Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים

Published: August 14, 2019 doi: 10.3791/59673
Automatic Translation
1,2,3, 4, 5, 2, 6, 3, 3, 3, 1, 2, 1,2,3
1Department of Nephrology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 2Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Shenzhen Second People's Hospital, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen University School of Medicine, 3Department of Medical Laboratory, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 4Department of Endocrinology, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Affiliated Central Hospital of Shenzhen Longhua District, Guangdong Medical University, 5Xenotransplantation Program, Department of Surgery, University of Alabama at Birmingham, 6People's Hospital of Longhua

Summary

שיטת אנזימטית אפקטיבית לבידוד של תאי האבי-העורקים הראשוניים של החזיר (pAECs) מחזירים זעירים מתוארים. PAECs העיקרי מבודד ניתן להשתמש כדי לחקור את התגובה החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.

Abstract

Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את המחסור של איברי האדם עבור חולים עם כשל איבר בשלב הסופי, והחזיר נחשב מקור איבר מתאים. דחייה וקרישה החיסונית הם שני מכשולים עיקריים להצלחת השתלת xenotransplantation הפציעה והתפקוד הגופני של כלי הדם (EC) הם חשובים לפיתוח התגובה לדלקות וקרישת דם ב-xenotransplantation שתלת. כך, בידוד של התאים החיוניים של האבי העורקים (pAECs) יש צורך לחקור את הדחייה החיסונית ואת התגובות קרישת דם. כאן פיתחנו גישה אנזימטית פשוטה לבידוד, אפיון והתרחבות של pAECs מטוהרים מאוד מחזירים זעירים. , החזיר הזעיר הרדימים עם קטמין. ואורך של העורקים היה מגורש שנית, משטח האנדותל של העורקים נחשף 0.005% הפתרון העיכול IV הרביעי עבור 15 דקות. השלישי, משטח האנדותל של העורקים היה מגורד בכיוון אחד בלבד עם מגרד תא (< 10 פעמים), ולא נדחס במהלך התהליך של גירוד. בסופו של דבר, pAECs מבודדים של היום 3, ואחרי מעבר 1 ומעבר 2, זוהו על ידי cy, הזרמת לנסות עם נוגדן anti-CD31. האחוזים של תאים CD31-חיוביים היו 97.4% ± 1.2%, 94.4% ± 1.1%, ו 92.4% ± 1.7% (ממוצע ± SD), בהתאמה. הריכוז של קולגן הרביעי, זמן העיכול, את הכיוון, ואת התדר ואת העוצמה של גירוד הם קריטיים להפחתת זיהום בפיברובלסט וקבלת טוהר גבוהה ומספר רב של ECs. לסיכום, השיטה האנזימטית שלנו היא שיטה מeffctive ביותר לבידוד ECs מן העורקים חזיר מיניאטורי, ואת התאים ניתן להרחיב בתוך מבחנה כדי לחקור את התגובות החיסונית קרישה ב xenotransplantation שתלת.

Introduction

המחסור של איברים זמינים עבור השתלת הוא בעיה מצטיינים ברחבי העולם1. על פי החברה הצולבת האדומה של סין, רק מספר קטן של חולים עם כשל איברים בשלב הסיום קיבל איבר מתאים בסין בשנת 2018.

Xenotransplantation היא דרך מבטיחה לפתור את הבעיה של מחסור באיברים. איברי חזיר נחשבים לאיברים המתאימים ביותר עבור בני אדם בגלל דמיון אנטומי ופיזיולוגי2,3. הכישלון של שהשתיל חזיר מבע ברובו לדחיית החיסון הקופים התגובות קרישת דם. תאים של porcine אנדותל (ecs) הם קריטיים מאז תאים אלה הם הראשונים אינטראקציה עם המערכת החיסונית של הפרימטים, הכוללת נוגדן, משלים, ציטוקינים, ותאים חיסוניים (למשל, T תאים, B תאים, מקרופאגים)4,5. המשחק ecs לשחק תפקיד חיוני באורגן חזיר ו השתלת איון xenotransplantation,7. כך, ECs הם תאים חשובים לחקירת דחייה והתגובות קרישת הדם שתל חזיר. בידוד של ECs באיכות גבוהה נדרש עבור מחקר xenotransplantation שתלת.

