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Biology

अलगाव और लघु सूअर से प्राथमिक महाधमनी Endothelial कोशिकाओं की संस्कृति

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59673
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 2, 6, 3, 3, 3, 1, 2, 1,2,3
1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

Summary

लघु सूअरों से प्राथमिक पॉर्सिन महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (PAECs) के अलगाव के लिए एक प्रभावी एंजाइमी विधि का वर्णन किया गया है। अलग प्राथमिक PAECs exeotransplantation में प्रतिरक्षा और जमावट प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Xenotransplantation अंत चरण अंग विफलता के साथ रोगियों के लिए मानव अंगों की कमी को हल करने के लिए एक शानदार तरीका है, और सुअर एक उपयुक्त अंग स्रोत के रूप में माना जाता है। प्रतिरक्षा अस्वीकृति और स्कंदन xenotransplantation की सफलता के लिए दो प्रमुख बाधाएं हैं. स्वास्कुलर एंडोथेलियल सेल (ईसी) चोट और रोग xenotransplantation में सूजन और स्कंदन प्रतिक्रियाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, प्रतिरक्षा अस्वीकृति और स्कंदन प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए पॉर्सिन महाधमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (PAECs) का अलगाव आवश्यक है। यहाँ, हम अलगाव, विशेषता, और लघु सूअरों से अत्यधिक शुद्ध pAECs के विस्तार के लिए एक सरल एंजाइमी दृष्टिकोण विकसित किया है. सबसे पहले, लघु सुअर ketamine के साथ anaesthetized था, और aorta की लंबाई excised किया गया था. दूसरा, ओर्टा के एंडोथेलियल सतह को 15 मिनट के लिए 0.005% कोलैजेनस IV पाचन समाधान के संपर्क में किया गया था। तीसरा, ऑर्टा की एंडोथेलियल सतह को केवल एक ही दिशा में एक सेल खुरचनी के साथ स्क्रैप किया गया था ([lt;10 बार), और की प्रक्रिया के दौरान संकुचित नहीं किया गया था Scraping. अंत में, 3 दिन के अलग pAECs, और मार्ग 1 और मार्ग 2 के बाद, एक विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पहचान की गई. CD31-सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत 97.4% था - 1.2%, 94.4% - 1.1%, और 92.4% - 1.7% (मतलब ] एसडी), क्रमशः. Collagenase चतुर्थ की एकाग्रता, पाचन समय, दिशा, और आवृत्ति और स्क्रैपिंग की तीव्रता फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को कम करने और उच्च शुद्धता और ईसी की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। अंत में, हमारे एंजाइमी विधि लघु सुअर ओरोटा से ईसी को अलग करने के लिए एक उच्च-प्रभावी विधि है, और कोशिकाओं को विदेशी प्रत्यारोपण में प्रतिरक्षा और जमावट प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इन विट्रो में विस्तारित किया जा सकता है।

Introduction

प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध अंगों की कमी एक उत्कृष्ट समस्या दुनिया भर में1है. चीन के रेड क्रॉस सोसायटी के अनुसार, केवल अंत चरण अंग विफलता के साथ रोगियों की एक छोटी संख्या में चीन में एक उपयुक्त अंग प्राप्त 2018.

अंग की कमी की समस्या को हल करने के लिए Xenotransplantation एक आशाजनक तरीका है। पिग अंगों को शारीरिक और शारीरिकसमानता2,3के कारण मनुष्यों के लिए सबसे उपयुक्त अंग माना जाता है . एक सुअर xenograft की विफलता काफी हद तक प्राइमेट प्रतिरक्षा अस्वीकृति और जमावट प्रतिक्रियाओं से संबंधित है। Porcin endothelial कोशिकाओं (ईसी) महत्वपूर्ण हैं क्योंकि इन कोशिकाओं को प्राइमेट प्रतिरक्षा प्रणाली है, जो एंटीबॉडी, पूरक, साइटोकिन्स, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं (उदा., टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और मैक्रोफेज)4,5शामिल हैं के साथ बातचीत करने के लिए पहली बार कर रहे हैं। पोरसिन ईसी सुअर के अंग और इलेट जेनोट्रांसप्लांटेशन6,7में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . इस प्रकार, ईसी एक सुअर कलम करने के लिए अस्वीकृति और स्कंदन प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं. उच्च गुणवत्ता वाले पॉर्सिन ईसी के अलगाव के लिए विदेशी प्रत्यारोपण अनुसंधान के लिए आवश्यक है।

