Summary
小型ブタから原発性ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)を単離するための有効な酵素法が記載されている。単離された一次pAECは、xeno移植における免疫および凝固応答を調べるために使用することができる。
Abstract
Xeno移植は、末期臓器不全患者のヒト臓器不足を解決する有望な方法であり、ブタは適切な臓器源と考えられている。免疫拒絶反応と凝固は、xeno移植の成功のための2つの主要なハードルです。血管内皮細胞(EC)損傷および機能不全は、xeno移植における炎症および凝固応答の発症にとって重要である。したがって、ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)の単離は、免疫拒絶反応および凝固応答を調べるための必要がある。ここでは、小型ブタから高精製されたpAECの分離、特性評価、拡大のためのシンプルな酵素アプローチを開発しました。まず、小型豚をケタミンで麻酔し、大腸の長さを取り除いた。第二に、大動脈の内皮表面を0.005%コラゲナーゼIV消化液に15分間曝露し、大動脈の内皮表面を細胞スクレーパー(<10回)で一方向にのみ削り取り、その過程で圧縮されなかった。こする。最後に、3日目の単離されたpAECを、および通路1および通路2の後に、抗CD31抗体を用いたフローサイトメトリーにより同定した。CD31陽性細胞の割合は、それぞれ97.4%±1.2%、94.4%±1.1%、92.4%±1.7%(平均±SD)であった。コラゲナーゼIVの濃度、消化時間、方向、スクレイピングの頻度と強度は、線維芽細胞汚染を減少させ、高純度および多数のICを得るために重要です。結論として、我々の酵素法は、小型ブタ大脳からICを分離するための非常に効果的な方法であり、細胞を体積して異種移植における免疫および凝固応答を調べることができます。
Introduction
移植のための利用可能な臓器の不足は、世界的に顕著な問題です1.中国赤十字社によると、2018年に中国で末期臓器不全を起えた患者はごくわずかです。
Xeno移植は、臓器不足の問題を解決するための有望な方法です。豚の臓器は、解剖学的および生理学的類似性2、3のために人間に最も適した器官であると考えられている。ブタ異種移植片の不全は、霊長類の免疫拒絶反応および凝固応答に大きく関連している。これらの細胞は、抗体、補体、サイトカイン、および免疫細胞(例えば、T細胞、B細胞、およびマクロファージ)を含む霊長類免疫系と相互作用する最初の細胞であるため、ブタ内皮細胞(IC)は重要である4、5。ブタのICはブタの臓器およびイレットの細胞移植6、7で重要な役割を果たしている。したがって、ICは、ブタ移植片に対する拒絶反応および凝固応答を調出するための重要な細胞である。xeno移植研究には高品質のブタICの分離が必要です。
異なる臓器(例えば、心臓、腎臓、肝臓および大腸)からICを分離する試みにおいて、いくつかのプロトコルは、異種移植設定8、9、10、11、12で報告されている。しかし、分離されたICの超純粋な文化を維持することは、標準プロトコルでは顕著な問題です。消化溶液の濃度の増加は、不適切な消化時間および擦り傷強度が、現在の研究8、10、13における線維芽細胞汚染の増加に寄与しうる。また、小型ブタからpAECを単離する方法はあまり研究されていない。ここでは、精製性の高いpAICを小型ブタ(無気力またはバマ)から分離するための最適化された酵素法について説明する。プロトコルのいくつかのステップは、線維芽細胞汚染を低減し、高純度のICを得るように設計されています。
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Protocol
動物の使用は、動物福祉の原則に従って、深セン第二人民病院の倫理審査委員会によって承認されました。
1. 動物、培地、バッファーの調製
- ミニチュアブタを準備します。
注:すべてのミニチュアブタは、中国のムジシャンまたはバマ豚(雄)でした。ブタの年齢及び重量は、それぞれ100日±8日及び5.7kg±1.0kg(平均±SD、n=3)であった。 - 培養培地を調製する:内皮細胞培地(ECM)を10%(v/v)熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)および1%(v/v)内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)で補充した。
- 洗浄バッファーを準備する: 1x PBS 溶液 (pH 7.4) 1% (v/v) P/S.
- 0.005%コラゲナーゼIV消化液を調出す:PBS溶液の20mLでコラゲナーゼIV粉末の1mg。消化前に37°Cでコラゲナーゼ消化液を予温める。
- 停止バッファーを準備する:ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM)を10%熱不活性化FBSと1%P/Sで補充した。
2. ブタ大動脈内皮細胞分離の手術と準備
- 手術を行う前に、手術室を1時間の紫外線と医療消毒剤84液(利用可能な塩素含有量は4.0%~5.0%、材料の表)で消毒します。
- ミニチュアブタは、15mg/kgケタミン、15mg/kgの塩酸キシラジン、塩酸0.05mg/kgのフェナセチン(容積:100μL/kg、材料の表)で形成された筋肉内注射を受けた後(図1A)、動物の確認ブタの痛みを伴う刺激(例えば、片方の耳をつまむか、片方の前肢を振る)と生理学的指数(血圧、心臓および呼吸数)をチェックする麻酔状態。
注:それは目を覚ます兆候を示している場合は、別の半分の用量注射は、豚に与えることができる。 - メスで腹部を切断し、劣った静脈カバを露出させ、その結果、5 mL注射器で下の静脈カバにヘパリンナトリウム(5,000 U、材料のテーブル)を注入する。
- 5分後、腹部大動脈にカテーテルを血液に挿入し、胸部の皮膚を切断し、メスで横隔膜を切開し、その後左心室を切り取る。
注:ブタが血液を採取し、心臓を切断した後に大動脈性脈拍をチェックすることによって安楽死していることを確認してください。 - 肋骨を骨鉗子(材料の表)で物品を取り除き、心臓と肺を露出させる。心臓と肺に大動脈の後部を見つけ、両端をクランプします。大器をあらかじめ冷却した洗浄バッファーで一度洗います(図1B,C)。
- はさみで大動脈を切り取り、大動脈を両側に締め付けたままにします。生殖不能の鉗子およびはさみで大断のまりの余分なティッシュを切除する。50 mL遠心管に大小管を入れ、予め冷却された洗浄バッファー3x(1洗浄あたり30mL)で大王を洗浄し、大王を実験室に移す(図1D)。
3. ブタ大動脈内皮細胞の単離
- 無菌条件下で、ブタ大器を洗浄バッファーから取り出し、150mmペトリ皿に置きます(図2A)。
- 大両の両端をそっと切り取り、無菌鉗子とはさみで大断の周りに余分な組織を取り除く(図2B)。大器の外側と内側(室温で培養皿の上)を20~50mLの洗浄バッファーで洗浄します。
注:一部のICがこの領域で損傷を受けたため、手術中にクランプが置かれた領域のみをカットし、余分な組織や動脈側の枝を取り除くようにしてください。 - 外科縫合糸を大通しに渡し、外科縫合糸(5-0,90cm,材料の表)を使用して大曲の一方の端を結ぶ。外科縫合糸は大通りの内側に保つ(図2C、D)。
- 結ばれた端の近くの大腸を鉗子でそっと固定し、外科縫合糸をゆっくりと引っ張って大腸の内皮表面が露出するまで大腸を逆転させる(図2E-G)。
注:結ばれた端の近くに大曲を固定し、大曲をしっかりと固定しないことを確認するか、外科縫合糸を引っ張ることによって大口を逆にすることはできません。 - 大王の内皮表面を洗浄バッファー3x(洗浄当たり10mL)で洗浄し、この溶液を廃棄します。大器を15mL遠心管に入れ、0.005%のコラゲナーゼIV消化液をチューブ内の10mLで覆う(図2H)。
注:消化前に37°Cで0.005%コラゲナーゼIV消化液を予め温めなさい。 - 37°Cで15分間インキュベートし、消化大器と消化液を100mm培養皿に入れ、予冷止停止バッファーの10-15 mLを加えることで0.005%コラゲナーゼIVの効果を止める。
注:推奨消化時間は10~20分です。大器の内皮表面が停止バッファーで覆われていることを確認します。 - セルスクレーパーを使用して、大陸の内側からPAECをそっと削り取ります(図2I)。掻き取った大オルタ3xを洗浄バッファー(1回あたり5mL)で洗浄します。培養皿の溶液を50mL遠心管に入れます。培養皿の底部を洗浄バッファー(1回あたり5mL)で洗い、溶液を再び50mL遠心管に入れます。
注:一方向に優しく擦り、圧縮しないでください。端や穴の近くの組織に触れないでください。5−8xのスクレイピングをお勧めします。 - 4 °Cで6分間600 x gでチューブを遠心分離します。上清を捨て、50 mL遠心管の底部に10mLの溶液を残します。50 mL遠心管に20mLの洗浄バッファーを加え、ペレットを再サスペンドします。この手順では、気泡を避けてください。
- 4 °Cで6分間600 x gの遠心分離機。上清をゆっくりと捨てます。培養培地の1 mLで細胞ペレットを再中断し、よく混ぜます。
注:cm大次あたりの得られた平均IC数は1.9 x 105 ± 1.4 x 10 4(平均±SD、n =3)です。 - セル カウンタを使用してセルをカウントします。細胞数に応じて任意の材料をコーティングすることなく容器内の細胞をプレートおよび培養する。細胞数が1.0 x 106以下の場合、25cm2フラスコ中の培養細胞。細胞数が1.0 x 106より大きい場合、複数の25cm2フラスコ(フラスコあたり1.0 x 106セル)で培養細胞。フラスコを5%CO2で37°Cのインキュベーター(振らず)に入れ、2−3日ごとに培地を交換します。
注:一部の細胞は、セルスクレーパーによって損傷を受けています。細胞生存率アッセイでは、生細胞の割合が95.7%±1.7%であることが判明しました(平均±SD、n=3)。単離細胞の倍増時間は約1−2日である。
4. 純粋な内皮細胞の収穫と特徴付け
- 細胞は約4−5日間成長したままにする。細胞が80%の合流率(図3A)に達すると、0.25%トリプシンで細胞を消化し、細胞を通過させる。次いで、単離細胞の一部(3日目、パッセージ1およびパッセージ2)を収集し、フローサイトメトリー(抗CD31抗体を用いて)によって同定する。
- 標識単離されたpAEC(細胞数:1x 10 5)(3日目、パッセージ1およびパッセージ2)を抗ブタ性CD31-フルレッセインイソチオシアネート(FITC)共役抗体(100μL細胞当たり10μL抗体、4°Cで30分間染色)を行い、フローサイト分析を行った。
- 前方散乱プロットを持つゲート全ライブ細胞集団、陰性対照として染色されていないサンプル。次いで、ゲート細胞のCD31陽性細胞をヒストグラムで提示する。
注:CD31陽性細胞の有効性は97.4%±1.2%(3日目)、94.4%±1.1%(P1)、92.4%±1.7%(P2)(平均±SD)、それぞれ(図3B)である。
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Representative Results
この方法は、高精製されたICを小型ブタから大口から分離する効果的な方法を提供することを目的としています。大横手術の過程を図1に示す。最初のステップは、大小全部が豚から取り除かれることです。他の細胞や細菌の汚染を防ぐことは非常に重要です。したがって、標的化されていない細胞や細菌が大腸を汚染した場合に他の器官や組織を傷つけないようにし、予め冷却された洗浄バッファー3xで大腸を洗浄する(図1B-D)。細胞の生存率を維持するためのもう一つの重要なステップは、外科標本と単離手順を得ることまでの期間を最小限に抑えることである。
pAECの精製に関与するプロセスを図2に示します。大腸の一方の端が結ばれ、内皮表面が露出するので、我々の方法は他のものとは異なります(図2C-G)。続いて、大口全体の内皮表面を15mL遠心管(図2H)で予温めたコラゲナーゼ消化液(5〜10mL)で消化する。他の方法と比較して、内皮表面はより完全であり、優先的には、大げさの反転および消化液への浸漬のために消化液にさらされる(気泡なし)。消化が停止バッファーで停止した後、大根の内皮表面は、細胞スクレーパーで一方向のみに穏やかに削られなければならない(図2I)。スクレイピングの方向は、PCへの損傷を避けるために重要です。消化された大器の穴や切り取った縁に触れないでください。