בניסיונות לבודד ecs מאיברים שונים (למשל, לב, כליות, כבד, העורקים), כמה פרוטוקולים דווחו בהגדרה xenotransplant שתלה8,9,10,11,12. עם זאת, שמירה על תרבות אולטרה-סאונד של ECs מבודדת היא בעיה יוצאת דופן בפרוטוקולים הסטנדרטיים. הריכוז המוגבר של הפתרון המתעכל, זמן העיכול הבלתי מתאים ועוצמת הגרד עשויה לתרום לזיהום פיברובסט מוגבר במחקרים הנוכחיים8,10,13. חוץ מזה, השיטה של pAECs מבודדים מחזירים זעירים הוא פחות לומד. כאן, אנו מתארים שיטה אנזימטית אופטימיזציה כדי לבודד pAECs מטוהרים מאוד מפני חזירים זעירים (וודז'שאן או במה). כמה צעדים בפרוטוקול נועדו להפחית את זיהום הפיברובלסט ולהשיג ECs טוהר גבוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש בבעלי חיים אושר על ידי ועדת ביקורת האתיקה של בית החולים השני של שנזן, בהתאם לעקרונות של רווחה בעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים, בינוניים ומאגרים

  1. . הכן את החזיר הזעיר
    הערה: כל החזירים הזעירים היו הסינים וודז'שאן או חזיר-במה (זכר). הגיל והמשקל של חזירים היו 100 ימים ± 8 ימים ו 5.7 ק"ג ± 1.0 ק"ג (ממוצע ± SD, n = 3), בהתאמה.
  2. הכינו את מדיום התרבות: בינונית תא אנדותל (ECM) בתוספת של 10% (v/v) החום העובר מופעל סרום (FBS), 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ו 1% (v/v) מוסף הצמיחה של התא האנדותל (ECM).
  3. הכן את מאגר כביסה: 1x פתרון PBS (pH 7.4) עם 1% (v/v) P/S.
  4. הכינו 0.005% קולגן לפתרון העיכול: 1 מ ג של הקולגן העירוי אבקת IV ב 20 מ ל של פתרון PBS. לחמם את התמיסה לפני העיכול ב 37 ° c לפני העיכול.
  5. הכן את מאגר העצירה: מדיום שונה של Dulbecco של הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% חום מופעל FBS ו 1% P/S.

2. כירורגיה וההכנה לבידוד בתאי אבי העורקים של פורצין

  1. חיטוי חדר הניתוח עם אור UV עבור 1 h וחיטוי רפואי 84 נוזל (תוכן כלור זמין הוא 4.0%-5.0%, טבלת חומרים) לפני ביצוע ניתוח.
  2. לאחר שחזיר זעיר קיבל הזרקה התוך שרירי נוצר על ידי 15 מ"ג/ק"ג, 15 מ"ג/ק"ג Xylazine הידרוכללוריד ו 0.05 mg/ק"ג פנימטין הידרוכלוריד (כרכים: 100μL/ק"ג, לוח חומרים) (איור 1a), לאשר את החיה מצב הרדמה עם בדיקת חזירי גירוי כואב (למשל. צובט אחד האוזן או טלטול אחד forelimb) ואת המדד הפיזיולוגי (למשל. לחץ דם, הלב וקצב הנשימה).
    הערה: עוד הזרקת מינון חצי יכול להינתן חזיר אם הוא מראה את הסימנים של התעוררות.
  3. חותכים את הבטן עם אזמל, לחשוף את האובורד הנחותים וכתוצאה מכך להזריק הפארין נתרן (5,000 U, לוח החומרים) לתוך לבנה התחתית הנחותה עם מזרק 5 mL.
  4. חמש דקות מאוחר יותר, להכניס צנתר אל העורקים הבטן לדם, לחתוך את העור של החזה ולשלב את הסרעפת עם אזמל ולאחר מכן לחתוך את החדר השמאלי מחוץ.
    הערה: ודא שחזיר מורמת על-ידי בדיקת דופק אבי העורקים לאחר שהוא מוכתם בדם וחותך את הלב.
  5. בלו את הצלעות עם מלקחיים עצם (שולחן חומרים), וחשפו את הלב והריאות. למצוא את העורקים האחוריים ללב. ולריאות ולהדק את שני הקצוות רחץ את אב העורקים פעם אחת עם מכונת כביסה מקורר מראש (איור 1ב, ג).
  6. לחתוך את העורקים עם מספריים ולהשאיר. את העורקים מהודק בכל קצה . עם מלקחיים ומספריים סטריליים לשים את אבי העורקים לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL, לשטוף את אבי העורקים עם מקורר מאגר כביסה 3x (30 מ"ל לשטוף), ולהעביר את אבי העורקים למעבדה (איור 1D).