विभिन्न अंगों (जैसे, दिल, गुर्दे, जिगर और माओरा) से ईसी को अलग करने के प्रयास में, कई प्रोटोकॉल एक xenotransplant सेटिंग8,9,10,11,12में सूचित किया गया है. हालांकि, अलग ईसी के एक ultrapure संस्कृति रखते हुए मानक प्रोटोकॉल में एक उत्कृष्ट समस्या है. पचे हुए घोल की बढ़ी हुई सांद्रता , अनुपयुक्त पाचन समय और परिमार्जन की तीव्रता वर्तमान अध्ययन8,10,13में फाइब्रोब्लास्ट संदूषण में वृद्धि में योगदान दे सकती है . इसके अलावा, लघु सूअरों से अलग PAECs की विधि कम अध्ययन किया जाता है. यहाँ, हम लघु सूअरों (Wuzhishan या Bama) से उच्च शुद्ध PAECs को अलग करने के लिए एक अनुकूलित एंजाइमी विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल में कई कदम फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को कम करने और उच्च शुद्धता ईसीएस प्राप्त करने के लिए डिजाइन किया गया है।

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Protocol

पशु कल्याण के सिद्धांतों के अनुसार शेन्ज़ेन द्वितीय पीपुल्स अस्पताल की आचार समीक्षा समिति द्वारा पशुओं के उपयोग को मंजूरी दी गई थी।

1. जानवरों, मध्यम, और बफ़र्स की तैयारी

  1. लघु सुअर तैयार करें।
    नोट: सभी लघु सूअरों चीनी Wuzhishan या Bama सूअर (पुरुष) थे. सूअरों की आयु और भार क्रमशः 100 दिन - 8 दिन और 5.7 किग्रा थे - 1.0 किग्रा (मतलब ] एसडी, द ] 3), क्रमशः।
  2. संस्कृति माध्यम तैयार करें: एंडोथेलियल सेल मीडियम (ईसीएम) 10% (v/v) गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% (v/v) पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस) और 1% (v/v) एंडोथेलियल सेल विकास (ईसीजीएस)।
  3. धोने बफर तैयार करें: 1x पीबीएस समाधान (पीएच 7.4) 1% (v/v) P/
  4. एक 0.005% collagenase चतुर्थ पाचन समाधान तैयार: 1 PBS समाधान के 20 एमएल में collagenase चतुर्थ पाउडर की मिलीग्राम. पाचन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलैडेज पाचन समाधान को प्री-वार्म करें।
  5. रोक बफर तैयार करें: Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) 10% गर्मी के साथ पूरक सक्रिय FBS और 1% पी /

