Summary
Beschrieben wird eine wirksame enzymatische Methode zur Isolierung von primären porcineaortischen Endothelzellen (pAECs) von Miniaturschweinen. Die isolierten primären pAECs können verwendet werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktion bei Xenotransplantation zu untersuchen.
Abstract
Xenotransplantation ist ein vielversprechender Weg, um den Mangel an menschlichen Organen für Patienten mit Organversagen im Endstadium zu beheben, und das Schwein gilt als geeignete Organquelle. Immunabstoßung und Gerinnung sind zwei große Hürden für den Erfolg der Xenotransplantation. Vaskuläre Endothelzell (EC) Verletzungen und Dysfunktion sind wichtig für die Entwicklung der Entzündung und Gerinnungsreaktionen bei Xenotransplantation. Daher ist die Isolierung von Porenaorten-Endothelzellen (pAECs) notwendig, um die Immunabstoßung und Gerinnungsreaktionen zu untersuchen. Hier haben wir einen einfachen enzymatischen Ansatz für die Isolierung, Charakterisierung und Erweiterung hochgereinigter pAECs von Miniaturschweinen entwickelt. Zuerst wurde das Miniaturschwein mit Ketamin beästheisiert, und eine Länge von Aorta wurde ausgeschnitten. Zweitens wurde die endotheliale Oberfläche der Aorta 15 min der Kollagenase IV-Verdauungslösung ausgesetzt. Drittens wurde die endotheliale Oberfläche der Aorta in nur einer Richtung mit einem Zellschaber (<10-mal) abgekratzt und während des Prozesses der Kratzen. Schließlich wurden die isolierten pAECs von Tag 3 und nach Durchgang 1 und Durchgang 2 durch Durchflusszytometrie mit einem Anti-CD31-Antikörper identifiziert. Die Prozentsätze der CD31-positiven Zellen betrugen 97,4 % bei 1,2 %, 94,4 % bei 1,1 % bzw. 92,4 % bei 1,7 % (mittlere SD). Die Konzentration von Kollagenase IV, die Verdauungszeit, die Richtung, die Häufigkeit und Intensität des Abkratzens sind entscheidend für die Verringerung der Fibroblastenkontamination und die Erlangung einer hohen Reinheit und einer großen Anzahl von ECs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere enzymatische Methode eine hochwirksame Methode zur Isolierung von ECs aus der Miniatur-Schweineaorta ist, und die Zellen können in vitro erweitert werden, um die Immun- und Gerinnungsreaktionen bei der Xenotransplantation zu untersuchen.
Introduction
Der Mangel an verfügbaren Organen für die Transplantation ist weltweit ein offenes Problem1. Nach Angaben der Rotkreuz-Gesellschaft Chinas erhielt 2018 nur eine kleine Anzahl von Patienten mit Organversagen im Endstadium ein geeignetes Organ in China.
Xenotransplantation ist ein vielversprechender Weg, um das Problem des Organmangels zu lösen. Schweineorgane gelten aufgrund anatomischer und physiologischer Ähnlichkeiten als die am besten geeigneten Organe für den Menschen2,3. Das Versagen eines Schweinexenografts hängt weitgehend mit der Immunabstoßung und Gerinnungsreaktionen des Primaten zusammen. Porcine Endothelzellen (ECs) sind kritisch, da diese Zellen die ersten sind, die mit dem Primaten-Immunsystem interagieren, das Antikörper, Komplement, Zytokine und Immunzellen (z. B. T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen)4,5umfasst. Schweine-ECs spielen eine wichtige Rolle in Schweineorgan und Islet Xenotransplantation6,7. Daher sind ECs wichtige Zellen für die Untersuchung der Abstoßungs- und Gerinnungsreaktionen auf ein Schweinetransplantat. Für die Xenotransplantationsforschung ist die Isolierung hochwertiger Schweine-ECs erforderlich.
Bei Versuchen, ECs aus verschiedenen Organen (z.B. Herz, Niere, Leber und Aorta) zu isolieren, wurden mehrere Protokolle in einer Xenotransplantateinstellung8,9,10,11,12berichtet. Die Beibehaltung einer ultrareinen Kultur isolierter ECs ist jedoch ein herausragendes Problem in Standardprotokollen. Die erhöhte Konzentration der verdauten Lösung, ungeeignete Verdauungszeit und Kratzintensität können zur erhöhten Fibroblastenkontamination in aktuellen Studien8,10,13beitragen. Außerdem wird die Methode der isolierten pAECs von Miniaturschweinen weniger untersucht. Hier beschreiben wir eine optimierte enzymatische Methode zur Isolierung hochgereinigter pAECs von Miniaturschweinen (Wuzhishan oder Bama). Mehrere Schritte des Protokolls wurden entwickelt, um die Fibroblastenkontamination zu reduzieren und hochreine ECs zu erhalten.