3. בידוד תאים בעלי אבי העורקים האנתל

  1. בתנאים אספלי, להסיר את העורקים חזיר מתוך מאגר כביסה, ולמקם אותו על 150 מ"מ צלחת פטרי (איור 2A).
  2. לחתוך בעדינות את שני הקצוות של אב העורקים ואת הרקמה עודף בבלו סביב אב העורקים עם מלקחיים ומספריים סטרילי שוב (איור 2B). רוחצים את החוץ והפנימי של העורקים (מעל קערת התרבות בטמפרטורת החדר) עם 20 ל-50 מ ל של מאגר כביסה.
    הערה: נסו לחתוך רק את השטח שבו התפסים הוצבו במהלך הניתוח מאז שחלק מהecs ניזוקו באזור זה, ומסירים עודפי רקמות וענפים צדדיים.
  3. להעביר תפר כירורגי דרך העורקים ולאחר מכן לקשור קצה אחד של העורקים באמצעות תפר כירורגי (5-0, 90 ס מ, לוח חומרים). שמור את תפר כירורגי בתוך החלק הפנימי של העורקים (איור 2C,D).
  4. בעדינות לתקן את העורקים ליד הקצה קשור עם מלקחיים, ולאחר מכן למשוך את התפר הכירורגי לאט כדי להפוך את העורקים עד משטח האנדותל של העורקים נחשף (איור 2E-G).
    הערה: הקפידו לתקן את העורקים בקרבת הקצה הקשור ולא לתקן את העורקים בחוזקה, אחרת לא ניתן להפוך את העורקים על ידי משיכת תפר הניתוח.
  5. שטוף את משטח האנדותל של אבי העורקים עם מאגר כביסה 3x (10 מ"ל לכביסה), ולאחר מכן למחוק את הפתרון. מניחים את העורקים לתוך 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת, ולכסות את העורקים עם 10 מ ל של 0.005% קולגן הרביעי פתרון העיכול בצינור (איור 2H).
    הערה: לחמם מראש את 0.005% קולגן הפתרון העיכול IV ב 37 ° c לפני העיכול.
  6. מודרת ב 37 ° c עבור 15 דקות. מניחים את העורקים מתעכל ואת הפתרון העיכול לתוך מאכל התרבות 100 מ"מ ולהפסיק את ההשפעות של 0.005% הקולגן הרביעי על ידי הוספת 10 ל 15 מ ל של המנוע מקורר לעצור מאגר.
    הערה: זמן העיכול המומלץ הוא בין 10 ל -20 דקות. תוודא שמשטח האנדותל של. העורקים מכוסה ע י מאגר העצירה
  7. בעדינות לגרד pAECs מהמשטח הפנימי של העורקים באמצעות מגרד תא (איור 2I). שטוף את אבי העורקים 3x עם מאגר כביסה (5 מ ל לשעה). לשים את הפתרון מן הצלחת התרבות לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL. לשטוף את החלק התחתון של תבשיל התרבות 2x עם מאגר כביסה (5 מ ל לשעה), ולשים את הפתרון לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL שוב.
    הערה: שפשוף בכיוון אחד בעדינות ולא לדחוס. אין לגעת ברקמה ליד הקצוות והחורים. מומלץ לגרד 5-8x.
  8. צנטריפוגה את הצינור ב 600 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c. להיפטר supernatant ולהשאיר 10 מ ל של הפתרון בחלק התחתון של שפופרת צנטריפוגה 50 mL. הוסף 20 מ ל של מאגר כביסה לצינור הצנטריפוגה 50 mL, והשהה מחדש את כדורי. להימנע בועות במהלך שלב זה.
  9. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c. . להשליך לאט את הסופרנטאנט השהה מחדש את כדורי התא עם 1 מ ל של תרבות בינונית וערבבו היטב.
    הערה: המספר הממוצע המתקבל של ECs לכל ס מ העורקים הוא 1.9 x 105 ± 1.4 x 104 (ממוצע ± SD, n = 3).
  10. ספור את התאים באמצעות מונה תאים. לוחית ותרבות התאים בכלי מבלי לציפוי כל חומר לפי מספר הטלפון. אם מספר התאים קטן או שווה ל-1.0 x 106, התאים התרבותייםבבקבוקון של 25 ס מ. אם מספר התא גדול יותר מ 1.0 x 106, התרבות תאים במספר 25 ס"מ2 מבחנות (1.0 x 106 תאים לכל בקבוקון). הניחו את הבקבוקון באינקובטור (ללא טלטול) ב-37 ° c עם 5% CO2 והחליפו את המדיום מדי 2-3 ימים.
    הערה: תאים מסוימים פגומים על-ידי מגרד התא. שיטת הכדאיות של התא מצאה את אחוז התאים החיים להיות 95.7% ± 1.7% (ממוצע ± SD, n = 3). זמן ההכפלה של התאים המבודדים הוא כ-1 ימים.

