Summary
Er wordt een effectieve enzymatische methode voor de isolatie van primaire varkens aorta endotheel cellen (pAECs) beschreven. De geïsoleerde primaire pAECs kan worden gebruikt om de immuunrespons en coagulatie reactie bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Abstract
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het tekort aan menselijke organen op te lossen voor patiënten met eindstadium orgaanfalen, en het varken wordt beschouwd als een geschikte orgaan bron. Immuun afwijzing en coagulatie zijn twee belangrijke hindernissen voor het succes van xenotransplantatie. Vasculaire endotheliale cel (EC) letsel en dysfunctie zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de ontsteking en coagulatie reacties bij xenotransplantatie. Zo is isolatie van varkens aorta endotheel cellen (pAECs) noodzakelijk voor het onderzoeken van de immuunafstoting en coagulatie reacties. Hier hebben we een eenvoudige enzymatische aanpak ontwikkeld voor de isolatie, karakterisering en uitbreiding van zeer gezuiverde pAECs van miniatuur varkens. Eerst werd het miniatuur varken verdoofd met ketamine, en een lengte van aorta werd weggesneden. Ten tweede werd het endotheliale oppervlak van aorta blootgesteld aan 0,005% Collagenase IV digestieve oplossing voor 15 min. ten derde werd het endotheeloppervlak van de aorta in slechts één richting met een celscraper (< 10 keer) geschuurd en niet gecomprimeerd tijdens het proces van Schrapen. Tot slot, de geïsoleerde pAECs van dag 3, en na passage 1 en passage 2, werden geïdentificeerd doorstroming cytometrie met een anti-CD31-antilichaam. De percentages van CD31-positieve cellen waren respectievelijk 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1% en 92,4% ± 1,7% (gemiddelde ± SD). De concentratie van Collagenase IV, de spijsverterings tijd, de richting, en de frequentie en intensiteit van het schrapen zijn van cruciaal belang voor het verminderen van fibroblast besmetting en het verkrijgen van hoge zuiverheid en een groot aantal ECs. Concluderend, onze enzymatische methode is een uiterst effentieve methode voor het isoleren van ECs van het miniatuur varken aorta, en de cellen kunnen in vitro worden uitgebreid om de immuunrespons en coagulatie reacties bij xenotransplantatie te onderzoeken.
Introduction
Het tekort aan beschikbare organen voor transplantatie is een uitstekend probleem wereldwijd1. Volgens de Rode Kruis vereniging van China, slechts een klein aantal patiënten met eindstadium orgaan falen kreeg een geschikt orgaan in China in 2018.
Xenotransplantatie is een veelbelovende manier om het probleem van orgaan tekorten op te lossen. Varkens organen worden beschouwd als de meest geschikte organen voor de mens vanwege anatomische en fysiologische gelijkenissen2,3. Het falen van een varkens xenotransplantaatmodellen is is grotendeels gerelateerd aan de primaat immuunafstoting en coagulatie responsen. Varkens endotheel cellen (ECs) zijn kritisch, omdat deze cellen zijn de eerste om te communiceren met het primaat immuunsysteem, waaronder antilichamen, complement, cytokines, en immune cellen (bv, T-cellen, B-cellen, en macrofagen)4,5. Varkens ECs spelen een vitale rol in varkens orgel en eilandje xenotransplantatie6,7. Dus, ECs zijn belangrijke cellen voor het onderzoeken van de afwijzing en coagulatie reacties op een varken Graft. Isolatie van hoge kwaliteit varkens ECs is vereist voor xenotransplantatie onderzoek.