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Protocol
Die Verwendung von Tieren wurde von der Ethik-Überprüfungskommission des Shenzhen Second People es Hospital in Übereinstimmung mit den Grundsätzen des Tierschutzes genehmigt.
1. Vorbereitung von Tieren, Medien und Puffern
- Bereiten Sie das Miniaturschwein vor.
HINWEIS: Alle Miniaturschweine waren chinesische Wuzhishan- oder Bama-Schweine (männlich). Das Alter und das Gewicht der Schweine betrugen 100 Tage bei 8 Tagen bzw. 5,7 kg bei 1,0 kg (Mittelwert sD, n = 3). - Bereiten Sie das Kulturmedium vor: Endothelzellmedium (ECM) ergänzt durch 10% (v/v) hitzeinaktiviertes fetales Rinderserum (FBS), 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin (P/S) und 1% (v/v) endotheliale Zellwachstumsergänzung (ECGS).
- Bereiten Sie den Waschpuffer vor: 1x PBS-Lösung (pH 7.4) mit 1% (v/v) P/S.
- Bereiten Sie eine 0,005% Kollagennase IV Verdauungslösung: 1 mg Kollagenase IV Pulver in 20 ml PBS-Lösung. Die Kollagenase-Verdauungslösung vor der Verdauung bei 37 °C vorwärmen.
- Bereiten Sie den Stopppuffer vor: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) ergänzt durch 10% hitzeinaktivierte FBS und 1% P/S.
2. Chirurgie und Vorbereitung zur Isolierung von Porenaorten-Endothelzellen
- Desinfizieren des Operationssaals mit UV-Licht für 1 h und medizinischem Desinfektionsmittel 84 Flüssigkeit (verfügbarer Chlorgehalt beträgt 4,0% - 5,0%, Materialtabelle) vor der Durchführung der Operation.
- Nachdem das Miniaturschwein eine intramuskuläre Injektion aus 15 mg/kg Ketamin, 15 mg/kg Xylazinhydrochlorid und 0,05 mg/kg Phenacetinhydrochlorid erhalten hatte ( Volumen: 100 l/kg, Materialtabelle) (Abbildung 1A), bestätigen die Anästhesiestatus mit Überprüfung des schmerzhaften Stimulus von Schweinen (z. B. Kneifen eines Ohres oder Schütteln eines Vorderbeins) und physiologischen Index (z. B. Blutdruck, Herz- und Atemfrequenz).
HINWEIS: Eine weitere halbe Dosis Injektion könnte dem Schwein gegeben werden, wenn es die Anzeichen des Aufwachens zeigt. - Den Bauch mit einem Skalpell schneiden, die unterlegene Vena cava aussetzen und folglich Heparin-Natrium (5.000 U, Materialtabelle)mit 5 ml Spritze in die untere Vena cava injizieren.
- Fünf Minuten später einen Katheter in die Bauchaorta zu Blut geben, die Brusthaut schneiden und das Zwier mit einem Skalpell zerschneiden und anschließend den linken Ventrikel abschneiden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Das Schwein eingeschläfert wird, indem Sie den Aortenpuls nach dem Bluten und Schneiden des Herzens überprüfen. - Verbrauchen Sie die Rippen mit Knochenzangen (Tabelle der Materialien), und belichten Sie das Herz und die Lunge. Finden Sie die Aorta posterior zu Herz und Lunge und klemmen Sie die beiden Enden. Waschen Sie die Aorta einmal mit vorgekühlten Waschpuffer (Abbildung 1B,C).
- Schneiden Sie die Aorta mit der Schere aus und halten Sie die Aorta an jedem Ende geklemmt. Verbrauchen überschüssiges Gewebe um die Aorta mit sterilen Zangen und Schere. Die Aorta in ein 50 ml Zentrifugenrohr geben, die Aorta mit vorgekühltem Waschpuffer 3x (30 ml pro Waschgang) waschen und die Aorta ins Labor geben (Abbildung 1D).
