Summary
En effektiv enzymatisk metode for isolering av primær svin aorta endothelial celler (pAECs) fra miniatyr griser er beskrevet. Den isolerte primære pAECs kan brukes til å undersøke immun-og blødnings responsen i xenotransplantation.
Abstract
Xenotransplantation er en lovende måte å løse mangelen på menneskelige organer for pasienter med sluttfasen organ svikt, og grisen er betraktet som en passende organ kilde. Immun avvisning og-blødnings er to store hekk for suksessen til xenotransplantation. Vaskulær endothelial celle (EC) skade og dysfunksjon er viktig for utviklingen av betennelse og blødnings responser i xenotransplantation. Således er isolering av svin aorta endothelial celler (pAECs) nødvendig for å undersøke immun avvisning og blødnings responser. Her har vi utviklet en enkel enzymatisk tilnærming for isolering, karakterisering, og utvidelse av svært renset pAECs fra miniatyr griser. Først ble miniatyr grisen anesteserte med Ketamin, og en lengde av aorta var excised. For det andre, den endothelial overflaten av aorta ble eksponert for 0,005% kollagenase IV fordøyelseskanal løsning i 15 min. tredje, den endothelial overflaten av aorta ble skrapet i bare én retning med en celle skraper (< 10 ganger), og ble ikke komprimert under prosessen med Skraping. Til slutt ble den isolerte pAECs av dag 3, og etter passering 1 og passasje 2, identifisert ved flyt flowcytometri med et anti-CD31 antistoff. Prosentene av CD31-positive celler var 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1%, og 92,4% ± 1,7% (gjennomsnittlig ± SD), henholdsvis. Konsentrasjonen av Kollagenase IV, fordøyelses tiden, retningen og hyppigheten og intensiteten av skraping er avgjørende for å redusere Fibroblast forurensning og oppnå høy renhet og et stort antall ECs. Som konklusjon, er vår enzymatisk metode en svært effctive metode for å isolere ECs fra miniatyr gris aorta, og cellene kan utvides in vitro for å undersøke immunforsvaret og blødnings responser i xenotransplantation.
Introduction
Mangelen på tilgjengelige organer for transplantasjon er et fremragende problem World-Wide1. Ifølge Røde Kors Society of China, fikk bare et lite antall pasienter med slutt-fase orgel svikt et passende organ i Kina i 2018.
Xenotransplantation er en lovende måte å løse problemet med orgel mangel. Gris organer anses å være den mest egnede organer for mennesker på grunn av anatomiske og fysiologiske likheter2,3. Svikt i en gris xenograft er i stor grad knyttet til primater immun avvisning og blødnings responser. Svin endothelial Cells (ECs) er kritiske fordi disse cellene er de første til å samhandle med primater immunsystem, som inkluderer antistoff, komplement, cytokiner, og immunceller (f. eks, T celler, B celler, og makrofager)4,5. Svin ECs spiller en viktig rolle i gris orgel og Holme xenotransplantation6,7. Dermed ECs er viktige celler for å undersøke avvisning og blødnings reaksjoner på en gris pode. Isolering av høy kvalitet svin ECs er nødvendig for xenotransplantation forskning.
I forsøk på å isolere ECs fra forskjellige organer (f.eks. hjerte, nyre, lever og aorta) har flere protokoller blitt rapportert i en xenotransplant innstilling8,9, 10,11,12. Men å holde en ultrarent kultur av isolerte ECs er et fremragende problem i standardprotokoller. Den økte konsentrasjonen av fordøyd løsningen, upassende fordøyelsen tid og skrape intensitet kan bidra til økt Fibroblast forurensning i dagens studier8,10,13. For resten, metoden av isolere pAECs fra miniatyr Pigs er færre studert. Her beskriver vi en optimalisert enzymatisk metode for å isolere svært renset pAECs fra miniatyr griser (Wuzhishan eller Bama). Flere trinn i protokollen er utformet for å redusere Fibroblast forurensning og oppnå ECs med høy renhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av dyr ble godkjent av etikk Review Committee i Shenzhen Second People ' s Hospital, i samsvar med prinsippene om dyrevelferd.
1. utarbeidelse av dyr, medium og buffere
- Forbered miniatyr grisen.