In pogingen om ECs te isoleren van verschillende organen (bijv. hart, nieren, lever en aorta), zijn verschillende protocollen gerapporteerd in een xenotransplantaat instelling8,9,10,11,12. Echter, het houden van een ultrapuur cultuur van geïsoleerde ECs is een uitstekend probleem in de standaardprotocollen. De verhoogde concentratie van de verteerde oplossing, de ongepaste digestie tijd en de intensiteit van de Schraap kunnen bijdragen aan de verhoogde fibroblast besmetting in de huidige studies8,10,13. Trouwens, de methode van geïsoleerde pAECs van miniatuur varkens is minder bestudeerd. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde enzymatische methode om hooggezuiverde pAECs te isoleren van miniatuur varkens (Wuzhishan of Bama). Verschillende stappen in het protocol zijn ontworpen om fibroblast besmetting te verminderen en hoge zuiverheid ECs te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de ethische beoordelingscommissie van Shenzhen Second People's Hospital, in overeenstemming met de beginselen van dierenwelzijn.
1. bereiding van dieren, medium en buffers
- Bereid het miniatuur varken voor.
Opmerking: alle miniatuur varkens waren Chinese Wuzhishan of Bama Pigs (mannelijk). De leeftijd en het gewicht van de varkens waren 100 dagen ± 8 dagen en 5,7 kg ± 1,0 kg (gemiddelde ± SD, n = 3), respectievelijk. - Bereid het kweekmedium voor: endotheliale cel medium (ECM) aangevuld met 10% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetaal serum (FBS), 1% (v/v) penicillaire/streptomycine (P/S) en 1% (v/v) Endotheliale celgroei supplement (ECG'S).
- Bereid de wasbuffer: 1x PBS-oplossing (pH 7,4) met 1% (v/v) P/S.
- Bereid een 0,005% Collagenase IV spijsvertering oplossing: 1 mg Collagenase IV poeder in 20 mL PBS-oplossing. Verwarm de Collagenase digestieve oplossing vóór de spijsvertering bij 37 °C.
- Bereid de stop buffer voor: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd FBS en 1% P/S.
2. chirurgie en voorbereiding voor het isoleren van de aorta-endotheel cellen van varkens
- Ontsmetten van de operatiekamer met UV-licht voor 1 uur en medisch ontsmettingsmiddel 84 vloeistof (beschikbaar chloorgehalte is 4,0%-5,0%, Inhoudsopgave) voor het uitvoeren van een operatie.
- Na het miniatuur varken kreeg een intramusculaire injectie gevormd door 15 mg/kg ketamine, 15 mg/kg Xylazine hydrochloride en 0,05 mg/kg Phenacetin hydrochloride (volumes: 100μL/kg, tabel van de materialen) (Figuur 1a), bevestig het dier anesthesie status met het controleren van de pijnlijke stimulus van varkens (bv. knijpen één oor of schudden één forelimb) en fysiologische index (bv. bloeddruk, hart-en ademhalingsfrequentie).
Opmerking: er kan nog een halve dosis injectie aan het varken worden gegeven als het de tekenen van wakker laat zien. - Snijd de buik met een scalpel, bloot de inferieure Vena Cava en Injecteer daarom heparine natrium (5.000 U, tabel van de materialen) in de onderste Vena Cava met 5 ml spuit.
- Vijf minuten later, steek een katheter aan de abdominale aorta naar bloed, snijd de huid van de borst en insnijden van het diafragma met een scalpel en vervolgens snijd de linker ventrikel af.
Opmerking: Zorg ervoor dat varken wordt geësaliseerd door de aorta puls na het bloederen te controleren en het hart te snijden. - Accijns de ribben met bot Tang (tabel van de materialen), en bloot het hart en de longen. Zoek de aorta posterieure naar het hart en de longen en klem de twee uiteinden. Was de aorta eenmaal met een voorgekoelde wasbuffer (Figuur 1B, C).
- Knip de aorta met een schaar en houd de aorta aan elk uiteinde geklemd. Accijnzen overtollig weefsel rond de aorta met steriele Tang en schaar. Zet de aorta in een centrifugebuis van 50 mL, was de aorta met een voorgekoelde wasbuffer 3x (30 mL per wasbeurt) en breng de aorta over naar het laboratorium (figuur 1d).