3. Isolierung von Porcine Aorten-Endothelzellen
- Unter aseptischen Bedingungen die Schweineaorta aus dem Waschpuffer entfernen und auf eine 150 mm Petrischale legen (Abbildung 2A).
- Schneiden Sie die beiden Enden der Aorta vorsichtig ab und verbrauchen Sie überschüssiges Gewebe um Aorta herum mit sterilen Zangen und Scheren wieder (Abbildung2B). Waschen Sie die Außen- und Innenseite der Aorta (über die Kulturschale bei Raumtemperatur) mit 20 bis 50 ml Waschpuffer.
HINWEIS: Versuchen Sie, nur den Bereich zu schneiden, in dem die Klemmen während der Operation platziert wurden, da einige ECs in diesem Bereich beschädigt wurden, und entfernen Sie überschüssiges Gewebe und arterielle Seitenzweige. - Passieren Sie eine chirurgische Naht durch die Aorta und binden Sie dann ein Ende der Aorta mit der chirurgischen Naht (5-0, 90cm, Tisch aus Materialien). Bewahren Sie die chirurgische Naht im Inneren der Aorta auf (Abbildung 2C,D).
- Fixieren Sie die Aorta vorsichtig in der Nähe des gebundenen Endes mit Zangen, und ziehen Sie dann die chirurgische Naht langsam, um die Aorta umzukehren, bis die endotheliale Oberfläche der Aorta freigelegt wird (Abbildung 2E-G).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Aorta in der Nähe des gebundenen Endes fixiert wird und fixieren Sie die Aorta nicht fest, sonst kann die Aorta nicht durch Ziehen der chirurgischen Naht umgekehrt werden. - Die endotheliale Oberfläche der Aorta mit einem Waschpuffer 3x (10 ml pro Waschgang) waschen und diese Lösung entsorgen. Legen Sie die Aorta in ein 15 ml Zentrifugenrohr und bedecken Sie die Aorta mit 10 ml 0,005% Kollagennase IV Verdauungslösung in das Rohr (Abbildung 2H).
HINWEIS: Die 0,005% Kollagennase IV Verdauungslösung bei 37 °C vor der Verdauung vorwärmen. - Inkubieren Sie bei 37 °C für 15 min. Legen Sie die verdaute Aorta und Verdauungslösung in eine 100 mm Kulturschale und stoppen Sie die Wirkung von 0,005% Kollagennase IV, indem Sie 10 x 15 ml vorgekühlten Stopppuffer hinzufügen.
HINWEIS: Die empfohlene Verdauungszeit liegt zwischen 10 und 20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Endotheloberfläche der Aorta durch den Stopppuffer abgedeckt ist. - Mit einem Zellschaber (Abbildung2I) kratzen Sie pAECs vorsichtig von der Innenfläche der Aorta ab . Waschen Sie die abgekratzte Aorta 3x mit Waschpuffer (5 ml pro Zeit). Die Lösung aus der Kulturschale in ein 50 ml Zentrifugenrohr geben. Waschen Sie den Boden der Kulturschale 2x mit Waschpuffer (5 ml pro Zeit), und legen Sie die Lösung wieder in ein 50 ml Zentrifugenrohr.
HINWEIS: In eine Richtung vorsichtig kratzen und nicht komprimieren. Berühren Sie das Gewebe nicht in der Nähe der Ränder und Löcher. Es wird empfohlen, 5 x 8x zu verschrotten. - Zentrifugieren Sie das Rohr bei 600 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie 10 ml Lösung an der Unterseite eines 50 ml Zentrifugenrohrs. 20 ml Waschpuffer in das 50 ml Zentrifugenrohr geben und die Pellets wieder aufhängen. Vermeiden Sie Blasen während dieses Schritts.
- Zentrifuge bei 600 x g für 6 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand langsam. Die Zellpellets mit 1 ml Kulturmedium aussetzen und gut vermischen.
ANMERKUNG: Die erhaltene durchschnittliche Anzahl von ECs pro cm Aorta beträgt 1,9 x 105 x 1,4 x 104 (mittelwert ig, sD, n = 3). - Zählen Sie die Zellen mit einem Zellenzähler. Die Zellen in einem Gefäß verankern und kulturieren, ohne Materialien entsprechend der Zellzahl zu beschichten. Wenn die Zellenzahl kleiner oder gleich 1,0 x 106ist, kulturieren Zellen in einem 25 cm2 Kolben. Wenn die Zellenzahl größer als 1,0 x 106ist, kulturieren Zellen in mehreren 25 cm2 Kolben (1,0 x 106 Zellen pro Kolben). Den Kolben in einen Inkubator (ohne Schütteln) bei 37 °C mit 5% CO2 stellen und das Medium alle 2 bis 3 Tage austauschen.
HINWEIS: Einige Zellen werden durch den Zellschaber beschädigt. Ein Zelllebensfähigkeitstest ergab, dass der Anteil der lebenden Zellen 95,7 % bis 1,7 % betrug (Mittelwert sD, n = 3). Die Verdoppelungszeit der isolierten Zellen beträgt ca. 1 bis 2 Tage.
4. Ernte und Charakterisierung reiner Endothelzellen
- Lassen Sie die Zellen für etwa 4-5 Tage wachsen. Wenn die Zellen 80% Zusammenfluss erreichen (Abbildung 3A), verdauen Sie die Zellen mit 0,25% Trypsin und durchgehen die Zellen. Dann sammeln Sie einige der isolierten Zellen (Tag 3, Passage 1 und Passage 2) und identifizieren Sie durch Durchflusszytometrie (mit einem Anti-CD31-Antikörper).
- Etikettisolierte pAECs (Zellnummer: 1 x 105) (Tag 3, Passage 1 und Passage 2) mit Anti-Porin CD31-Fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugierter Antikörper (10 L Antikörper für pro 100 L-Zellen, gebeizt für 30 min bei 4 °C) für die Durchflusszytometrie-Analyse.
- Gate gesamt lebende Zellpopulation mit einem vorwärts verstreuten Plot, unbefleckte Probe als negativer Kontrolle. Dann präsentieren Sie die CD31-positiven Zellen der Gated-Zellen mit Histogramm.
HINWEIS: Die Wirksamkeit von CD31-positiven Zellen beträgt 97,4 % bei 1,2 % (Tag 3), 94,4 % bis 1,1 % (P1) bzw. 92,4 % 1,7 % (P2) (Mittelwert SD) (Abbildung3B).
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Representative Results
Unsere Methode zielt darauf ab, eine effektive Möglichkeit zu bieten, hochgereinigte ECs von den Aortas von Miniaturschweinen zu isolieren. Der Prozess der Aorta-Operation ist in Abbildung 1dargestellt. Der erste Schritt ist, dass die ganze Aorta vom Schwein entfernt wird. Die Verhinderung anderer Zell- oder Bakterienkontaminationen ist sehr wichtig. So verletzen Sie nicht andere Organe oder Gewebe, falls ungezielte Zellen oder Bakterien die Aorta kontaminieren, und waschen Sie die Aorta mit vorgekühlten Waschpuffer 3x (Abbildung 1B-D). Ein weiterer wichtiger Schritt zur Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit besteht darin, den Zeitraum zwischen der Beschaffung der chirurgischen Probe und dem Isolationsverfahren zu minimieren.
Die Prozesse, die an der Reinigung von pAECs beteiligt sind, sind in Abbildung 2dargestellt. Unsere Methode unterscheidet sich von anderen, da ein Ende der Aorta abgebunden ist und die endotheliale Oberfläche freigelegt wird (Abbildung 2C-G). Anschließend wird die endotheliale Oberfläche der gesamten Aorta mit vorgewärmter Kollagennase-Verdauungslösung (5-10 ml) in einem 15 ml Zentrifugenrohr verdaut (Abbildung 2H). Im Vergleich zu anderen Methoden ist die endotheliale Oberfläche aufgrund der Umkehrung der Aorta und des Eintauchens in die Verdauungslösung (ohne Blasen) vollständiger und bevorzugt der Verdauungslösung ausgesetzt. Nachdem die Verdauung mit stoppendem Puffer gestoppt wurde, muss die endotheliale Oberfläche der Aorta mit einem Zellschaber vorsichtig in nur einer Richtung abgekratzt werden (Abbildung 2I). Die Richtung des Abkratzens ist wichtig, um Schäden an den ECs zu vermeiden. Berühren Sie nicht die Löcher und schneiden Kanten der verdauten Aorta.