Merk: alle miniatyr griser var kinesiske Wuzhishan eller Bama griser (hann). Alder og vekt av griser var 100 dager ± 8 dager og 5,7 kg ± 1,0 kg (gjennomsnittlig ± SD, n = 3), henholdsvis. - Forbered kultur medium: endothelial celle medium (ECM) supplert med 10% (v/v) varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1% (v/v) penicillin/Streptomycin (P/S) og 1% (v/v) endothelial cellevekst supplement (EKG).
- Klargjør vaske bufferen: 1x PBS-oppløsning (pH 7,4) med 1% (v/v) P/S.
- Forbered en 0,005% kollagenase IV fordøyelses løsning: 1 mg kollagenase IV pulver i 20 mL PBS løsning. Pre-Warm den kollagenase fordøyelses løsningen ved 37 ° c før fordøyelsen.
- Klargjør stopp bufferen: Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% varme-deaktivert FBS og 1% P/S.
2. kirurgi og forberedelser for svin aorta endothelial celle isolasjon
- Desinfisering av operasjonsrommet med UV-lys for 1 time og medisinsk desinfeksjonsmiddel 84 væske (tilgjengelig klorinnhold er 4,0%-5,0%, tabell over materialer) før du utfører operasjonen.
- Etter den miniatyr grisen fikk en intramuskulær injeksjon dannet av 15 mg/kg Ketamin, 15 mg/kg Xylazine hydrochloride og 0,05 mg/kg Phenacetin hydrochloride (volumer: 100μL/kg, tabell av materialer) (figur 1a), bekrefter dyrets anestesi status med å sjekke svin smertefulle stimulans (f. eks knipe ett øre eller riste en forlemen) og fysiologisk indeks (f. eks blodtrykk, hjerte og respirasjonsfrekvens).
Merk: en halv dose injeksjon kan gis til grisen hvis den viser tegn til å våkne opp. - Skjær magen med en skalpell, utsett dårligere vena cava og følgelig injisere heparin natrium (5 000 U, tabell av materialer) i dårligere vena cava med 5 ml sprøyte.
- Fem minutter senere, sette inn et kateter til abdominal aorta til blod, klippe huden på brystet og incise membranen med en skalpell og deretter kutte venstre ventrikkel av.
Merk: Sørg for at grisen er euthanized ved å sjekke aorta pulsen etter blooding og kutte hjertet. - Avgiftsdirektoratet ribbeina med bein tang (tabell over materialer), og utsett hjerte og lunger. Finn aorta bakre til hjerte og lunger og klemme de to endene. Vask aorta en gang med forhånds kjølt vaskebuffer (figur 1B, C).
- Skjær ut aorta med saks og holde aorta klemt i hver ende. Avgiftsdirektoratet overflødig vev rundt aorta med steril tang og saks. Sett aorta inn i en 50 mL sentrifuge slange, vask aorta med pre-avkjølt vaskebuffer 3x (30 mL per vask), og overføre aorta til laboratoriet (figur 1d).
3. isolering av svin aorta endothelial celler
- Under aseptisk forhold, fjerne gris aorta fra vaskebuffer, og legg den på en 150 mm Petri parabol (figur 2a).
- Skjær forsiktig av de to endene av aorta og avgiftsdirektoratet overflødig vev rundt aorta med steril tang og saks igjen (figur 2b). Vask utsiden og innsiden av aorta (over kultur fatet ved romtemperatur) med 20 − 50 mL vaskebuffer.
Merk: Prøv å bare klippeområdet der klemmene ble plassert under operasjonen siden noen ECs ble skadet i dette området, og fjerne overflødig vev og arteriell side grener. - Passerer en kirurgisk Sutur gjennom aorta og deretter knytte den ene enden av aorta ved hjelp av kirurgisk Sutur (5-0, 90cm, tabell av materialer). Hold den kirurgiske Sutur inne i aorta (figur 2C,D).
- Forsiktig fikse aorta nær bundet enden med tang, og deretter trekke kirurgisk Sutur langsomt for å reversere aorta til endothelial overflaten av aorta er eksponert (figur 2E-G).
Merk: Sørg for å feste aorta nær bundet ende og ikke fikse aorta tett, ellers kan aorta ikke reverseres ved å trekke den kirurgiske Sutur. - Vask endothelial overflate av aorta med vaskebuffer 3x (10 mL per vask), og deretter forkaste denne løsningen. Plasser aorta i et 15 mL sentrifugerør, og dekk til aorta med 10 mL 0,005% kollagenase IV fordøyelses løsning i røret (fig. 2h).
Merk: pre-Warm 0,005% kollagenase IV fordøyelseskanal løsning ved 37 ° c før fordøyelsen. - Ruge ved 37 ° c i 15 min. Plasser den fordøyd aorta og fordøyelses løsningen inn i en 100 mm kultur rett, og stopp effekten av 0,005% kollagenase IV ved å tilsette 10 − 15 mL forhånds kjølt stopp buffer.
Merk: anbefalt fordøyelse tid er mellom 10 og 20 minutter. Sørg for at den endothelial overflaten av aorta dekkes av stoppe bufferen. - Forsiktig skrape pAECs av innsiden overflaten av aorta ved hjelp av en celle skraper (figur 2i). Vask den skrapte aorta 3x med vaskebuffer (5 mL per gang). Sett løsningen fra kultur fatet inn i et 50 mL sentrifugerør. Vask bunnen av kultur parabolen 2x med vaskebuffer (5 mL per gang), og Legg oppløsningen i et 50 mL sentrifugerør igjen.
Merk: skrap i en retning forsiktig og ikke komprimere. Ikke berør vevet nær kantene og hullene. Skraping 5 − 8x anbefales. - Sentrifuger røret ved 600 x g i 6 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og la det være 10 mL oppløsning nederst på et 50 mL sentrifugerør. Tilsett 20 mL vaskebuffer til 50 mL sentrifuge slangen, og resuspend pellets. Unngå bobler i dette trinnet.
- Sentrifuger ved 600 x g for 6 min ved 4 ° c. Kast supernatanten langsomt. Resuspend celle pellets med 1 mL kultur medium og bland godt.
Merk: den oppnådde gjennomsnittlige antall ECs per cm aorta er 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (gjennomsnittlig ± SD, n = 3). - Tell cellene med en celle teller. Plate og kultur cellene i et fartøy uten å dekke noen materialer i henhold til celle nummer. Hvis celle tallet er mindre enn eller lik 1,0 x 106, kultur celler i en 25 cm2 kolbe. Hvis celle nummeret er større enn 1,0 x 106, kultur celler i flere 25 cm2 flasker (1,0 x 106 celler per kolbe). Plasser flasken i en inkubator (uten risting) ved 37 ° c med 5% CO2 og Skift ut mediet hver 2 − 3 dager.
Merk: noen celler er skadet av celle skraper. En celle levedyktighet analysen funnet prosentandelen av levende celler til å være 95,7% ± 1,7% (gjennomsnittlig ± SD, n = 3). Dobling tiden av de isolerte cellene er ca 1 − 2 dager.
4. Harvest og karakterisering av rene endothelial celler
- La cellene vokse i ca 4 − 5 dager. Når cellene nå 80% samløpet (figur 3a), fordøye cellene med 0,25% Trypsin og passasje cellene. Deretter samler noen av de isolerte cellene (dag 3, Passage 1 og Passage 2) og identifisere ved Flow flowcytometri (med anti-CD31 antistoff).
- Label isolert pAECs (celle nummer: 1 x 105) (dag 3, Passage 1 og Passage 2) med anti-svin CD31-fluorescein ISOTHIOCYANATE (FITC) bøyd antistoff (10 μL antistoff for per 100 μL celler, beiset i 30 min ved 4 ° c) for Flow flowcytometri analyse.
- Gate total levende celle befolkning med en frem spredt plott, unstained prøven som en negativ kontroll. Deretter presenterer de CD31 positive cellene i gated celler med histogram.
Merk: effekten av CD31-positive celler er 97,4% ± 1,2% (dag 3), 94,4% ± 1,1% (P1) og 92,4% ± 1,7% (P2) (gjennomsnitt ± SD), henholdsvis (figur 3b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår metode har som mål å gi en effektiv måte å isolere svært renset ECs fra aortas fra miniatyr griser. Prosessen med aorta kirurgi er vist i figur 1. Det første trinnet er at hele aorta er excised fra grisen. Forebygge andre celle-eller bakteriell forurensning er svært viktig. Dermed må du ikke skade andre organer eller vev i tilfelle målrettede celler eller bakterier forurenser aorta, og vask aorta med pre-avkjølt vaskebuffer 3x (figur 1B-D). Et annet kritisk skritt for å opprettholde celle levedyktighet er å minimere tiden mellom å få den kirurgiske prøven og isolasjons prosedyren.
Prosessene som er involvert i rensing av pAECs er vist i figur 2. Vår metode er forskjellig fra andre siden den ene enden av aorta er bundet av og endothelial overflate er eksponert (figur 2C-G). Deretter blir den endothelial overflaten av hele aorta fordøyd med forvarmet kollagenase fordøyelses løsning (5-10 mL) i et 15 mL sentrifugerør (fig. 2h). Sammenlignet med andre metoder, er den endothelial overflaten mer fullstendig, og fortrinnsvis, eksponert for fordøyelses løsningen på grunn av inversjon av aorta og nedsenking i fordøyelses løsningen (uten bobler). Etter at fordøyelsen er stoppet med å stoppe buffer, må den endothelial overflaten av aorta være forsiktig skrapet i bare én retning med en celle skraper (figur 2i). Retning av skraping er viktig for å unngå skade på ECs. Ikke berør hullene og kutte kantene av fordøyd aorta.
Etter isolering inspiseres ECs på dag 0, 1 og 2, og etter passering 1 (P1) og passasje 2 (P2) (figur 3a). Den isolerte ECs identifiseres av Flow-flowcytometri ved hjelp av et anti-CD31-FITC-antistoff. Flow flowcytometri analyse har indikert at prosentene av CD31-positive celler er 97,4% ± 1,2% (Day3), 94,4% ± 1,1% (P1) og 92,4% ± 1,7% (P2) (gjennomsnittlig ± SD), henholdsvis (figur 3b). Dermed kan isolasjonen av pAECs oppnås med suksess med denne protokollen.
Figur 1: den kirurgiske prosedyren og fjerning av aorta fra en miniatyr gris.
(A) fotografi av en miniatyr gris (Bama). (B) aorta utsettes etter laparotomy og toraktomi. (C) aorta klemmes i hver ende. (D) aorta er plassert i et 50 ml rør med kald vaskebuffer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: svin aorta fordøyelse og pAECs isolasjon.
(A) aorta er plassert i en 150 mm Petri rett med kald vaskebuffer. (B) fotografi av svin aorta etter fjerning av bindevev. (C) glass bar bundet med en steril kirurgisk Sutur å passere gjennom svin aorta. (D) den ene enden av aorta er bundet med en steril kirurgisk Sutur, som holdes på innsiden av aorta. (E, F) Aorta reverseres ved å trekke den kirurgiske Sutur. (G) endothelial overflate av svin aorta er eksponert. (H) den fordøyd aorta. (I) skraping den endothelial overflaten av aorta med en celle skraper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: identifisering av svært renset pAECs ved flyt flowcytometri med et anti-CD31 monoklonale antistoff.
(A) representative bilder av isolerte PAECs på dag 0, 1 og 2, og etter passering 1 og passasje 2 (200x forstørrelse). (B) Flow flowcytometri-analyse av PAECs (dag 3, passasje 1 og 2) med anti-CD31-FITC-antistoff. Statistiske data presenteres nederst til høyre. Data er representative for tre uavhengige eksperimenter (gjennomsnittlig ± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endothelial celler er ofte brukt i forskning av vaskulær dysfunksjon, diabetes, vev gjenfødelse, transplantasjon, og kreft14,15,16,17,18. Å forstå og karakterisere biologi og funksjon av ECs i disse sykdommene, mange metoder for å isolere ECS av ulike syke organer eller vev har blitt rapportert8,19,20, 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24. nylig har et økende antall rapporter vist at svin ECs har ulike funksjoner i immun avvisning og xenotransplantation6,25. Men isolering av svært renset aorta endothelial celler fra miniatyr griser har blitt rapportert sjeldnere. Her beskriver vi en stabil og enkel metode for isolering av aorta endothelial celler fra miniatyr griser.