4. הקציר ואפיון תאי האנדותל הטהורים

  1. השאירו את התאים גדלים במשך כ-4-5 ימים. כאשר התאים מגיעים 80% המפגש (איור 3A), לעכל את התאים עם 0.25% טריפסין ומעבר את התאים. לאחר מכן, לאסוף כמה תאים מבודדים (יום 3, מעבר 1 ומעבר 2) ולזהות על ידי cy, הזרימה האנטי (עם נוגדן anti-CD31).
  2. תווית מבודדת pAECs (מספר תא: 1 x 105) (יום 3, מעבר 1 ומעבר 2) עם anti-PORCINE CD31-fluorescocyanyate (fitc) מצוקת הנוגדן (10 μl הנוגדן עבור תאים 100 μl, ויטראז עבור 30 דקות ב -4 ° c) עבור הניתוח cy try.
  3. שער כולל של אוכלוסיית תאים בשידור חי עם מגרש מפוזר לפנים, דגימה ללא המוכתמת כפקד שלילי. ואז להציג את התאים CD31 חיוביים של התאים מגודרת עם היסטוגרמה.
    הערה: היעילות של תאים CD31-חיוביים היא 97.4% ± 1.2% (יום 3), 94.4% ± 1.1% (P1) ו-92.4% ± 1.7% (P2) (ממוצע ± SD), בהתאמה (איור 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה שלנו שואפת לספק דרך יעילה לבידוד ECs מטוהרים מאוד מaortas של חזירים זעירים. תהליך ניתוח העורקים מוצג באיור 1. הצעד הראשון הוא שכל. כללי העורקים מרוטרים מהחזיר מניעת מזהמים אחרים של תאים או בקטריאליים מאוד חשובים. כך, לא לפגוע באיברים אחרים או רקמות במקרה תאים לא ממוקדים או חיידקים לזהם את אבי העורקים, ולשטוף את אב העורקים עם מקורר מקרר מאגר כביסה 3x (איור 1ב-D). צעד קריטי נוסף לשמירת הכדאיות בתאים הוא למזער את תקופת הזמן בין קבלת הדגימה הכירורגית לבין תהליך הבידוד.