2. सर्जरी और porcin महाधमनी endothelial सेल अलगाव के लिए तैयारी

  1. सर्जरी करने से पहले 1 एच और चिकित्सा कीटाणुनाशक 84 तरल (उपलब्ध क्लोरीन सामग्री 4.0% - 5.0%, सामग्री कीतालिका) के लिए यूवी प्रकाश के साथ ऑपरेटिंग रूम को संक्रमित करना।
  2. लघु सुअर द्वारा गठित एक इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन प्राप्त करने के बाद 15 mg/kg Ketamine, 15 mg/kg Xylazine हाइड्रोक्लोराइड और 0.05 mg/kg Phenacetin हाइड्रोक्लोराइड (खंड: 100 डिग्री सेल्सियस, सामग्री की तालिका) (चित्रा 1A), पशु की पुष्टि porcin दर्दनाक उत्तेजना की जाँच के साथ संज्ञाहरण स्थिति (जैसे एक कान pinching या एक forelimb मिलाते हुए) और शारीरिक सूचकांक (जैसे रक्तचाप, दिल और श्वसन दर).
    नोट: एक और आधा खुराक इंजेक्शन सुअर को दिया जा सकता है अगर यह जागने के लक्षण से पता चलता है.
  3. एक स्केलपेल के साथ पेट को काटें, अवर वेना कैवा को बेनकाब करें और परिणामस्वरूप हेपरिन सोडियम (5,000 यू, टेबल ऑफसामग्री) को 5 एमएल सिरिंज के साथ अवर वेना कैवा में इंजेक्ट करें।
  4. पांच मिनट बाद, रक्त के लिए पेट aorta के लिए एक कैथेटर डालने, छाती की त्वचा में कटौती और एक स्केलपेल के साथ डायाफ्राम incise और बाद में बाएं वेंट्रिकल काट दिया.
    नोट: सुनिश्चित करें कि सुअर खून और दिल काटने के बाद महाधमनी नाड़ी की जाँच करके ethanized है.
  5. पसलियों को हड्डी के बलप्स (सामग्रीकीतालिका) के साथ उत्पादित करें, और दिल और फेफड़ों को बेनकाब करें। दिल और फेफड़ों के पीछे aorta का पता लगाएं और दो सिरों दबाना. पूर्व ठंडा धोने बफर के साथ एक बार आरोटा धो लें (चित्र 1बी, सी)।
  6. कैंची के साथ aorta बाहर कट और प्रत्येक अंत में aorta clamped रखें. बाँझ बलप और कैंची के साथ aorta के आसपास अतिरिक्त ऊतक उत्पादित करें। एक 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में aorta रखो, पूर्व ठंडा धोने बफर 3x (30 एमएल प्रति धोने) के साथ माओरटा धोने, और प्रयोगशाला के लिए माओरटा हस्तांतरण (चित्र 1D)।