分離後、PC は 0 日目、1 日目、および 2 日目に検査され、通路 1 (P1) および通路 2 (P2) (図 3A) の後に検査されます。単離されたICは、抗CD31-FITC抗体を用いたフローサイトメトリーによって同定される。フローサイトメトリー分析は、CD31陽性細胞の割合が97.4%±1.2%(Day3)、94.4%±1.1%(P1)および92.4%±1.7%(P2)(平均±SD)、それぞれ(図3B)であることを示している。したがって、このプロトコルを使用すると、pAECの分離を正常に実現できます。
図1:ミニチュアブタからの大器切除の外科的処置および切除。
(A) ミニチュアブタ(バマ)の写真。(B) 大胸は、腹腔切りおよび胸部切出術後に曝露される。(C) 大動脈は各端で締め付けられる。(D) 大器は、冷たい洗浄バッファーを備えた50mLチューブに入れられます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ブタ大げ子消化およびpAc分離。
(A) 大根は、冷たい洗浄バッファーを備えた150mmペトリ皿に置かれる。(B) 結合組織を除去した後のブタ大原の写真。(C) ブタ大曲を通過するために無菌の外科縫合糸で結ばれたガラス棒。(D) 大歯の一方の端は、大口の内側に保持されている無菌の外科縫合糸で結ばれている。(E, F)大開は外科縫合糸を引っ張ることによって逆転する。(G) ブタ大腸の内皮表面が露出している。(H) 消化された大器。(私)大器の内皮表面を細胞スクレーパーで削る。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:抗CD31モノクローナル抗体によるフローサイトメトリーによる高精製pAECの同定
(A) 0日目、1日目、2日目、および通路1および通路2(200倍倍)の後の孤立したpAECの代表的な画像。(B) 抗CD31-FITC抗体を用いたpAEC(3日目、通路1および2)のフローサイトメトリー分析。統計データは右下に表示されます。データは、3つの独立した実験(平均±SD)を代表するものです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
内皮細胞は、血管機能障害、糖尿病、組織再生、移植、および癌14、15、16、17、18の研究で一般的に使用される。これらの疾患におけるICの生物学と機能を理解し特徴付けるために、異なる疾患の臓器や組織のICを単離する多数の方法が報告されている8,19,20,21歳,22歳,23歳,24.最近、ブタのICが免疫拒絶反応およびxeno移植6、25の凝固において様々な機能を有することを実証した報告が増えている。しかし、精製性の高い大動脈内皮細胞を小型ブタから分離する頻度は低いと報告されている。ここでは、小型ブタから大動脈内皮細胞を単離するための安定的かつ容易な方法について述べた。
コラゲナーゼは、異なる組織を分解することができ、トリプシンまたは他の消化液26、27、28、29よりも優れています。0.005%のコラゲナーゼIVを用い、小さな豚大断からpAECを解離した。重要なのは、消化液の濃度を異なる豚に最適化する必要があります。0.025%、0.05%および0.2%のコラゲナーゼ消化液は、年齢および品種10、13、30に応じて、それぞれ異なる豚で使用されている。ここでは、コラゲナーゼIVの最適濃度を0.005%、最適な消化時間を15分とすることをお勧めします。時間は、以前の研究8、30と一致する<10分または>20分であってはなりません。コラーゲナーゼIVの濃度と消化時間は、高純度および多数のICを得るために重要である。コラゲナーゼIVの濃度が低いか、消化時間が短いと、より少ないICになります。コラゲナーゼIVの高濃度またはより長い消化時間は、より多くの線維芽細胞汚染につながります。