3. isolatie van varkens aorta-endotheel cellen
- Verwijder onder aseptische omstandigheden het varken aorta uit de wasbuffer en plaats het op een 150 mm Petri schaaltje (Figuur 2a).
- Knip de twee uiteinden van de aorta voorzichtig af en het overtollige weefsel van de accijnzen rond aorta met steriele Tang en schaar opnieuw (Figuur 2b). Was de buitenkant en binnenkant van de aorta (over het cultuur gerecht bij kamertemperatuur) met 20 − 50 mL wasbuffer.
Opmerking: probeer alleen het gebied waar de klemmen werden geplaatst tijdens de operatie te knippen, omdat sommige ECs werden beschadigd in dit gebied, en overtollige weefsels en arteriële kant takken verwijderen. - Passeer een chirurgische hechting door de aorta en bind vervolgens het ene uiteinde van de aorta met behulp van de chirurgische hechting (5-0, 90cm, tabel van materialen). Houd de chirurgische hechtdraad aan de binnenkant van de aorta (figuur 2c,D).
- Bevestig de aorta in de buurt van het gebonden uiteinde met een tang en trek de chirurgische hechting langzaam om de aorta om te keren totdat het endotheliale oppervlak van de aorta wordt blootgesteld (Figuur 2E-G).
Opmerking: Zorg ervoor dat u de aorta in de buurt van het gebonden uiteinde vast te stellen en niet de aorta strak vast, of anders de aorta kan niet worden teruggedraaid door het trekken van de chirurgische hecht. - Was het endotheliale oppervlak van de aorta met wasbuffer 3x (10 mL per wasbeurt) en gooi deze oplossing dan weg. Plaats de aorta in een centrifugebuis van 15 mL en bedek de aorta met 10 mL 0,005% Collagenase IV digestieve oplossing in de buis (figuur 2H).
Opmerking: Verwarm de spijsverterings oplossing 0,005% Collagenase IV vóór de spijsvertering voor op 37 °C. - Inbroed bij 37 °C gedurende 15 min. plaats de verteerde aorta en spijsvertering oplossing in een kweek schaal van 100 mm en stop de effecten van 0,005% Collagenase IV door 10 − 15 mL voorgekoelde stop buffer toe te voegen.
Opmerking: de aanbevolen verterings tijd is tussen 10 en 20 minuten. Zorg ervoor dat het endotheliale oppervlak van de aorta wordt gedekt door de stop buffer. - Schrapen de pAECs van het binnenoppervlak van de aorta met behulp van een celscraper (figuur 2I). Was de geschraapte aorta 3x met wasbuffer (5 mL per keer). Zet de oplossing van de kweek schaal in een centrifugebuis van 50 mL. Was de bodem van de kweek schotel 2x met wasbuffer (5 mL per keer) en zet de oplossing opnieuw in een centrifugebuis van 50 mL.
Opmerking: schuif in één richting voorzichtig en niet comprimeren. Raak het weefsel niet aan de randen en gaten aan. Schrapen 5 − 8x wordt aanbevolen. - Centrifugeer de buis bij 600 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en laat 10 mL oplossing aan de onderkant van een centrifugebuis van 50 mL. Voeg 20 mL wasbuffer toe aan de centrifugebuis van 50 mL en regeer de pellets. Vermijd bubbels tijdens deze stap.
- Centrifugeer bij 600 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant langzaam weg. Respendeer de celpellets met 1 mL kweekmedium en meng goed.
Opmerking: het verkregen gemiddelde aantal ECs per cm aorta is 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (gemiddelde ± SD, n = 3). - Tel de cellen met een celteller. Plaat en kweek de cellen in een vat zonder coatingmateriaal volgens het celnummer. Als het celgetal kleiner is dan of gelijk is aan 1,0 x 106, worden kweekcellen in een kolf van 25 cm2 . Als het celnummer groter is dan 1,0 x 106, worden de kweekcellen in verschillendekolven van 25 cm (1,0 x 106 cellen per kolf). Plaats de kolf in een incubator (zonder schudden) bij 37 °C met 5% CO2 en vervang het medium elke 2 − 3 dagen.