3. पॉर्सिन महाधमनी एन्डोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

  1. एसेप्टिक परिस्थितियों के तहत, धोने के बफर से सुअर आरोटा को हटा दें, और इसे 150 मिमी पेट्री डिश पर रखें (चित्र 2क)।
  2. वाता के दो सिरों को धीरे से काट लें और वाता के चारों ओर अतिरिक्त ऊतक को बाँझ संदक और कैंची से काट लें (चित्र 2ख) बाहर और aorta के अंदर धो (कमरे के तापमान पर संस्कृति पकवान पर) बफर धोने के 20 -50 एमएल के साथ.
    नोट: केवल क्षेत्र में कटौती करने की कोशिश करें जहां clamps सर्जरी के दौरान रखा गया था के बाद से कुछ ईसी इस क्षेत्र में क्षतिग्रस्त हो गए थे, और अतिरिक्त ऊतकों और धमनी की ओर शाखाओं को हटा दें।
  3. वाता के माध्यम से एक शल्य सीवन पास करें और फिर शल्य सीवन (5-0, 90 सेमी, सामग्री कीतालिका) का उपयोग करके वाता के एक छोर को बांधें। शल्य सीवन को वाता के अंदर रखें (चित्र 2च,छ) ।
  4. बलप्स के साथ बंधे अंत के निकट वार्ता को धीरे-धीरे ठीक करें, और फिर शल्य सीवन को धीरे-धीरे खींच लें ताकि वे वाता को तब तक उलटएं जब तक कि वाता की एंडोथेलियल सतह उजागर न हो जाए (चित्र 2ई-जी)।
    नोट: बंधे अंत के पास माओरा को ठीक करने के लिए सुनिश्चित करें और aorta कसकर ठीक नहीं है, अन्यथा माओरटा शल्य सीवन खींच कर उलट नहीं किया जा सकता है।
  5. बफर 3x (10 एमएल प्रति धोने) धोने के साथ आरोटा की एंडोथेलियल सतह को धोलें, और फिर इस समाधान को छोड़ दें। एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में aorta प्लेस, और ट्यूब में 0.005% collagese चतुर्थ पाचन समाधान के 10 एमएल के साथ aorta कवर (चित्र 2H).
    नोट: पाचन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.005% कोलैजाज चतुर्थ पाचन समाधान पूर्व गर्म।
  6. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, डाइजेस्ट ओर्टा और पाचन समाधान को 100 मिमी संस्कृति डिश में रखें और प्री-कूल्ड स्टॉप बफर के 10 डिग्री 15 एमएल जोड़कर 0.005% कोलैनेस IV के प्रभाव को रोक दें।
    नोट: अनुशंसित पाचन समय 10 और 20 मिनट के बीच है। सुनिश्चित करें कि आरोटा की एंडोथेलियल सतह रोक बफर द्वारा कवर किया जाता है।
  7. एक सेल खुरचनी का उपयोग करके वाता के अंदर की सतह से pAECs को धीरे से परिमार्जन करें (चित्र 2I)। धोने बफर (5 एमएल प्रति समय) के साथ स्क्रैप किए गए aorta 3x धो लें। एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति पकवान से समाधान रखो. संस्कृति पकवान 2x के नीचे धोने बफर (5 एमएल प्रति समय) के साथ धो लें, और एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में फिर से समाधान डाल दिया।
    नोट: धीरे से एक दिशा में स्क्रैप और सेक नहीं है। किनारों और छेद के पास ऊतक को न छुएं। स्क्रैपिंग 5 "8x की सिफारिश की है.
  8. ट्यूब को 6 मिनट के लिए 6 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट को त्याग दें और 50 एमएल अपकेंद्रण ट्यूब के तल पर 10 एमएल घोल छोड़ दें। 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 एमएल वॉशिंग बफर जोड़ें, और छर्रों को फिर से चालू करें। इस चरण के दौरान बुलबुले से बचें।
  9. 6 मिनट के लिए 600 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर। धीरे-धीरे महादलित को त्याग दें। कोशिका छर्रों को 1 एमएल संस्कृति माध्यम के साथ पुन: निलंबित करें और अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: प्रति सेमी ऑर्टा के अनुसार ईसी की प्राप्त औसत संख्या 1.9 x 105 है - 1.4 x 104 (माध्यम ] SD, n ] 3)।
  10. कक्ष काउंटर से कक्षों की गणना करें. प्लेट और संस्कृति सेल संख्या के अनुसार किसी भी सामग्री कोटिंग के बिना एक पोत में कोशिकाओं. यदि कोशिका संख्या 1.0 x 106से कम या उसके बराबर है, तो 25 बउ2 फ्लास्क में संस्कृति कोशिकाएँ. यदि कोशिका संख्या 1.0 x 106से अधिक है , तो कई 25 बउ2 फ्लास्क (1.0 x 106 कोशिकाएं प्रति फ्लास्क) में संस्कृति कोशिकाएं। फ्लास्क को एक इन्क्यूबेटर में रखें (बिना हिलके) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ और हर 2 डिग्री 3 दिनों में माध्यम की जगह लें।
    नोट: कुछ कक्ष कक्ष खुरचनी द्वारा क्षतिग्रस्त हैं। एक सेल व्यवहार्यता परख ने पाया कि जीवित कोशिकाओं का प्रतिशत 95.7% है - 1.7% (माध्यम - एसडी, द ] 3)। अलग कोशिकाओं के दोहरीकरण समय के बारे में है 1 $2 दिन.

4. हार्वेस्ट और शुद्ध endothelial कोशिकाओं की विशेषता

  1. कोशिकाओं के बारे में 4 डिग्री 5 दिनों के लिए विकसित छोड़ दें. जब कोशिकाएं 80% संगम तक पहुँचती हैं (चित्र 3क), 0ण्25% ट्रिप्सिन के साथ कोशिकाओं को पचाएं और कोशिकाओं को पारित करें। फिर, कुछ अलग कोशिकाओं को इकट्ठा (दिन 3, मार्ग 1 और मार्ग 2) और प्रवाह साइटोमेट्री (एक विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ) द्वारा की पहचान.
  2. लेबल अलग-अलग PAECs (सेल संख्या: 1 x 105) (दिन 3, पासेज 1 और पासेज 2) एंटी-पोरसिन CD31-fluorescein आइसोथियोसाइन (FITC) संयुग्मी एंटीबॉडी (10 डिग्री एल प्रति 100 डिग्री सेल्सियस कोशिकाओं के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए दाग।
  3. गेट कुल लाइव सेल आबादी एक आगे बिखरे हुए साजिश के साथ, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बेदाग नमूना. फिर हिस्टोग्राम के साथ गेटेड कोशिकाओं की CD31 सकारात्मक कोशिकाओं को प्रस्तुत करें।
    नोट: CD31-सकारात्मक कोशिकाओं की प्रभावकारिता 97.4% है - 1.2% (दिन 3), 94.4% - 1.1% (P1) और 92.4% - 1.7% (P2) (मतलब ] एसडी), क्रमशः (चित्र3B)।

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Representative Results

हमारी विधि लघु सूअरों से aortas से उच्च शुद्ध ईसी को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करना है. एरोटा शर्य की प्रक्रिया चित्र 1में दर्शाया गया है। पहला कदम यह है कि पूरे aorta सुअर से excised है. अन्य कोशिका या जीवाणु संदूषण को रोकना बहुत महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, अन्य अंगों या ऊतकों को घायल न करें यदि अलक्षित कोशिकाएं या बैक्टीरिया ऑर्टा को दूषित करते हैं, और पूर्व-कूल्ड वाशिंग बफर 3x के साथ ऑर्टा को धोएं (चित्र1बी-डी)। सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम शल्य नमूना और अलगाव प्रक्रिया प्राप्त करने के बीच समय की अवधि को कम करने के लिए है.

पीईसी की शुद्धि में शामिल प्रक्रियाओं को चित्र 2में दर्शाया गया है। हमारी विधि दूसरों से अलग है क्योंकि ओर्टा का एक छोर बंद है और एंडोथेलियल सतह को उजागर किया जाता है (चित्र 2C-G)। बाद में, पूरे वाता की एंडोथेलियल सतह को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्री-वार्म्ड कोलाजनेस पाचन समाधान (5-10 एमएल) के साथ पचाया जाता है (चित्र 2एच)। अन्य तरीकों की तुलना में, endothelial सतह अधिक पूरी तरह से है, और अधिमानी, क्योंकि पाचन समाधान में aorta और पनडुब्बी के व्युत्क्रम के पाचन समाधान के संपर्क में (बबलू के बिना). बफर को रोकने के साथ पाचन बंद होने के बाद, आरोटा की एंडोथेलियल सतह को सेल खुरचनी के साथ केवल एक ही दिशा में खुरचनी करनी चाहिए (चित्र 2I)। स्क्रैपिंग की दिशा ईसीएस को नुकसान से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। छेद को न छुएं और पचाए गए ओरोटा के किनारों को काट दें।

