Summary
Neste estudo, aprimoramos as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um caso exemplar.
Abstract
A estabilidade do alvo responsivo da afinidade da droga (dardos) é um método robusto para a deteção de alvos pequenos novos da proteína da molécula. Pode ser usado para verificar interações pequenas conhecidas da molécula-proteína e encontrar alvos potenciais da proteína para produtos naturais. Comparado com outros métodos, DARTS usa moléculas nativas, não modificadas, pequenas e é simples e fácil de operar. Neste estudo, aprimoramos ainda mais as capacidades de análise de dados do experimento DARTS, monitorando as mudanças na estabilidade protéica e Estimando a afinidade das interações proteína-ligand. As interações proteína-ligantes podem ser plotadas em duas curvas: uma curva proteolítica e uma curva de dependência de dose. Nós usamos a interação de mTOR-Rapamycin como um exemplo exemplar para o estabelecimento de nosso protocolo. A partir da curva proteolítica, vimos que a proteólise do mTOR por soros foi inibida pela presença de rapamicina. A curva dose-dependência nos permitiu estimar a afinidade de ligação da rapamicina e do mTOR. Este método é susceptível de ser um método poderoso e simples para identificar com precisão novas proteínas-alvo e para a otimização do engajamento alvo de drogas.
Introduction
Identificar proteínas-alvo de pequenas moléculas é essencial para a compreensão mecanicista e o desenvolvimento de potenciais fármacos terapêuticos1,2,3. A cromatografia de afinidade, como método clássico para identificar as proteínas-alvo de pequenas moléculas, produziu bons resultados4,5. No entanto, este método tem limitações, em que a modificação química de pequenas moléculas geralmente resulta em especificidade ou afinidade de ligação reduzida ou alterada. Para superar essas limitações, várias novas estratégias foram recentemente desenvolvidas e aplicadas para identificar os alvos de pequenas moléculas sem a modificação química das pequenas molécula. Estes métodos diretos para a identificação do alvo de moléculas pequenas Label-Free incluem a estabilidade de alvo responsiva da afinidade da droga (dardos)6, estabilidade das proteínas das taxas de oxidação (SPROX)7, ensaio térmico celular do deslocamento (cetsa)8 ,9, e perfil térmico do proteoma (TPP)10. Estes métodos são altamente vantajosos porque usam moléculas pequenas naturais, não modificadas e confiam somente em interações diretas da ligação para encontrar proteínas do alvo11.
Entre esses novos métodos, dardos é uma metodologia comparativamente simples que pode ser facilmente adotada pela maioria dos laboratórios12,13. O DARTS depende do conceito de que as proteínas ligadas ao ligand demonstram suscetibilidade modificada à degradação enzimática em relação às proteínas não acopladas. A nova proteína alvo pode ser detectada pelo exame da faixa alterada em gel de SDS-PAGE através de cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS/MS). Esta abordagem tem sido implementada com sucesso para identificação de alvos previamente desconhecidos de produtos naturais e drogas14,15,16,17,18, 19. também é poderoso como um meio de tela ou validar a ligação de compostos a uma proteína específica20,21. Neste estudo, apresentamos uma melhoria no experimento, monitorando as mudanças na estabilidade protéica com pequenas moléculas e identificando afinidades vinculativas de proteínas ligantes. Utilizamos a interação mTOR-rapamicina como exemplo para demonstrar nossa abordagem.
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Protocol
1. coletar e lyse células
- Cresça as células 293T usando o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal, 2 mM de glutamina e 1% de antibióticos. Incubar culturas a 37 ° c 5% CO2.
Nota: o estado de crescimento das células pode afectar a estabilidade dos experimentos subsequentes. - Expandir células na cultura até atingir 80 \ u201290% confluência.
- Misturar 345 μL de reagente de lise celular (ver a tabela de materiais) com 25 μL de cocktail inibidor da protease 20x, 25 μL de fluoreto de sódio a 1 M, 50 μl de 100 mm β-glicerofosfato, 50 μL de pirofosfato de sódio a 50 mm e 5 μL de ortovanadato de sódio a 200 mm. Mantenha o tampão de Lise refrigerado no gelo.
Nota: outros tampões do lysis com vários detergentes (por exemplo, Triton X-100 ou NP-40) podem ser usados com os dardos contanto que forem não-desnaturando. As proteínas da membrana ou as proteínas nucleares podem ser extraídas adicionando 0,4% Triton X-100 ou 0,4% NP-40 ao lysate da pilha. - Lave as células duas vezes com soro fisiológico com tampão de fosfato frio (PBS).
- Use um raspador de células para coletar as células em uma quantidade apropriada de tampão de lise celular e transferir as células lisando em um tubo de 1,5 mL.
Nota: o número de células necessárias para cada experimento de dardos variará com base na quantidade de proteína que pode ser extraída de várias linhas celulares. Em geral, a concentração proteica do lisado utilizado é entre 4 \ u20126 μg/μL. A placa de 1 10 cm de 293T Cells em 85 \ u201290% confluency, lysed com 300 μl do tampão do lysis conduz tipicamente a um lisado com uma concentração da proteína de ~ 5 μg/μl. - Misture bem o tampão de Lise/células lisando e incubar o tubo no gelo por 10 min.
- Centrifugue o tubo a 18.000 × g durante 10 min a 4 ° c.
- Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e mantenha-o refrigerado no gelo.
- Realize um ensaio de BCA para aproximar a concentração proteica de lisados.
2. Incubar proteínas lisados com a pequena molécula
- Dividir 99 μL de lisados em dois tubos de 1,5 mL.
- Faça uma concentração de estoque inicial de 10 mM de molécula pequena. Ao executar dardos, um pode começar com uma concentração mais elevada da molécula pequena (5 \ u201210x o valor de a) para assegurar a ligação óptima.
- Adicione 1 μL de solvente que a pequena molécula é solúvel em ou 1 μL de pequenas moléculas de soluções de ações para cada alíquota de lisado. Incubar o lisado da pilha com as soluções para 30 \ u201260 min na temperatura ambiente com agitação.
- No gelo, estabeleça diluições seriadas (1:200, 1:400, 1:800 e 1:1600) de solução de soros recém-descongelada em 1x TNC (para 1 ml de tampão TNC 10x, misture 300 μL de água ultrapura com 100 μl de cloreto de sódio a 5 m, 100 μl de cloreto de cálcio de 1 m e 500 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 8,0).
- Examine uma ampla amplitude de proporções de soros: proteína (por exemplo, abrangendo de 1:100 a 1:2000) para garantir a observabilidade do efeito passo-sábio da Soros no alvo (s).
Nota: para calcular as concentrações de soros (exemplo): 5 μg/μL de concentração proteica x 20 μL de amostra = 100 μg de proteína. Para uma soros: relação proteína de 1:100 precisamos de 0,5 μg/μl (100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL) soros solução. Este experimento pode ter que ser repetido várias vezes para obter uma faixa adequada de proporções de Pronase: proteína.
3. Realize a proteólise
Nota: para proteólise, as etapas são realizadas à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário
- Após a incubação com a pequena molécula, divida cada alíquota em 20 amostras de μL.
- Adicionar 2 μl da gama de soluções soros em cada amostra em intervalos específicos (a cada 30 s). Use um volume igual de 1x buffer TNC para estabelecer uma amostra de controle não digerido.
- Após 5 \ u201220 min, interromper a digestão através da adição de 2 μL de coquetel de inibidor de protease 20x frio a cada 30 s. Misture bem e incubar no gelo por 10 min.
- Diluir amostras com o volume adequado de 5x SDS-PAGE buffer de carga e ferver a 95 ° c por 5 min.
- Realize a próxima porção do experimento ou armazene a amostra de proteína a − 80 ° c.
4. quantificação e análise
- Após dardos, realize a coloração do azul de Coomassie de acordo com o protocolo previamente publicado22.