Kollagenase kan forringe forskjellige vev, og er bedre enn Trypsin eller andre fordøyelses løsninger26,27,28,29. Vi brukte 0,005% kollagenase IV til å distansere pAECs fra en liten gris aorta. Viktigere, konsentrasjonen av fordøyelsessystemet løsningen bør optimaliseres til ulike griser. Kollagenase fordøyelsessystemet løsninger på 0,025%, 0,05% og 0,2% har blitt brukt henholdsvis i ulike griser, i henhold til alder og rasen10,13,30. Her anbefaler vi den optimale konsentrasjonen av kollagenase IV å være 0,005%, og den optimale fordøyelses tiden å være 15 min. Tiden bør ikke være < 10 min eller > 20 min, som er konsistent med tidligere studier8,30. Konsentrasjonen av kollagenase IV og fordøyelses tiden er avgjørende for å oppnå høy renhet og et stort antall ECs. Lavere konsentrasjoner av kollagenase IV eller kortere fordøyelses tid vil resultere i færre ECs. Høyere konsentrasjoner av kollagenase IV eller lengre fordøyelses tid vil føre til mer Fibroblast forurensning.
Cell skade og Fibroblast forurensning er to problemer i isolasjonen av pAECs. For å redusere celle skade og Fibroblast forurensning, vedtok vi en metode der ECs ble skrapet forsiktig med en celle skraper. Retning, frekvens og intensitet av skraping er avgjørende for å hindre celle skade og Fibroblast forurensning. Først skrapte vi den endothelial overflaten av aorta i en retning bare. For det andre anbefaler vi at skraping frekvensen er mindre enn 10 ganger (5 til 8 ganger anbefales), og intensiteten må være skånsom. Til slutt, områdene rundt hullene av arteriell side grener og kuttet kantene av aorta (som kan føre til Fibroblast celler og mer skade celler) bør ikke bli skrapet.
En høyere kollagenase konsentrasjon, lengre fordøyelse tid, og økt hyppighet og intensitet av skraping kan øke Fibroblast forurensning. Fibroblaster kan raskt vokse CD31-positive celler, og dermed redusere renheten av den isolerte ECs31. Sammenligning med eksisterende protokoller, selv om protokollen har blitt nøye utformet for å hindre Fibroblast forurensning, og CD31-positive celler på dag 3 nådde 97,4% ± 1,2% (gjennomsnittlig ± SD), prosentandelen av CD31 positive celler langsomt redusert etter kultur . Hvis den isolerte ECs-en brukes til å utføre eksperimenter etter fem passasjer, foreslår vi at cellene skal sorteres med en strømnings flowcytometri celle sortering10.
Vanligvis isolerer vi ikke bare de endothelial cellene, men får også andre organer for xenotransplantation forskning, slik som bukspyttkjertel og nyre. Ifølge vår erfaring, ville det bedre å isolere bukspyttkjertel og lunge først, og deretter utføre anskaffelse av lever og nyre. Selv etter at det ikke er for sent å isolere hjertet og aorta, hvis kirurgen er rask nok til å fullføre alle isolasjon på mindre enn en halv time. Under prosessen er det svært viktig å holde operasjonsområdet sterilt og kaldt. Den kalde PBS med antibiotika ble strømmet til målet organ for å rense mulig forurensning og for å holde vev i lav temperatur. Det er også nødvendig for å hindre at blødnings sprøyten ved injeksjon av heparin etter anestesi av dyr. Blodpropp i mikro vaskulære fartøyet ville indusere celle død og betennelse i organer med flere blodkar, slik som bukspyttkjertelen, lungene og leveren. Vi injiserer alltid heparin til dårligere vena cava og sett inn et kateter til abdominal aorta til blod. Dette vil effektivt forhindre blødnings relaterte celle død.
Avslutningsvis gir vi en effektiv metode for å isolere svært renset pAECs fra miniatyr griser. De isolerte pAECs er gunstige for xenotransplantation forskning. Til tross for vi har ikke isolere det pAECs fra en stor gris benytter protokollen, vi mene vi ville få høylig renset ECs fra en stor gris med det protokollen av endring noe betenkelig skritt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medisinsk vitenskapelig forskning stiftelsen av Guangdong-provinsen, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Foundation for vitenskap og teknologi, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 og JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Foundation for vitenskap og teknologi, Grant/Award nummer: 2017013; Nasjonal nøkkel R & D program i Kina, Grant/Award nummer: 2017YFC1103704; Sanming prosjekt av medisin i Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Spesielle midler for bygging av høyt nivå sykehus i Guangdong-provinsen (2019); Fondet for High Level medisinsk disiplin bygging av Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Foundation av helse og familieplanlegging Commission, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 og SZXJ2018059. Vi takker Hancheng Zhang og Zhicheng Zou fra Shenzhen University for å bistå i utarbeidelsen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