Opmerking: sommige cellen worden beschadigd door de celscraper. Een cel levensvatbaarheid test vond het percentage levende cellen 95,7% ± 1,7% (gemiddelde ± SD, n = 3). De verdubbelingstijd van de geïsoleerde cellen is ongeveer 1 − 2 dagen.
4. oogst en karakterisering van zuivere endotheel cellen
- Laat de cellen ongeveer 4 − 5 dagen groeien. Wanneer de cellen bereiken 80% samenloop (Figuur 3a), verteren de cellen met 0,25% trypsine en doorgang van de cellen. Vervolgens, verzamel enkele van de geïsoleerde cellen (dag 3, passage 1 en passage 2) en identificeren doorstroming cytometrie (met een anti-CD31-antilichaam).
- Label geïsoleerde pAECs (Cell Number: 1 x 105) (dag 3, passage 1 en passage 2) met anti-PORCINE CD31-fluorescein isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd antilichaam (10 μL antilichaam voor per 100 μL cellen, gekleurd voor 30 min bij 4 °c) voor Flowcytometrie analyse.
- Gate totale levende celpopulatie met een voorwaartse verstrooide plot, onbevlekt monster als een negatieve controle. Presenteer vervolgens de CD31 positieve cellen van de gated cellen met histogram.
Opmerking: de werkzaamheid van CD31-positieve cellen is 97,4% ± 1,2% (dag 3), 94,4% ± 1,1% (P1) en 92,4% ± 1,7% (P2) (gemiddeld ± SD), respectievelijk (Figuur 3b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze methode is bedoeld om een effectieve manier te bieden om zeer gezuiverde ECs te isoleren van de aorta's van miniatuur varkens. Het proces van aorta chirurgie wordt getoond in Figuur 1. De eerste stap is dat de hele aorta uit het varken wordt weggesneden. Het voorkomen van andere cellen of bacteriële besmetting is erg belangrijk. Dus, geen wonden toebrengen aan andere organen of weefsels in het geval ongerichte cellen of bacteriën verontreinigen de aorta, en was de aorta met voorgekoelde wasbuffer 3x (Figuur 1B-D). Een andere belangrijke stap om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden, is het minimaliseren van de tijdsperiode tussen het verkrijgen van het chirurgische specimen en de isolatie procedure.
De processen die betrokken zijn bij de zuivering van de pAECs worden weergegeven in Figuur 2. Onze methode verschilt van anderen omdat het ene uiteinde van de aorta is vastgebonden en het endotheliale oppervlak wordt blootgesteld (figuur 2c-G). Vervolgens wordt het endotheliale oppervlak van de gehele aorta verteerd met voorverwarmde Collagenase digestieve oplossing (5-10 mL) in een 15 mL centrifugebuis (figuur 2H). In vergelijking met andere methoden, het endotheliale oppervlak is meer volledig, en bij voorkeur, blootgesteld aan de spijsvertering oplossing vanwege de inversie van de aorta en onderdompeling in de spijsvertering oplossing (zonder bubbels). Nadat de spijsvertering is gestopt met een stop buffer, moet het endotheliale oppervlak van de aorta voorzichtig in slechts één richting worden geschraapd met een celscraper (figuur 2I). De richting van schrapen is belangrijk om schade aan de ECs te voorkomen. Raak de gaten en snijd de randen van de verteerde aorta niet aan.