- As bandas de proteínas manchadas devem ser muito claras após destaining. Derrame fora a solução usada do senhor e adicione a solução fresca do ácido acético de 1% para cobrir o gel. Coloque o gel a luz para observar as bandas com diferenças significativas entre os grupos com (grupo de amostra) ou sem (grupo controle) a pequena molécula.
- Cortar as duas bandas correspondentes do gel com um instrumento estéril e executar LC-MS/MS imediatamente.
Nota: LC-MS/MS precisa de ser feito o mais cedo possível porque as proteínas no gel degradarão continuamente. - Digerir as bandas, extrair peptídeos e realizar a análise LC-MS/MS23.
- Para analisar os dados de LC-MS/MS, primeiro identifique todas as proteínas na banda individual. Em segundo lugar, use o fósforo do espectro do peptide (PSM) para representar a abundância de cada proteína.
Nota: PSM fornece o número total de seqüências de peptídeos identificados para a proteína, incluindo aqueles redundante identificado. Em geral, a frequência com que um peptídeo é identificado/seqüenciado pode ser usado como uma estimativa aproximada de quão abundante é a proteína na amostra. As proteínas enriquecidas no grupo amostral sobre o grupo controle são proteínas de interesse.
- Para analisar os dados de LC-MS/MS, primeiro identifique todas as proteínas na banda individual. Em segundo lugar, use o fósforo do espectro do peptide (PSM) para representar a abundância de cada proteína.
- Procure os anticorpos primários das proteínas seleccionadas. Realize Western blot para verificar se a pequena molécula pode se ligar diretamente às proteínas alvo potenciais24.
- Carregue quantidades iguais de proteína nos poços de um gel de SDS-PAGE de 8%, juntamente com um marcador de peso molecular adequado. Executar o gel para 30 min em 80 V, em seguida, ajustar a tensão para 120 V e continuar a correr para 1 \ u20122 h.
- Quantifique as diferentes bandas de proteínas alvo usando o software de processamento e análise de imagens (consulte a tabela de materiais).
- Analise os dados e desenhe as curvas.
- Determinação da curva proteolítica para uma proteína alvo
- A relação Pronase: proteína é variada ao realizar a proteólise. Normalize dados da análise de imagem atribuindo os valores de intensidade de banda correspondentes às bandas não digeridas a 100%.
- Use a análise de regressão não linear da análise estatística e do software de desenho para traçar uma curva de dados normalizados para a intensidade da banda relativa e as proporções de Pronase: proteína.
- Primeiro, abra o software, selecione o tipo de tabela e gráfico como XY e permita 3 valores de replicação em Subcolunas lado a lado. Em seguida, insira os dados correspondentes no espaço abaixo de x e y. x, introduza os números 0, 1, 2, 3, 4, 5 (como os suportes de lugar correspondentes Pronase: relações da proteína).
- Na coluna y, insira os dados normalizados para intensidades de banda relativas. Execute "regressão não linear" e implemente uma "dose-resposta-estimulação" usando a equação "log (agonista) versus resposta — inclinação variável (quatro parâmetros)".
- Converta as anotações do eixo X na curva para as proporções de Pronase: protein correspondentes.
- Determinação da curva dose-dependência para uma proteína alvo
Nota: para a análise da dose-dependência, a molaridade da molécula pequena é diferido através das amostras. A relação de Pronase: proteína estável deve ser informada pela análise de dados de proteólise. A relação Pronase: proteína que apresentou diferença máxima na intensidade da proteína alvo durante a curva proteolítica deve ser utilizada para o experimento de dependência de dose.- Quantifique as diferentes bandas de proteínas alvo usando um software de análise de imagem. Como na geração da curva da dose-dependência, normalizar dados da análise da imagem atribuindo os valores da intensidade da faixa que correspondem à faixa menos digerida a 100%.
- Aplique a análise de regressão não linear dentro da análise estatística e do software de desenho aos dados normalizados. Primeiro, abra o software, selecione o tipo de tabela e gráfico como XY e insira 3 valores de replicação em Subcolunas lado a lado.
- Em seguida, insira os dados correspondentes no espaço abaixo de x e y. Para a variável ' x ', insira diferentes concentrações da pequena molécula; ' y ' inclui os dados normalizados correspondentes para a intensidade da banda relativa.
- Transforme valores x usando X = log (X). Finalmente, empregar a regressão não-linear, e implementar uma estimulação dose-resposta usando o "log (agonista) versus resposta — inclinação variável (quatro parâmetros)" equação.
- Determinação da curva proteolítica para uma proteína alvo
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Representative Results
O fluxograma do experimento é delineado na Figura 1. O resultado da coloração azul de Coomassie é mostrado na Figura 2. A incubação com a pequena molécula confere proteção contra proteólise. Três bandas que parecem ser protegidas por incubação com rapamicina sobre o controle do veículo são encontradas. Os resultados esperados do experimento de curva proteolítica são mostrados na Figura 3. Como prova de princípio, examinamos a proteína mTOR bem estudada, que é o alvo para a droga rapamicina25. O western blotting ilustra a presença de proteína mTOR em baixa Pronase: rácios protéicos e sua redução e perda com proporções crescentes (Figura 3A). A proteólise do mTOR por soros é claramente inibida pela presença de rapamicina e a adição de rapamicina gera uma mudança óbvia na curva proteolítica (Figura 3B). Para investigar os efeitos da concentração da droga, nós mantivemos uma Pronase constante: relação da proteína ao variar concentrações de Rapamycin. Como a concentração de ligante aproxima a saturação de ligação alvo, observa-se uma maior presença de proteína alvo. A rapamicina melhorou a dose-dependente do nível de mTOR, sugerindo a estabilidade crescente do mTOR com tratamento do rapamicina (Figura 4A). A quantificação das intensidades da faixa protéica-alvo permite a representação da estabilidade alvo em função da concentração de ligantes como exemplificada pela curva na Figura 4B. Estes resultados sugerem fortemente que o mTOR é a proteína alvo da rapamicina.
Figura 1: esquema da abordagem Darts para análise semiquantitativa de alvos de drogas. O lisado da pilha é incubado na presença ou na ausência de uma molécula pequena, seguida pelo proteólise e pela electroforese da proteína. As bandas proteicas protegidas são excisadas e submetidas à espectroscopia de massa. Alvos proteicos são identificados como aquelas proteínas que exibem maior resistência à protease na presença da pequena molécula. Então o Western-blot é usado para identificar e analisar semiquantitativamente as proteínas-alvo. Os dados são expressos em médias ± desvio padrão (DP). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: exemplo de Coomassie coloração azul visualização de dardos com a pequena molécula Rapamycin. Os pontos vermelhos flanqueiam as bandas protegidas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ilustração da quantidade restante de mTOR acessível para a deteção em função do Pronase: relação da proteína usada para o tratamento de lysates da pilha 293T. (A) a proteção do mTOR da proteólise pelo rapamicina foi avaliada pela análise ocidental do borrão. (B) a intensidade das bandas de mTOR foi quantificada utilizando a análise estatística e o software de desenho. A linha foi equipada com uma curva logística de quatro parâmetros. Os dados foram obtidos a partir dos três experimentos independentes e expressos em média ± DP. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ilustração da quantidade de mTOR estabilizada acessível para detecção na presença de concentrações crescentes de rapamicina. os lysates da pilha 293T foram incubados com rapamicina (0, 1, 10, 100, 1000, 10000 nanômetro) por 1 h, a seguir os lysates da pilha foram sujeitados à digestão na relação do Pronase: protein de 1:400. (A) o efeito de estabilização da rapamicina no mTOR foi avaliado por Western Blot. (B) a intensidade das bandas de mTOR foi quantificada utilizando a análise estatística e o software de desenho. A linha foi equipada com uma curva logística de quatro parâmetros. Os dados foram obtidos a partir dos três experimentos independentes e expressos em média ± DP. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O DARTS permite a identificação de alvos pequenos da molécula explorando o efeito protetor da ligação da proteína de encontro à degradação. DARDOS não requer qualquer modificação química ou imobilização da pequena molécula26. Isto permite que as moléculas pequenas sejam usadas para determinar seus alvos de ligação direta da proteína. Os critérios de avaliação padrão para o método clássico dos dardos incluem a mancha do gel, a espectrometria maciça e o western blotting12,13. A metodologia clássica também menciona que esses dados podem ser analisados quantitativamente, mas não há tal exemplo fornecido. Aqui, utilizamos os princípios do ensaio de deslocamento térmico celular (CETSA) para analisar semiquantitativamente os dados, e obter parâmetros semelhantes aos fornecidos pela CESTA (TM e a), o que aumenta a utilidade da análise de dardos8. O ligante – interação alvo pode ser plotado contra a razão Pronase: proteína para exibir deslocamentos óbvios em curvas proteolíticas. A realização de proteólise com diferentes proporções de soros: proteína pode ajudar a reduzir a concentração de soros que deve ser utilizada em experimentos a jusante. Além disso, usando a concentração otimizada de Pronase, a proteólise realizada na presença de diferentes concentrações da pequena molécula pode fornecer uma medida indireta da afinidade da pequena molécula com sua proteína alvo. Além, a geração de uma curva da dose-dependência permite a aproximação dos efeitos em proteínas do alvo dependentes em cima da concentração do ligante. A inclusão da capacidade analítica para a dose-dependência é uma poderosa expansão da metodologia DARTS; fornecendo uma aproximação direta e rápida a sondar o mecanismo terapêutico de moléculas pequenas. Esta abordagem baseada em gel é a mais fácil de implementar. Pode ser usado para a seleção high-throughput para os compostos que ligam uma proteína específica20,27,28. Além disso, dardos podem ser utilizados para analisar interações verdadeiras com baixa afinidade, porque a lavagem não é incluída como um passo experimental12,26. Além disso, em comparação com a CETSA, a DARTS tem vantagens em identificar os alvos das proteínas da membrana, pois o DARTS permite uma melhor avaliação das proteínas da membrana através do uso de detergentes leves e estabilizadores11.
O experimento também tem algumas limitações. Primeiro, quando o lisado de células tem uma baixa abundância de proteínas-alvo, o método DARTS não pode ser usado para visualizar facilmente as alterações na proteólise da proteína alvo. Etapas adicionais para concentrar essas proteínas são necessárias para aplicar essa metodologia. Em segundo lugar, nós testamos somente a interação de Rapamycin/mTOR. A interação é conhecida por ser potente e estável. No entanto, algumas pequenas moléculas podem se vincular a seus alvos menos seletivamente, ou transientemente, e não é claro se tais moléculas pequenas podem ser analisadas com este ensaio. Em terceiro lugar, algumas proteínas-alvo podem ser extremamente sensíveis ou resistentes às proteases utilizadas.
A análise do ensaio DARTS permite a identificação de interações proteicas potenciais através da avaliação de curvas proteolíticas geradas através de uma gama de proporções de Pronase: proteína na presença ou ausência de um ligand de pequena molécula. Excitingly, nossas modificações ao esboço processual padrão do teste dos dardos destacam a capacidade deste método de ser usado na geração de curva da concentração-resposta. Estas saídas são da utilidade especial no desenvolvimento da droga, permitindo a identificação de concentrações mecanìstica relevantes da droga. Além disso, a comparação das curvas de concentração-resposta geradas usando ligantes díspares oferece uma visão das afinidades vinculantes comparativas para vários ligantes do mesmo alvo; uma capacidade potencialmente útil na predição da eficácia da molécula pequena e refinamento da dosagem. Esperamos que esta demonstração de poder analítico expandido de dardos seja útil no desenvolvimento, implementação e entendimento de pequenas moléculas de drogas, particularmente para ligantes e alvos difíceis de analisar usando abordagens alternativas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte por concessões da pesquisa de NIH R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, e uma concessão da pesquisa de DOD W81XWH-16-1-0482.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
| 293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
| M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
| Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |
References
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