Nach der Isolierung werden die ECs an den Tagen 0, 1 und 2 sowie nach Durchgang 1 (P1) und Durchgang 2 (P2) (Abbildung 3A)überprüft. Die isolierten ECs werden durch Durchflusszytometrie mit einem Anti-CD31-FITC-Antikörper identifiziert. Die Analyse der Durchflusszytometrie hat ergeben, dass die Prozentsätze der CD31-positiven Zellen 97,4 % bis 1,2 % (Tag3), 94,4 % bis 1,1 % (P1) bzw. 92,4 % bis 1,7 % (P2) (mittelwert - SD) betragen (Abbildung 3B). Somit kann die Isolierung von pAECs mit diesem Protokoll erfolgreich erreicht werden.
Abbildung 1: Der chirurgische Eingriff und die Exzision der Aorta von einem Miniaturschwein.
(A) Foto eines Miniaturschweins (Bama). (B) Die Aorta wird nach Laparotomie und Thorakotomie ausgesetzt. (C) Die Aorta wird an jedem Ende geklemmt. (D) Die Aorta wird in einem 50 ml Rohr mit Kaltwaschpuffer platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Porcine Aorta-Verdauung und pAECs-Isolierung.
(A) Die Aorta wird in eine 150 mm Petrischale mit Kaltwaschpuffer gelegt. (B) Foto von Schweineaorta nach Entfernung von Bindegewebe. (C) Die Glasstange mit einer sterilen chirurgischen Naht gebunden, um durch die Schweineaorta passieren. (D) Ein Ende der Aorta ist mit einer sterilen chirurgischen Naht verbunden, die auf der Innenseite der Aorta aufbewahrt wird. (E,F) Die Aorta wird durch Ziehen der chirurgischen Naht umgekehrt. (G) Die endotheliale Oberfläche der Schweineaorta ist freigelegt. (H) Die verdaute Aorta. (I) Verschrottung der endotheliaalen Oberfläche der Aorta mit einem Zellschaber. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Identifizierung hochgereinigter pAECs durch Durchflusszytometrie mit einem monoklonalen Antikörper gegen CD31.
(A) Repräsentative Bilder isolierter pAECs an den Tagen 0, 1 und 2 sowie nach Durchgang 1 und Durchgang 2 (200-fache Vergrößerung). (B) Durchflusszytometrieanalyse von pAECs (Tag 3, Durchgang 1 und 2) mit Anti-CD31-FITC-Antikörpern. Statistische Daten werden unten rechts dargestellt. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente (mittelwerte SD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Endothelzellen werden häufig in der Forschung von vaskulären Dysfunktion, Diabetes, Geweberegeneration, Transplantation, und Krebs14,15,16,17,18verwendet. Um die Biologie und Funktion von ECs bei diesen Krankheiten zu verstehen und zu charakterisieren, wurden zahlreiche Methoden zur Isolierung der ECs verschiedener erkrankter Organe oder Gewebe berichtet8,19,20, 21 , 22 , 23 , 24. In jüngster Zeit haben immer mehr Berichte gezeigt, dass Schweine-ECs verschiedene Funktionen bei der Immunabstoßung und Gerinnung von Xenotransplantation6,25haben. Die Isolierung hochgereinigter Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen wurde jedoch seltener berichtet. Hier beschreiben wir eine stabile und einfache Methode zur Isolierung von Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen.
Kollagenase kann verschiedene Gewebe abbauen, und ist besser Trypsin oder andere Verdauungslösungen26,27,28,29. Wir verwendeten 0,005% Kollagenase IV, um pAECs von einer kleinen Schweineaorta zu trennen. Wichtig ist, dass die Konzentration der Verdauungslösung auf verschiedene Schweine optimiert werden sollte. Kollagenase Verdauungslösungen bei 0,025%, 0,05% und 0,2% wurden jeweils bei verschiedenen Schweinen verwendet, je nach Alter und Rasse10,13,30. Hier empfehlen wir die optimale Konzentration der Kollagenase IV auf 0,005% und die optimale Verdauungszeit auf 15 min. Die Zeit sollte nicht <10 min oder >20 min sein, was mit früheren Studienübereinstimmt 8,30. Die Konzentration von Kollagenase IV und die Verdauungszeit sind entscheidend für die Erlangung einer hohen Reinheit und einer großen Anzahl von ECs. Niedrigere Konzentrationen von Kollagenase IV oder kürzere Verdauungszeiten führen zu weniger ECs. Höhere Konzentrationen von Kollagenase IV oder längere Verdauungszeiten führen zu mehr Fibroblastenkontamination.
Zellschäden und Fibroblastenkontamination sind zwei Probleme bei der Isolierung von pAECs. Um Zellschäden und Fibroblastenkontaminationen zu reduzieren, haben wir eine Methode gewählt, bei der die ECs vorsichtig mit einem Zellschaber abgekratzt wurden. Die Richtung, Häufigkeit und Intensität des Abkratzens sind entscheidend, um Zellschäden und Fibroblastenkontaminationen zu verhindern. Zuerst kratzten wir die endotheliale Oberfläche der Aorta nur in eine Richtung. Zweitens empfehlen wir, dass die Abkratzfrequenz weniger als 10 Mal sein sollte (5 bis 8 Mal wird empfohlen), und die Intensität muss sanft sein. Schließlich sollten die Bereiche, die die Löcher der arteriellen Seitenzweige und die Schnittkanten der Aorta umgeben (was zu Fibroblastenzellen und mehr Schadenszellen führen könnte), nicht abgekratzt werden.
Eine höhere Kollagenasekonzentration, längere Verdauungszeit und erhöhte Häufigkeit und Intensität des Abkratzens können die Fibroblastenkontamination erhöhen. Fibroblasten können die CD31-positiven Zellen schnell überwuchern, wodurch die Reinheit der isolierten ECs31reduziert wird. Im Vergleich zu bestehenden Protokollen wurde das Protokoll sorgfältig entwickelt, um eine Fibroblastenkontamination zu verhindern, und die CD31-positiven Zellen erreichten am 3. Tag 97,4 % bis 1,2 % (mittleres SD), wobei der Prozentsatz der CD31-positiven Zellen nach der Kultur langsam abnahm. . Wenn die isolierten ECs für Experimente nach 5 Passagen verwendet werden, schlagen wir vor, dass die Zellen mit einem Durchflusszytometrie-Zellsortierer10sortiert werden sollten.
Normalerweise isolieren wir nicht nur die Endothelzellen, sondern erhalten auch andere Organe für die Xenotransplantationsforschung, wie die Bauchspeicheldrüse und die Niere. Nach unserer Erfahrung wäre es besser, die Bauchspeicheldrüse und Lunge zuerst zu isolieren, und dann die Beschaffung von Leber und Niere durchzuführen. Auch danach ist es nicht zu spät, das Herz und die Aorta zu isolieren, wenn der Chirurg schnell genug ist, um die gesamte Isolation in weniger als einer halben Stunde zu beenden. Während des Prozesses ist es sehr wichtig, den operationsischen Bereich steril und kalt zu halten. Das kalte PBS mit Antibiotika wurde an das Zielorgan gegossen, um die mögliche Kontamination zu reinigen und das Gewebe bei niedriger Temperatur zu halten. Es ist auch notwendig, die Gerinnung durch Injektion von Heparin nach anästhesien des Tieres zu verhindern. Das Gerinnsel im Mikrogefäß würde Zelltod und Entzündung von Organen mit mehr Kapillaren, wie der Bauchspeicheldrüse, der Lunge und der Leber induzieren. Wir injizieren heparin immer in die unterlegene Vena cava und legen einen Katheter in die Bauchaorta zu Blut. Dies wird effektiv verhindern, Gerinnung im Zusammenhang mit Zelltod.
Zusammenfassend bieten wir eine effektive Methode, um hochgereinigte pAECs von Miniaturschweinen zu isolieren. Die isolierten pAECs sind vorteilhaft für die Xenotransplantationsforschung. Obwohl wir die pAECs nicht von einem großen Schwein isoliert haben, das das Protokoll verwendet, glauben wir, dass wir hochgereinigte ECs von einem großen Schwein mit dem Protokoll erhalten werden, indem wir einige kritische Schritte ändern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde durch Stipendien der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, Grant/Award Nummer: 2016A030313028; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, Grant/Award Number: B2018003; Shenzhen Foundation of Science and Technology, Grant/Award-Nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 und JCYJ201604281420404945; Shenzhen Longhua District Foundation of Science and Technology, Grant/Award Number: 2017013; National Key R&D Programm von China, Grant/Award-Nummer: 2017YFC1103704; Sanming Project of Medicine in Shenzhen, Grant/Award Number: SZSM201412020; Sonderfonds für den Bau hochrangiger Krankenhäuser in der Provinz Guangdong (2019); Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen, Grant/Award Number: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission, Grant/Award Number: SZXJ2017021 und SZXJ2018059. Wir danken Hancheng Zhang und Zhicheng Zou von der Universität Shenzhen für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
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