התהליכים המעורבים בטיהור של pAECs מוצגים באיור 2. השיטה שלנו שונה מאחרים, מאחר שקצה אחד של העורקים קשור והמשטח האנדותל נחשף (איור 2C-G). לאחר מכן, המשטח האנדותל של העורקים כולו מתעכל עם מערכת טרום מחומם קולגן לפתרון העיכול (5-10 mL) ב 15 מ ל צנטריפוגה צינור (איור 2H). בהשוואה לשיטות אחרות, משטח האנדותל הוא יותר לחלוטין, והוא מעדיף להיחשף לפתרון העיכול בגלל היפוך העורקים ושיפוץ לתוך פתרון העיכול (ללא בועות). לאחר הפסקת העיכול באמצעות הפסקת האגירה, יש להפוך את המשטח האנדותל של העורקים בעדינות לכיוון אחד בלבד עם מגרד תא (איור 2I). הכיוון של גירוד חשוב כדי למנוע נזק ל-ECs. לא לגעת בחורים ולחתוך את הקצוות של העורקים מתעכל.

לאחר בידוד, ECs נבדקו על ימים 0, 1, ו 2, ואחרי מעבר 1 (P1) ומעבר 2 (P2) (איור 3A). ECs מבודדים מזוהים על ידי הזרמת cy, באמצעות נוגדן אנטי CD31-FITC. הניתוח cyCD31 try זרימה ציין כי האחוזים של תאים חיוביים הם 97.4% ± 1.2% (Day3), 94.4% ± 1.1% (P1) ו-92.4% ± 1.7% (P2) (ממוצע ± SD), בהתאמה (איור 3B). לפיכך, ניתן להשיג בהצלחה את הבידוד של pAECs עם פרוטוקול זה.

Figure 1
איור 1: ההליך הכירורגי וכריתה של העורקים מחזיר מיניאטורי.
(א) צילום של חזיר זעיר (במה). (ב) אבהעורקים נחשף לאחר כריתת האונה וכריתת החזה. (ג) העורקים מהודק בכל קצה. (ד) העורקים ממוקמים בצינור 50 mL עם מאגר כביסה קר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: העיכול השני של העורקים והבידוד של pAECs.
(א) העורקים מוצבים בצלחת פטרי ב150 מ"מ עם מאגר כביסה קר. (ב) צילום של אב העורקים של פורצין לאחר הסרת רקמות החיבור. (ג) בר הזכוכית קשור עם תפר כירורגי סטרילי לעבור דרך העורקים חזירי. (ד) קצה אחד של העורקים קשור בתפר כירורגי סטרילי, אשר נשמר בתוך החלק הפנימי של העורקים. (E, F) העורקים מתהפך על ידי. משיכת תפר הניתוחים (ז) נחשף משטח האנדותל של העורקים החזירי. (ח) העורקים העועכלים. (I) מגרד את משטח האנדותל של העורקים עם מגרד תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי של pAECs מטוהר ביותר על ידי זרימה cy, לנסות עם נוגדן אנטי CD31 מונובטיים.
(א) דמויות מייצגות של pAECs בודדים בימים 0, 1, ו-2, ואחרי מעבר 1 ומעבר 2 (הגדלה של 200x). (ב) הזרימה cy, לנסות ניתוח של pAECs (היום 3, מעבר 1 ו 2) עם נוגדן ANTI-CD31-fitc. נתונים סטטיסטיים מוצגים בתחתית הימנית. נתונים הם נציגים של שלושה ניסויים עצמאיים (ממוצע ± SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאי האנדותל משמשים בדרך כלל במחקר של תפקוד כלי דם, סוכרת, התחדשות רקמות, השתלת, סרטן14,15,16,17,18. כדי להבין ולאפיין את הביולוגיה ואת התפקוד של ecs במחלות אלה, שיטות רבות כדי לבודד ecs של איברים חולים שונים או רקמות דווחו8,19,20, מיכל בן 21 , מיכל בן 22 , מיכל בן 23 , 24. לאחרונה, מספר גדל והולך של דיווחים הוכיחו כי ecs להיות פונקציות שונות דחייה החיסונית קרישה של xenotransplantation שתלת6,25. עם זאת, הבידוד של תאי האבי העורקים מטוהרים מאוד מפני שרקנים מיניאטורי דווח פחות פעמים. כאן, אנו מתארים שיטה יציבה וקלה לבידוד של התאים האנדותל של אבי העורקים מפני חזירים זעירים.