細胞損傷と線維芽細胞汚染は、pAECの単離における2つの問題である。細胞損傷や線維芽細胞汚染を低減するために、セルスクレーパーでICを優しく削り取る方法を採用しました。スクレイピングの方向、周波数、強度は、細胞の損傷や線維芽細胞汚染を防ぐために重要です。まず、大横の内皮面を一方向のみに削り取った。次に、スクレイピング頻度を 10 倍未満(5~8 回推奨)、強度を穏やかにすることをお勧めします。最後に、動脈側枝の穴と大動脈の切断エッジ(線維芽細胞およびより多くの損傷細胞につながる可能性がある)を取り囲む領域を削るべきではありません。
コラゲナーゼ濃度が高いほど、消化時間が長くなり、スクレイピングの頻度および強度が増加すると、線維芽細胞汚染が増加する可能性があります。線維芽細胞は、CD31陽性細胞を急速に成長させ、従って単離されたIC31の純度を低下させる。既存のプロトコルと比較すると、プロトコルは線維芽細胞汚染を防ぐために慎重に設計されていますが、3日目のCD31陽性細胞は97.4%±1.2%(平均±SD)に達しましたが、培養後にCD31陽性細胞の割合はゆっくりと減少しました。.単離されたICを使用して5つの経過後に実験を行う場合、細胞をフローサイトメトリー細胞選別器10でソートすることを提案する。
通常、我々は内皮細胞を単離するだけでなく、膵臓や腎臓などのxeno移植研究のための他の臓器を得る。私たちの経験によると、最初に膵臓と肺を分離し、次に肝臓と腎臓の調達を行う方が良いでしょう。その後も、心臓と大間を分離するのに遅すぎることはなく、外科医が半時間未満ですべての隔離を完了するのに十分な速さであれば。プロセスの間に、外科区域を生殖不能および冷たい保つことが非常に重要である。抗生物質を含む冷たいPBSを標的臓器に注ぎ、汚染の可能性を浄化し、組織を低温に保った。また、動物の麻酔後にヘパリンを注入することによって凝固を防ぐ必要があります。微小血管血管の血栓は、膵臓、肺、肝臓などのより多くの毛細血管を持つ器官の細胞死および炎症を誘発する。我々は常に下腹部カバにヘパリンを注入し、血液に腹部大動脈にカテーテルを挿入します。これは効果的に凝固関連細胞死を防ぐことができます。
結論として、我々は、非常に精製されたpAECを小型ブタから分離するための効果的な方法を提供する。単離されたpAECは、xeno移植研究に有益である。プロトコルを使用して大きなブタからpAICを分離していませんが、いくつかの重要なステップを変更することで、プロトコルを持つ大型ブタから高度に精製されたICを得ると考えています。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、広東省自然科学財団の助成金、助成金/賞番号:2016A030313028の助成金によって支援されました。広東省医学科学研究財団, 助成金/賞番号: B2018003;深セン科学技術振興財団、助成金/賞番号:JCYJ20180306172449376、 JCYJ20180306172459580、JCJY2016029204849975、GJHZ201703141713575556、JCYJ2016042151030000110300001とJCYJ20101000011000001深センロンフア地区科学技術財団、助成金/賞番号:2017013;中国国家主要研究開発プログラム、助成金/賞番号:2017YFC1103704;深センの医学のサンミンプロジェクト, 助成金/賞番号: SZSM201412020;広東省の高レベル病院建設特別基金(2019年)深センの高レベル医療規律建設基金,助成金/賞番号: 2016031638;深セン健康・家族計画委員会、助成金/賞番号:SZXJ2017021およびSZXJ2018059。我々は、原稿の準備を支援してくれた深セン大学のハンチェン・ジャンとZhicheng Zouに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
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