054 سم−1).
- قم بتوصيل جهاز الكشف بقراءة LIA وLIA ببطاقة الحصول على البيانات.
- قم بتعيين تنسيق بكسل الحصول على الصورة حسب المتطلبات وتعيين وقت الاكتساب.
- تشغيل البرنامج الذي يتحكم في وحدة تحكم المجهر.
- تشغيل برنامج خوارزمية مخصص يعمل كمزامنة بين وحدة تحكم المجهر ونظام الكشف وDAQ (انظر الشكل 4).
- حفظ ملف المصفوفة بمجرد اكتمال عملية الشراء.
- استيراد ملف البيانات الأولية وحفظ الصورة بالتنسيق المطلوب (المحفوظة عادة في تنسيق .tif) باستخدام برنامج ImageJ. تظهر الصورة في الشكل 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد ورد في الشكل 7مثال على قياس SRS (أي قياس SRS في نقطة واحدة من العينة). عندما لا تتداخل الحزم في الزمان أو المكان، يتم الإبلاغ عن النتيجة التي تم الحصول عليها في الشكل 8a. في خارج الرنين، واتساع الإشارة التي تقاس من قبل LIA هو صفر، في حين أن مرحلة الإشارة التي تقاس من قبل ليا يقفز بين القيم السلبية والإيجابية. وحيث أنه عندما تتداخل الحزم في الفضاء، فإن تحريك خط التأخير في نطاق مناسب، يتم الإبلاغ عن النتائج التي تم الحصول عليها في الشكل 8ب. تزيد الإشارة التي تقاس بـ LIA وتصل إلى أقصى حد لها عندما تتداخل الحزم تمامًا في الوقت المناسب، بينما تبدأ المرحلة في تحقيق قيمة ثابتة خلال الوقت الذي تتداخل فيه الحزم في الوقت المناسب.
يتم تمثيل صور الامتصاص التي تم الحصول عليها باستخدام شعاع واحد (Ti:Sa أو OPO) من نفس حبات البوليسترين في الشكل 9a،b مع قضبان مقياس من 6 ميكرومتر. من أجل الحصول على صور SRS، يتم تعيين خط التأخير إلى الموضع الذي تم تحقيقه في الشكل 7b،وتظهر صورة SRG نموذجية في الشكل 10 مع شريط مقياس من 6 ميكرومتر.
الشكل 1: التخطيط التخطيطي لنظام المجهر f-SRS. OPO = مذبذب البارامتري البصري؛ Ti: Sa = التيتانيوم الياقوت الليزر؛ M1-M7 = مرايا النطاق العريض فيمتوثانية; بعثة تقصي الحقائق / AM = الوجه بالتخبط مرآة / مرآة Autocorrelator؛ DM1, DM2 = مرايا ثنائية الشهي; DL = خط تأخير; AC = autocorrelator ; EOM = المغير الكهربائي البصري؛ FG = مولد وظيفة؛ جنرال موتورز = مرآة جالفو; Obj1, Obj2 = أهداف المجهر; PD = الصمام الضوئي؛ DAQ = نظام الحصول على البيانات؛ الكمبيوتر الشخصي = الكمبيوتر الشخصي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط طريقة نقل التشكيل العالي التردد. في الشكل الداخلي، يتم تمثيل اثنين من أشعة الليزر قبل التفاعل داخل العينة ومسبار المعدلة بسبب تفاعلات التحقيق ومضخة داخل العينة. يتم تمثيل الوقت في ns. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تمثيل جبل الصمام الضوئي مع نظام التركيب الميكانيكي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخطط نظام الحصول على البيانات. PD = photodiode، LIA = قفل في مكبر للصوت، DS = نظام الكشف، MC = التحكم المجهر، DAQ = نظام الحصول على البيانات، PC = الكمبيوتر الشخصي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: وظيفة الأوتوكوريلاتور من OPO (أ) و Ti:SA (b). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: وظيفة الارتباط المتبادل بين OPO وTi:Sa. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: صورة اتفاقية مكافحة التصحر من حبات البوليسترين.
الشكل 8: السعة ومرحلة إشارة SRS تقاس بقفل مكبر للصوت: قبالة الرنين (على اليسار) وفي الرنين (على اليمين) . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: صور نقل حبات البوليسترين التي حققها OPO (أ) وTi:Sa (b). شريط مقياس = 16 درجة.