קולגאז יכול לבזות רקמות שונות, והוא מעולה טריפסין או פתרונות עיכול אחרים26,27,28,29. השתמשנו 0.005% קולגן הרביעי כדי לנתק pAECs מן העורקים חזיר קטן. וחשוב מכך, ריכוז פתרון העיכול צריך להיות מותאם לחזירים שונים. הקולאז פתרונות העיכול ב 0.025%, 0.05% ו 0.2% שימשו בהתאמה בחזירים שונים, על פי גיל וגזע10,13,30. כאן, אנו ממליצים על ריכוז אופטימלי של קולגן הרביעי להיות 0.005%, ואת זמן העיכול האופטימלי להיות 15 דקות. הזמן לא צריך להיות < 10 דקות או > 20 דקות, אשר מתאים במחקרים קודמים8,30. הריכוז של הקולגן הרביעי ואת זמן העיכול הם קריטיים להשגת טוהר גבוהה ומספר גדול של ECs. ריכוזים נמוכים יותר של קולגן הרביעי או זמני העיכול קצר יגרום פחות ECs. ריכוזים גבוהים יותר של הקולגן הרביעי או זמן העיכול יותר יוביל זיהום פיברוהפיצוץ יותר.

נזק לתאים וזיהום פיברובלסט הם שתי בעיות בבידוד של pAECs. על מנת להפחית את נזקי התאים וזיהום הפיברובלסט, אימצנו שיטה שבה ה-ECs שרוזו בעדינות עם מגרד תאים. הכיוון, התדר, והאינטנסיביות של גירוד הם קריטיים כדי למנוע נזק לתאים וזיהום הפיברובלסט. ראשית, שיפלנו את משטח האנדותל. של העורקים בכיוון אחד בלבד שנית, אנו ממליצים כי תדירות הגירוד תהיה פחות מ -10 פעמים (מומלץ 5 עד 8 פעמים), והעוצמה חייבת להיות עדינה. לבסוף, האזורים המקיפים את החורים של הענפים בצד העורקים ואת הקצוות לחתוך של העורקים (אשר עשוי להוביל לתאי הפיצוץ ותאי נזק יותר) לא צריך להיות מגורד.

מיומנויות גבוהות יותר מאשר הריכוז, זמן העיכול ארוך יותר, ואת תדירות מוגברת ואינטנסיביות של גירוד עשוי להגביר את הזיהום בפיברובלסט. פיברותקיעות עשויה במהירות להפחית את התאים CD31-חיוביים, ובכך להקטין את הטוהר של ECs31מבודד. השוואת הפרוטוקולים הקיימים, למרות הפרוטוקול תוכנן בקפידה כדי למנוע זיהום פיברובלסט, ואת התאים CD31-חיוביים ביום 3 הגיעו 97.4% ± 1.2% (ממוצע ± SD), האחוז של CD31 תאים חיוביים ירידה איטית בעקבות התרבות . אם ECs מבודדים משמשים לביצוע ניסויים לאחר 5 מעברים, אנו מציעים כי התאים צריך להיות ממוין עם זרם cy, לנסות מיון התא10.

בדרך כלל, אנחנו לא רק לבודד את תאי האנדותל, אלא גם לקבל איברים אחרים עבור מחקר xenotransplantation שתלת, כגון הלבלב והכליה. על פי הניסיון שלנו, עדיף לבודד את הלבלב ואת הריאה תחילה, ולאחר מכן לבצע את הרכש של הכבד והכליה. גם אחרי זה לא מאוחר מדי לבודד את הלב ואת העורקים, אם המנתח הוא מהיר מספיק כדי לסיים את כל הבידוד בתוך פחות מחצי שעה. במהלך התהליך, הוא קריטי מאוד כדי לשמור על האזור הכירורגי סטרילי וקר. ה-PBS הקר עם אנטיביוטיקה נשפך לאיבר היעד כדי לנקות את הזיהום האפשרי כדי לשמור את הרקמות בטמפרטורה נמוכה. יש צורך גם למנוע קרישה על ידי הזרקת הפארין לאחר הרדמה של בעל חיים. קריש דם בכלי מיקרו כלי דם היה לגרום מוות בתאים ודלקת של איברים עם נימים יותר, כגון הלבלב, הריאה והכבד. . ומכניסים צנתר לאבי העורקים הבטני לדם זה יהיה ביעילות למנוע קרישת דם הקשורים למוות.