Na isolatie worden de ECs geïnspecteerd op de dagen 0, 1 en 2, en na passage 1 (P1) en passage 2 (P2) (Figuur 3a). De geïsoleerde ECs worden geïdentificeerd door flow flowcytometrieonderzoeken met behulp van een anti-CD31-FITC antilichaam. De analyse van de stromings cytometrie heeft aangegeven dat de percentages van CD31-positieve cellen 97,4% ± 1,2% (day3), 94,4% ± 1,1% (P1) en 92,4% ± 1,7% (P2) (gemiddeld ± SD), respectievelijk (Figuur 3b) zijn. Zo kan de isolatie van de pAECs met succes worden bereikt met dit protocol.
Figuur 1: de chirurgische ingreep en excisie van de aorta van een miniatuur varken.
A) foto van een miniatuur varken (Bama). B) de aorta wordt blootgesteld na laparotomie en Thoracotomie. C) de aorta wordt aan elk uiteinde geklemd. D) de aorta wordt in een buis van 50 ml met koude wasbuffer geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: porcine aorta spijsvertering en pAECs isolement.
A) deaorta wordt in een 150 mm Petri schaaltje met koude wasbuffer geplaatst. B) foto van varkens aorta na het verwijderen van bindweefsels. C) de glazen staaf die is gebonden met een steriele chirurgische hechting om door de varkens aorta te passeren. D) het ene uiteinde van de aorta is gebonden met een steriele chirurgische hechtdraad, die aan de binnenkant van de aorta wordt gehouden. (E, F) De aorta wordt omgekeerd door het trekken van de chirurgische hechting. G) het endotheel oppervlak van varkens aorta wordt blootgelegd. H) de verteerde aorta. (I) schrapen het endotheliale oppervlak van de aorta met een celscraper. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: identificatie van hooggezuiverde pAECs doorstroming cytometrie met een anti-CD31 monoklonaal antilichaam.
A) representatieve beelden van geïsoleerde paecs op de dagen 0, 1 en 2, en na passage 1 en passage 2 (200x vergroting). (B) Flowcytometrie analyse van de Paecs (dag 3, passage 1 en 2) met anti-CD31-FITC antilichamen. In de rechterbenedenhoek worden statistische gegevens weergegeven. Gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten (gemiddelde ± SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotheliale cellen worden vaak gebruikt in onderzoek van vasculaire dysfunctie, diabetes, weefselregeneratie, transplantatie, en kankers14,15,16,17,18. Om de biologie en functie van ECs in deze ziekten te begrijpen en te karakteriseren, zijn er talrijke methoden om de ECs van verschillende zieke organen of weefsels te isoleren, gemeld8,19,20, 21 , 22 , 23 , 24. onlangs heeft een toenemend aantal rapporten aangetoond dat varkens ECs verschillende functies heeft in immuun afstoting en coagulatie van xenotransplantatie6,25. Echter, de isolatie van zeer gezuiverde aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens is minder frequent gemeld. Hier beschrijven we een stabiele en eenvoudige methode voor het isoleren van aorta-endotheel cellen van miniatuur varkens.
Collagenase kan verschillende weefsels degraderen, en is superieur aan trypsine of andere spijsvertering oplossingen26,27,28,29. We gebruikten 0,005% Collagenase IV om pAECs te ontkoppelen van een klein varken aorta. Belangrijk, de concentratie van de spijsvertering oplossing moet worden geoptimaliseerd voor verschillende varkens. Spijsverterings oplossingen Collagenase op 0,025%, 0,05% en 0,2% zijn respectievelijk gebruikt in verschillende varkens, volgens leeftijd en RAS10,13,30. Hier, raden wij de optimale concentratie van Collagenase IV te zijn 0,005%, en de optimale spijsvertering tijd te zijn 15 min. De tijd mag niet worden < 10 min of > 20 min, wat overeenkomt met eerdere studies8,30. De concentratie van Collagenase IV en de spijsvertering tijd zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van hoge zuiverheid en grote aantallen ECs. Lagere concentraties van Collagenase IV of kortere spijsverterings tijden zal resulteren in minder ECs. Hogere concentraties van Collagenase IV of langere spijsverterings tijden zullen leiden tot meer fibroblast besmetting.
Celbeschadiging en fibroblast besmetting zijn twee problemen in het isolement van de pAECs. Om celbeschadiging en fibroblast besmetting te verminderen, hebben we een methode aangenomen waarin de ECs zachtjes met een celscraper werd geschuurd. De richting, frequentie en intensiteit van het schrapen zijn essentieel om celbeschadiging en fibroblast besmetting te voorkomen. Eerst hebben we het endotheliale oppervlak van de aorta in één richting geschuurd. Ten tweede raden we aan dat de schrapings frequentie minder dan 10 keer is (5 tot 8 keer wordt aanbevolen), en de intensiteit moet zacht zijn. Tot slot, de gebieden rond de gaten van arteriële kant takken en de snijkanten van de aorta (die kunnen leiden tot fibroblast cellen en meer schade cellen) mag niet worden geschuurd.
Een hogere Collagenase concentratie, langere verterings tijd en verhoogde frequentie en intensiteit van schrapen kunnen de Fibroblast besmetting verhogen. Fibroblasten kunnen de CD31-positieve cellen snel opgroeien, waardoor de zuiverheid van de geïsoleerde ECs31wordt verminderd. In vergelijking met bestaande protocollen, hoewel het protocol zorgvuldig is ontworpen om fibroblast besmetting te voorkomen, en de CD31-positieve cellen op dag 3 97,4% ± 1,2% (gemiddelde ± SD) bereikten, daalde het percentage van CD31 positieve cellen langzaam na de kweek . Als de geïsoleerde ECs worden gebruikt voor het uitvoeren van experimenten na 5 passages, we suggereren dat de cellen moeten worden gesorteerd met een flow cytometrie cel sorteerder10.
Meestal isoleren we niet alleen de endotheelcellen, maar krijgen we ook andere organen voor xenotransplantatie onderzoek, zoals de alvleesklier en de nieren. Volgens onze ervaring zou het beter zijn om eerst de alvleesklier en de longen te isoleren en dan de inkoop van lever en nieren uit te voeren. Zelfs daarna is het niet te laat om het hart en de aorta te isoleren, als de chirurg snel genoeg is om al het isolement in minder dan een half uur af te maken. Tijdens het proces is het zeer belangrijk om het chirurgische gebied steriel en koud te houden. De koude PBS met antibiotica werd naar het doelorgaan gegoten om de mogelijke verontreiniging te reinigen en de weefsels op lage temperatuur te houden. Het is ook noodzakelijk om de coagulatie te voorkomen door heparine te injecteren na anesthesie van het dier. Het stolsel in het micro-vasculaire vat zou leiden tot celdood en ontsteking van organen met meer capillairen, zoals de alvleesklier, de longen en de lever. We injecteren altijd heparine aan de inferieure Vena Cava en voegen een katheter toe aan de abdominale aorta in bloed. Dit zal effectief te voorkomen dat coagulatie gerelateerde celdood.
Kortom, we bieden een effectieve methode om hooggezuiverde pAECs te isoleren van miniatuur varkens. De geïsoleerde pAECs zijn gunstig voor xenotransplantatie onderzoek. Hoewel we de pAECs niet hebben geïsoleerd van een groot varken met behulp van het Protocol, geloven we dat we zeer gezuiverde ECs krijgen van een groot varken met het protocol door enkele kritieke stappen te wijzigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gesteund door subsidies van Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisch wetenschappelijk onderzoek Stichting van de provincie Guangdong, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 en JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua district Stichting van wetenschap en technologie, Grant/Award nummer: 2017013; Nationale sleutel R & D-programma van China, subsidie/Gunnings nummer: 2017YFC1103704; Sanming project van geneeskunde in Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong (2019); Fonds voor medische discipline op hoog niveau bouw van Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Stichting van gezondheid en familie planning Commissie, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 en SZXJ2018059. We bedanken Hancheng Zhang en Zhicheng zou van de Universiteit van Shenzhen voor het assisteren bij de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