الشكل 10: صورة SRS من حبات البوليسترين. شريط مقياس = 12 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد اتخذت SRS المجهريالتصوير خالية من التسمية إلى آفاق جديدة، وخاصة في دراسات الهياكل البيولوجية المعقدة مثل الدهون، والتي هي أساسية للخلايا والهندسة المعمارية الخلوية. وتشارك الدهون في مسارات فسيولوجية متعددة مثل إنتاج الأغشية البيولوجية، وأنها بمثابة السلائف التركيبية الحيوية ومحولات الإشارات10. يتم تعبئة الدهون في العضيات داخل الخلايا المتخصصة، وتسمى أيضا قطرات الدهون (LDs). أقطارها تختلف من بضع عشرات النانومتر إلى عشرات ميكرومتر11،12. LDs لا تشارك بوفرة فقط في الخلايا المنتجة للمواد الدهنية والستيرويد ولكن أيضا موجودة في خطوط الخلايا الأخرى. تتعاون الـ LDs في العديد من العمليات الفسيولوجية مثل تخزين الدهون. وهي واردة بشكل بارز في الأمراض الشائعة (على سبيل المثال، تغيير استقلاب الكوليسترول)13،14.
تقليديا، يتم تحقيق التصور من الدهون باستخدام مجهريال الفلورية والخلايا الثابتة محايدة محددة الدهون صبغ المسمى10. وتجدر الإشارة إلى أن الدهون هي أصغر حجما بالمقارنة مع البروتينات والحمض النووي، يمكن أن تحدث التغيرات الهيكلية والوظيفية والقطع الأثرية غير المرغوب فيها عند إضافة الفلوروفورس15،16. وقد ثبت SRS لتكون قوية لدراسة الهياكل الغنية بالدهون. الدهون وفيرة في مجموعات C-H 2. ولذلك، فإن القمم المعزولة نسبيا المرتبطة C-H السندات حالات الاهتزاز في 2845 سم-1 في أطياف رامان الخاصة بهم توفر توقيعا فريدا للدهون داخل الخلية. لسوء الحظ، بما أن التواقيع الاهتزازية القابلة للاختلاف محدودة، فمن الصعب إلى حد ما التمييز بين جزيء حيوي مستهدف والأنواع الأخرى ذات الصلة داخل الخلايا التي تشترك في روابط كيميائية مماثلة. ومع ذلك، فمن الممكن إضافة تحقيقات الاهتزازية الصغيرة رامان النشطة (على سبيل المثال، الألكينيس والنظائر مستقرة) للحصول على خصوصية لتصوير الجزيئات الحيوية الصغيرة17.
بالنسبة للتطبيقات البيولوجية والطبية الحيوية في الجسم الحي، فإن رسم الخرائط المتزامنة لمختلف الأنواع الكيميائية في عينة معينة ضروري لاستثمار التوزيع المشترك والارتباطات الديناميكية بين أزواج الجزيئات الحيوية18و19 . ولذلك، بُذلت جهود كثيرة للحصول على تناقضات كيميائية متعددة. في أبسط خيار من التصوير متعدد الألوان، لصورة وسائط رامان مختلفة من عينة، يتم ضبط تردد شعاع مضخة أو شعاع ستوكس في المسح التسلسلي18. ومع ذلك، قد يؤدي استخدام نهج ضبط الطول الموجي إلى فقدان معلومات التعريب المشترك لأوضاع رامان المختلفة، خاصة عندما تكون العينة في بيئة ديناميكية18.
ونتيجة للإثارة غير الخطية، تقدم SRS قدرات حل ثلاثية الجوانب للسندات الكيميائية المختارة ضمن العينات البيولوجية20. ويمكن ببساطة تحقيق إعادة بناء حجم السندات الكيميائية المختارة وتوزيعها المكاني عن طريق جمع صور SRS على مستوى بؤري مختلف على طول المحور z. وبما أن الصور يتم الحصول عليها باستبانة مكانية وزمنية عالية، يمكن الحصول على أجزاء أخرى من المعلومات الرئيسية (أي التركيب ثلاثي الأبعاد، والتركيب الكيميائي، وما إلى ذلك) عن العينة البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نقدر V. توفانو من IMM CNR لمساعدته التقنية القيمة وجياكومو كوزي، أخصائي المنتج من أدوات نيكون، لمناقشات مفيدة والدعم المستمر. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل البرامج التنفيذية الوطنية الإيطالية PONa3 00025 (BIOforIU) وEuro-Bioimaging على نطاق واسع panEuropean مشروع البنية التحتية للبحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisation tool | Nikon | Nikon C2Tool | Acquisation supported tool |
| APE Pulse link control software | APE- | APE Pulse link control software | software control |
| Autocorrelator | APE | APE PulseCheck USB 50 | Autocorrelator |
| Detector | Thorlabs | Thorlabs DET10A | Photodiode |
| Detector card | Thorlabs | Thorlabs VRC | IR detector Card |
| Dichroic mirror | Semrock | Semrock FF875-Di01-25X36 | Dichroic mirror |
| Dichroic mirror | Semrock | FF875-Di01-25x36 | Dichroic mirror |
| EOM | Conoptics | (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). | Pockels cell |
| Fast detector | Thorlabs | Thorlabs DET025AL/M | Photodiode |
| Fast mirror scanning unit | Nikon | C2 | Microscpe scanning head |
| Femtosecond laser Ti:SA | Coherent | Coherent Chameleon Ultra II | Chameleon Ultra II |
| Function generator | TTi | TG5011 AIM – TTi | Function generator |
| Inverted optical microscope | Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon | Eclipse TE-2000-E, Nikon |