अलगाव के बाद, ईसी दिन 0, 1, और 2 पर निरीक्षण कर रहे हैं, और मार्ग 1 (P1) और मार्ग 2 (P2) (चित्र 3A)के बाद. अलग-अलग ईसी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एक एंटी-CD31-FITC एंटीबॉडी का उपयोग करके पहचाने जाते हैं। प्रवाह-गतिमी विश्लेषण से पता चला है कि सीडी31-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत 97.4% है - 1.2% (दिन3), 94.4% ] 1.1% (पी 1) और 92.4% - 1.7% (पी 2) (मतलब ] एसडी), क्रमशः (चित्र 3 बी)। इस प्रकार, पीईसी के अलगाव को इस प्रोटोकॉल के साथ सफलतापूर्वक प्राप्त किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र ाहा: लघु सुअर से वाता का शल्य चिकित्सा प्रक्रिया और उच्छेदन।
(ए) एक लघु सुअर (बामा) की तस्वीर। (बी) लोपरोटोमी और थोरैकोटोमी के बाद कर्णको उजागर किया जाता है। (ग) प्रत्येक छोर पर ओर्टा को दबाया जाता है। (डी) ओर्टा को 50 एमएल ट्यूब में ठंडा धुलाई बफर के साथ रखा गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Porcine aorta पाचन और PAECs अलगाव.
(ए) ओर्टा को 150 मिमी पेट्री डिश में ठंडा धुलाई बफर के साथ रखा जाता है। (ख) संयोजी ऊतकों को हटाने के बाद पोरसिन आरोटा का फोटो। (ग) कांच की छड़ एक बाँझ शल्य सीवन के साथ बंधे porcin aorta के माध्यम से पारित करने के लिए. (घ) वातु का एक सिरा एक बाँझ शल्य सीवन से बंधा होता है, जिसे वातु के अंदर रखा जाता है। (ई, एफ) शल्य सीवन खींच कर आरोटा उलट जाता है। (छ) पोरसिन ओर्टा की अंत:प्रकीर्ण सतह उजागर होती है। (एच) पचे हुए आरोटा। (मैं) एक सेल खुरचनी के साथ aorta के endothelial सतह स्क्रैप. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक विरोधी CD31 monoclonal एंटीबॉडी के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उच्च शुद्ध pAECs की पहचान.
(ए) दिन 0, 1, और 2 पर अलग-अलग PAECs के प्रतिनिधि चित्र, और मार्ग 1 और मार्ग 2 (200x आवर्धन) के बाद। (बी) एंटी-सीडी31-FITC एंटीबॉडी के साथ पीईसी (दिन 3, मार्ग 1 और 2) का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। सांख्यिकीय डेटा नीचे सही में प्रस्तुत कर रहे हैं. डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं (मतलब जेड एसडी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग आमतौर पर संवहनी रोग, मधुमेह , ऊतक पुनर्जनन, प्रत्यारोपण और कैंसर14,15,16,17,18के अनुसंधान में किया जाता है . इन रोगों में ईसी के जीव विज्ञान और कार्य को समझने और उनकी विशेषता के लिए विभिन्न रोगग्रस्त अंगों या ऊतकों के ईसीएस को अलग करने के कई तरीकों की सूचना मिली है8,19,20, 21 , 22 , 23 , 24हाल ही में , रिपोर्टों की बढ़ती संख्या ने यह प्रदर्शित किया है कि पॉर्सिन ईसी में प्रतिरक्षा अस्वीकृति और xenotransplantation6,25के जमाव में विभिन्न कार्य होते हैं . हालांकि, लघु सूअरों से उच्च शुद्ध महाधमनी endothelial कोशिकाओं के अलगाव कम बार सूचित किया गया है. यहाँ, हम लघु सूअरों से महाधमनी endothelial कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक स्थिर और आसान विधि का वर्णन.

कोलैडेनेज विभिन्न ऊतकों को नीचा कर सकता है , और trypsin या अन्य पाचन समाधान26,27,28,29से बेहतर है . हम एक छोटे सुअर aorta से pAECs अलग करने के लिए 0.005% collagenase चतुर्थ का इस्तेमाल किया। महत्वपूर्ण बात, पाचन समाधान की एकाग्रता विभिन्न सूअरों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. कोलाजनेस पाचन समाधान 0.025%, 0.05% और 0.2% पर विभिन्न सूअरों में क्रमशः इस्तेमाल किया गया है, उम्र और नस्ल के अनुसार10,13,30. यहाँ, हम कोलैजाइनस चतुर्थ के इष्टतम एकाग्रता की सिफारिश 0.005% हो, और इष्टतम पाचन समय 15 मिनट हो. समय नहीं होना चाहिए ;10 मिनट या gt;20 मिनट, जो पिछले अध्ययन8,30 केअनुरूप है . collagenase चतुर्थ और पाचन समय की एकाग्रता उच्च शुद्धता और ईसी की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. कोलैडेनेस चतुर्थ या कम पाचन समय के कम सांद्रता कम ईसी में परिणाम होगा. कोलैडेनेस चतुर्थ या लंबे समय तक पाचन समय की उच्च सांद्रता अधिक फाइब्रोब्लास्ट संदूषण के लिए नेतृत्व करेंगे।

सेल क्षति और फाइब्रोब्लास्ट संदूषण पीईसी के अलगाव में दो समस्याएं हैं। सेल क्षति और फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को कम करने के लिए, हमने एक तरीका अपनाया जिसमें ईसी को सेल स्क्रैपर के साथ धीरे-धीरे स्क्रैप किया गया था। कोशिका क्षति और फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को रोकने के लिए स्क्रैपिंग की दिशा, आवृत्ति और तीव्रता महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, हमने केवल एक दिशा में वावरिका की एंडोथेलियल सतह को स्क्रैप किया। दूसरा, हम अनुशंसा करते हैं कि स्क्रैपिंग आवृत्ति 10 गुना से कम हो (5 से 8 बार की सिफारिश की है), और तीव्रता कोमल होना चाहिए. अंत में, धमनी पक्ष शाखाओं के छेद और माओरा के कट किनारों के आसपास के क्षेत्रों (जो फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं और अधिक क्षति कोशिकाओं के लिए नेतृत्व कर सकते हैं) स्क्रैप नहीं किया जाना चाहिए।

एक उच्च collagenase एकाग्रता, लंबे समय तक पाचन समय, और वृद्धि की आवृत्ति और scraping की तीव्रता फाइब्रोब्लास्ट संदूषण बढ़ सकता है. फाइब्रोब्लास्ट तेजी से CD31 सकारात्मक कोशिकाओं को आगे बढ़ा सकते हैं, इस प्रकार अलग ईसी31की शुद्धता को कम करने. मौजूदा प्रोटोकॉल की तुलना, हालांकि प्रोटोकॉल ध्यान से फाइब्रोब्लास्ट संदूषण को रोकने के लिए डिजाइन किया गया है, और 3 दिन पर CD31 सकारात्मक कोशिकाओं 97.4% तक पहुँच - 1.2% (मतलब - एसडी), CD31 सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत धीरे धीरे संस्कृति के बाद कमी आई . यदि पृथक ईसी का उपयोग 5 मार्गों के बाद प्रयोग करने के लिए किया जाता है, तो हमारा विचार है कि कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री सेल सॉर्टर10के साथ हल किया जाना चाहिए।

आमतौर पर, हम न केवल endothelial कोशिकाओं को अलग, लेकिन यह भी exotransplantation अनुसंधान के लिए अन्य अंगों को मिलता है, इस तरह के अग्न्याशय और गुर्दे के रूप में. हमारे अनुभव के अनुसार, यह पहले अग्न्याशय और फेफड़ों को अलग करने के लिए बेहतर होगा, और फिर जिगर और गुर्दे की खरीद प्रदर्शन. इसके बाद भी दिल और पूर्वा को अलग करने में बहुत देर नहीं होती है, अगर सर्जन आधे घंटे से भी कम समय में सभी अलगाव को खत्म करने के लिए पर्याप्त जल्दी है। प्रक्रिया के दौरान, शल्य चिकित्सा क्षेत्र बाँझ और ठंड रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ठंड पीबीएस संभव संदूषण को साफ करने के लिए और कम तापमान में ऊतकों रखने के लिए लक्ष्य अंग के लिए डाला गया था। यह भी पशु की संज्ञाहरण के बाद हेपरिन इंजेक्शन द्वारा जमाव को रोकने के लिए आवश्यक है। सूक्ष्म संवहनी पोत में थक्का कोशिका मृत्यु और अधिक केशिकाओं के साथ अंगों की सूजन को प्रेरित करेगा, जैसे अग्न्याशय, फेफड़े और यकृत। हम हमेशा अवर वेना cava करने के लिए heparin सुई और रक्त के लिए पेट aorta के लिए एक कैथेटर डालने. यह प्रभावी ढंग से जमाव से संबंधित सेल मौत को रोकने जाएगा.

