I denna studie, vi förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Interaktionerna kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dosberoende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall.
Responsiv mål stabilitet för läkemedels tillhörighet (Dart) är en robust metod för detektion av nya mål för små molekyl proteiner. Det kan användas för att kontrollera kända små molekyl-proteininteraktioner och för att hitta potentiella protein mål för naturliga produkter. Jämfört med andra metoder, Dart använder infödda, oförändrade, små molekyler och är enkel och lätt att använda. I denna studie, vi ytterligare förbättrat dataanalys kapacitet Dart experiment genom att övervaka förändringar i protein stabilitet och uppskatta affiniteten av protein-ligand interaktioner. Proteinet-ligand interaktioner kan plottas i två kurvor: en proteolytisk kurva och en dos-beroende kurva. Vi har använt mTOR-rapamycin interaktion som ett exemplariskt fall för inrättandet av vårt protokoll. Från proteolytiska kurvan såg vi att proteolys av mTOR av pronase hämmade av närvaron av rapamycin. Dosberoende kurvan tillät oss att uppskatta bindaffinitet för rapamycin och mTOR. Denna metod kommer sannolikt att vara en kraftfull och enkel metod för att korrekt identifiera nya målproteiner och för optimering av drogen mål engagemang.
Identifiera små molekyl målproteiner är avgörande för den mekanistiska förståelsen och utvecklingen av potentiella terapeutiska läkemedel1,2,3. Affinitetskromatografi, som en klassisk metod för att identifiera målproteiner hos små molekyler, har gett goda resultat4,5. Emellertid, denna metod har begränsningar, i att kemisk modifiering av små molekyler resulterar ofta i minskad eller förändrad bindande specificitet eller affinitet. För att övervinna dessa begränsningar har flera nya strategier nyligen utvecklats och tillämpats för att identifiera de små molekyl målen utan kemisk modifiering av de små molekylerna. Dessa direkta metoder för mål identifiering av etikettfria små molekyler inkluderar läkemedels tillhörighet lyhörd mål stabilitet (Dart)6, stabilitet av proteiner från satser av oxidation (sprox)7, cellulära termisk Skift analys (cetsa)8 ,9, och termisk proteomet profilering (TPP)10. Dessa metoder är mycket fördelaktiga eftersom de använder naturliga, oförändrade små molekyler och förlitar sig endast på direkta bindande interaktioner för att hitta målproteiner11.
Bland dessa nya metoder, Dart är en jämförelsevis enkel metod som lätt kan antas av de flesta Labs12,13. Dart beror på konceptet att ligand-bundna proteiner uppvisar modifierad känslighet för enzymatisk nedbrytning i förhållande till obundna proteiner. Det nya målproteinet kan upptäckas genom undersökning av det förändrade bandet i SDS-PAGE gel genom vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS/MS). Detta tillvägagångssätt har framgångsrikt genomförts för identifiering av tidigare okända mål för naturprodukter och läkemedel14,15,16,17,18, 19. det är också kraftfullt som ett sätt att avskärma eller validera bindning av föreningar till ett specifikt protein20,21. I denna studie, presenterar vi en förbättring av experimentet genom att övervaka förändringar i protein stabilitet med små molekyler och identifiera protein-ligand bindande affiniteter. Vi använder mTOR-rapamycin interaktion som ett exempel för att demonstrera vårt förhållningssätt.
Dart möjliggör identifiering av små molekyl mål genom att utnyttja den skyddande effekten av proteinbindning mot nedbrytning. Dart kräver inte någon kemisk modifiering eller immobilisering av den lilla molekylen26. Detta gör att små molekyler kan användas för att bestämma deras direkta bindande proteinmål. Standard bedömningskriterier för den klassiska Dart-metoden inkluderar gel färgning, masspektrometri och Western blotting12,13…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av NIH forskningsanslag R01NS103931, R01AR062207, R01AR061484, och ett DOD forskningsbidrag W81XWH-16-1-0482.
100X Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | Dilute to 20X with ultrapure water |
293T cell line | ATCC | CRL-3216 | DMEM medium with 10% FBS |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Cell scraper | Thermo Fisher | 179693 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | Bio-Rad | 1610436 | |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 6.0 | statistical analysis and drawing software |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52 | image processing and analysis software |
M-PER Cell Lysis Reagent | Thermo Fisher | 78501 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | R21-040-CV | |
Pronase | Roche | PRON-RO | 10 mg/ml |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium fluoride | Sigma-Aldrich | S7920 | |
Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | 221368 | |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | adjust to pH 8.0 |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 |