| Lock-in Amplifier | Standford Research System | SR844-200 MHz dual phase | A lock-in amplifier from Stanford Research Systems |
| Notch filter, | Semrock | NF03-808E-25 | Notch filter |
| Optical delay line | Newport | Newport M-ILS200CC | Tunable optical delay line |
| Optical Parametric Oscillator | Coherent | Coherent Compact OPO | Coherent Compact OPO |
| Oscilloscope | WaveRunner | 640Zi 4GHz OSC/LeCroy | Digital Oscilloscope |
| PCI Card | National instrument | NI PCIe 6363 | Data acquisation card |
| Position Sensors Detectors | Newport | Newport Conex PSD9 | Position detector sensor |
| Power meter head | Coherent | PowerMax PM10, | Laser power detector |
| Translation Stages | Thorlabs | Thorlabs PT1/M | Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer |
References
- Saar, B. G., et al. Video-Rate Molecular Imaging in Vivo with Stimulated Raman Scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Zhang, D., Wang, P., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Fast Vibrational Imaging of Single Cells and Tissues by Stimulated Raman Scattering Microscopy. Accounts of Chemical Research. 47 (8), 2282-2290 (2014).
- Alfonso-García, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407 (2014).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa8870 (2015).
- Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nature Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
- D’Arco, A., et al. Subcellular chemical and morphological analysis by stimulated Raman scattering microscopy and image analysis techniques. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1853 (2016).
- D'Arco, A., et al. Label-free imaging of small lipid droplets by femtosecond-stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Nonlinear Optical Physics & Materials. 26 (4), (2017).
- Ranjan, R., et al. Integration of stimulated Raman gain and stimulated Raman losses detection modes in a single nonlinear microscope. Optics Express. 26 (20), 26317 (2018).
- Reid, D. T., Sun, J., Lamour, T. P., Ferreiro, T. I. Advances in ultrafast optical parametric oscillators. Laser Physics Letters. 8 (1), 8-15 (2011).
- Zumbusch, A., Langbein, W., Borri, P. Nonlinear vibrational microscopy applied to lipid biology. Progress in Lipid Research. 52 (4), 615-632 (2013).
- Suzuki, M., Shinohara, Y., Ohsaki, Y., Fujimoto, T. Lipid droplets: Size matters. Journal of Electron Microscopy. 60 (1), S101-S116 (2011).
- Rizzatti, V., et al. Lipid droplets characterization in adipocyte differentiated 3T3-L1 cells: size and optical density distribution. European Journal of Histochemistry. 57 (3), 159-162 (2013).
- Alfonso Garcia, A., et al. D38-cholesterol as a Raman active probe for imaging intracellular cholesterol storage. Journal of Biomedical Optics. 21 (6), (2016).
- Mukherjee, S., Zha, X., Tabas, I., Maxfield, F. R. Cholesterol distribution in living cells: fluorescence imaging using dehydroergosterol as a fluorescent cholesterol analog. Biophysical Journal. 75 (4), 1915-1925 (1998).
- Fukumoto, S., Fujimoto, T. Deformation of lipid droplets in fixed samples. Histochemistry and Cell Biology. 118 (5), 423-428 (2002).
- Kinkel, A., et al. Oil red-O stains non-adipogenic cells: A precautionary note. Cytotechnology. 46 (1), 49-56 (2004).
- Wei, L., et al. Live-Cell Bioorthogonal Chemical Imaging: Stimulated Raman Scattering Microscopy of Vibrational Probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
- Ozeki, Y., Asai, T., Shou, J., Yoshimi, H. Multicolor Stimulated Raman Scattering Microscopy with Fast Wavelength-Tunable Yb Fiber Laser. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25 (1), 1-11 (2019).
- Saar, B. G., Contreras-Rojas, L. R., Xie, X. S., Guy, R. H. Imaging Drug Delivery to Skin with Stimulated Raman Scattering Microscopy. Molecular Pharmaceutics. 8 (3), 969-975 (2011).
- Chen, X., et al. Volumetric chemical imaging by stimulated Raman projection microscopy and tomography. Nature Communications. 8, 15117 (2017).
- Ferrara, M. A., Filograna, A., Ranjan, R., Corda, D., Valente, C., Sirleto, L., et al. Threedimensional label-free imaging throughout adipocyte differentiation by stimulated Raman microscopy. PLoS ONE. 14 (5), e0216811 (2019).