अंत में, हम लघु सूअरों से उच्च शुद्ध PAECs को अलग करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं. अलग-थलग पीईसी विदेशी प्रत्यारोपण अनुसंधान के लिए फायदेमंद होते हैं। हालांकि हम प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक बड़े सुअर से pAECs अलग नहीं किया है, हमें विश्वास है कि हम कुछ महत्वपूर्ण कदम संशोधित करके प्रोटोकॉल के साथ एक बड़े सुअर से अत्यधिक शुद्ध ईसी प्राप्त करेंगे.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

काम गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान / गुआंग्डोंग प्रांत के चिकित्सा वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन, अनुदान / पुरस्कार संख्या: B2018003; शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी के फाउंडेशन, अनुदान / पुरस्कार संख्या: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJH$2017031417135556, JCYJ2016042510300011 और JCYJ20160042814404 शेन्ज़ेन Longhua जिला विज्ञान और प्रौद्योगिकी के फाउंडेशन, अनुदान / चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम, अनुदान/पुरस्कार संख्या: 2017YFC1103704; शेन्ज़ेन में चिकित्सा की सनमिंग परियोजना, अनुदान/पुरस्कार संख्या: एसजेडएसएम201412020; गुआंग्डोंग प्रांत (2019) में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष निधि; शेन्ज़ेन के उच्च स्तरीय चिकित्सा अनुशासन निर्माण के लिए निधि, अनुदान/पुरस्कार संख्या: 2016031638; शेन्ज़ेन फाउंडेशन ऑफ हेल्थ एंड फैमिली प्लानिंग कमीशन, ग्रांट/अवार्ड नंबर: एसजेडएक्सजे2017021 और एसजेडएक्सजे2018059। हम पांडुलिपि की तैयारी में सहायता करने के लिए शेन्ज़ेन विश्वविद्यालय से Hanchheng झांग और झिचेंग ज़ू धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSAria II BD Bioscience
Boneforceps Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China HL-YGQ  
BOON Disposable Syringe (10ml) Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China
CD31-FITC antibody Bio-Rad MCA1746F
Cell scraper Corning  3010#
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138#-1G
Compound ketamine injection  Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306#
DMEM Life Technologies 11965118#
ECM Sciencell 1001#
ECGS Sciencell 1052#
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)  AXYGEN MCT-150-C#
Falcon 100mm Cell Culture Dish Corning 353003#
Fetal Bovine Serum GIBCO 10270-106#
Flowjo v10.0
Forceps  ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Heparin sodium Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China
Iodine tincture Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China
Mshot microscope  Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. M152
Petri Dishes (150 x 15 mm) Biologixgroup 66-1515#
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063#
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? Corning  3289#
Scissors ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Serological Transfer Pipettes (10ml) JET Biofil GSP010010# 
Sterile Pasteur Pipette GeneBrick GY0025#
Sterile Syringe Filter (0.22µm) Millipore SLGV033RS#
Surgical scalpel ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China 22#
Surgical suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd 5-0#
Syringe?5mL? Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO 25200056#
75% Medical alcohol Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) Sangon Biotech B540627#
Medical disinfectant 84 liquid Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd 450ml/bottle

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References

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