לסיכום, אנו מספקים שיטה יעילה כדי לבודד pAECs מטוהרים מאוד מחזירים זעירים. PAECs מבודדים מועילים למחקר xהשתלת. למרות שאנחנו לא בודדנו את pAECs מן חזיר גדול באמצעות הפרוטוקול, אנו מאמינים שנשיג ECs מטוהרים מאוד מחזיר גדול עם הפרוטוקול על ידי שינוי כמה צעדים קריטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה נתמכת על ידי מענקים מקרן המדע הטבעי של מחוז גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: 2016A030313028; הקרן המדעית למחקר רפואי של פרובינציית גואנג-דונג, גרנט/מספר הפרס: B2018003; קרן שנזן למדע וטכנולוגיה, מספר גרנט/פרס: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 וJCYJ20160428142040945; הקרן למדע וטכנולוגיה של שנג לונחואה, הענקת מספר פרס: 2017013; מפתח לאומי R & D תוכנית של סין, גרנט/מספר הפרס: 2017YFC1103704; פרויקט sanming של הרפואה שנזן, גרנט/מספר הפרס: SZSM201412020; קרנות מיוחדות להקמת בתי חולים ברמה גבוהה בפרובינצית גואנג-דונג (2019); קרן ברמה גבוהה משמעת רפואית בנייה של שנג, גרנט/מספר הפרס: 2016031638; קרן שנזן בריאות ותכנון משפחה הנציבות, גרנט/מספר הפרס: SZXJ2017021 ו SZXJ2018059. אנו מודים לחננג ג'אנג ולדז'נג זיאו מאוניברסיטת שנזן לסיוע בהכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSAria II BD Bioscience
Boneforceps Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China HL-YGQ  
BOON Disposable Syringe (10ml) Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China
CD31-FITC antibody Bio-Rad MCA1746F
Cell scraper Corning  3010#
Collagenase IV Sigma-Aldrich C5138#-1G
Compound ketamine injection  Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306#
DMEM Life Technologies 11965118#
ECM Sciencell 1001#
ECGS Sciencell 1052#
Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL)  AXYGEN MCT-150-C#
Falcon 100mm Cell Culture Dish Corning 353003#
Fetal Bovine Serum GIBCO 10270-106#
Flowjo v10.0
Forceps  ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Heparin sodium Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China
Iodine tincture Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China
Mshot microscope  Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. M152
Petri Dishes (150 x 15 mm) Biologixgroup 66-1515#
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063#
Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? Corning  3289#
Scissors ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China
Serological Transfer Pipettes (10ml) JET Biofil GSP010010# 
Sterile Pasteur Pipette GeneBrick GY0025#
Sterile Syringe Filter (0.22µm) Millipore SLGV033RS#
Surgical scalpel ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China 22#
Surgical suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd 5-0#
Syringe?5mL? Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red GIBCO 25200056#
75% Medical alcohol Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China
20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) Sangon Biotech B540627#
Medical disinfectant 84 liquid Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd 450ml/bottle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
  2. Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
  3. Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
  4. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
  5. McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
  6. Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
  7. Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
  8. Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
  9. Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
  10. Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
  11. Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
  12. Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
  13. Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
  14. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  15. Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
  16. Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
  17. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  18. Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
  19. Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
  20. Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
  21. Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
  22. Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
  23. Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
  24. Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
  25. Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
  26. Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
  27. Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
  28. Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
  29. French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
  30. Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
  31. Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).

Tags

ביולוגיה סוגיה 150 CD31+ תאים תרבות התא חזיר זעיר מיני האבי אבי העורקים בידוד התא הראשי xenotransplantation שתלת
בידוד ותרבות של בתאי אבי העורקים הראשוניים מחזירים זעירים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Zhao, C., Cooper, D. K.… More

Zhao, Y., Zhao, C., Cooper, D. K. C., Lu, Y., Luo, K., Wang, H., Chen, P., Zeng, C., Luan, S., Mou, L., Gao, H. Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs. J. Vis. Exp. (150), e59673, doi:10.3791/59673 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter