Summary
يتم وصف طريقة أنزيمية فعالة لعزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية الأولية (pAECs) من الخنازير المصغرة. يمكن استخدام pAECs الأولية المعزولة للتحقيق في الاستجابة المناعية والتخثر في الزرع xenotransplant.
Abstract
Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل النقص في الأعضاء البشرية للمرضى الذين يعانون من فشل الجهاز في المرحلة النهائية، ويعتبر الخنزير كمصدر مناسب للأعضاء. رفض المناعة والتخثر هما عقبتان رئيسيتان لنجاح زرع xenotransplant. إصابة الخلايا البطانية الوعائية (EC) والخلل مهم لتطوير استجابات الالتهاب والتخثر في زرع الأكسي. وهكذا، فإن عزل الخلايا البطانية الأبهرية البورسينية (pAECs) ضروري للتحقيق في استجابات الرفض المناعي والتخثر. هنا، قمنا بتطوير نهج أنزيمي بسيط لعزل وتوصيف وتوسيع pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة. أولاً، تم التخدير عن الخنزير المصغر بالكيتامين، وتم استئصال طول الأبهر. ثانيا، تعرض السطح البطانية من الأبهر إلى 0.005٪ كولاجيناز الرابع محلول هضمي لمدة 15 دقيقة، ثالثا، تم كشط سطح بطانة الأبهر في اتجاه واحد فقط مع مكشطة الخلية (<10 مرات)، ولم يتم ضغطها خلال عملية الغاء. وأخيراً، تم تحديد pAECs معزولة من اليوم 3، وبعد مرور 1 والممر 2، عن طريق قياس التدفق مع الأجسام المضادة CD31. وكانت النسب المئوية للخلايا الإيجابية CD31 97.4٪ ± 1.2٪، 94.4٪ ± 1.1٪، و 92.4٪ ± 1.7٪ (يعني ± SD)، على التوالي. تركيز Collagenase الرابع، والوقت الهضمي، واتجاه، وتواتر وكثافة كشط حاسمة لخفض التلوث الليفي والحصول على عالية النقاء وعدد كبير من ECs. في الختام، لدينا طريقة الأنزيمية هي طريقة عالية الفعالية لعزل ECs من الأبهر الخنزير مصغرة، ويمكن توسيع الخلايا في المختبر للتحقيق في استجابات المناعة والتخثر في الزرع xenotransplant.
Introduction
نقص الأعضاء المتاحة للزرع هو مشكلة المعلقة في جميع أنحاء العالم1. ووفقا لجمعية الصليب الأحمر الصينية، لم يتلق سوى عدد قليل من المرضى الذين يعانون من فشل في الأعضاء في المرحلة النهائية جهازا مناسبا في الصين في عام 2018.
زرع Xenotransplant هو وسيلة واعدة لحل مشكلة نقص الأعضاء. وتعتبر أجهزة الخنزير لتكون الأجهزة الأكثر ملاءمة للبشر بسبب التشابه التشريحي والفيزيولوجي2،3. يرتبط فشل xenograft خنزير إلى حد كبير إلى رفض المناعة الرئيسيات والاستجابات التخثر. الخلايا البطانية البورسينية (ECs) حاسمة لأن هذه الخلايا هي الأولى للتفاعل مع الجهاز المناعي الرئيسي، والذي يتضمن الأجسام المضادة، تكملة، السيتوكينات، والخلايا المناعية (على سبيل المثال، الخلايا T، الخلايا B، والضامة)4،5. Porcine ECs تلعب دورا حيويا في عضو الخنزير وislet xenotransplant6,7. وهكذا، ECs هي خلايا هامة للتحقيق في ردود الرفض والتخثر لطعم الخنزير. مطلوب عزل عالية الجودة من الخنازير ECs لبحوث الزرع xenotransplant.
في محاولات لعزل ECs من أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، القلب والكلى والكبد والأبهر)، تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات في إعداد xenotransplant8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الحفاظ على ثقافة فائقة النقاء للمركبات الإلكترونية المعزولة يمثل مشكلة بارزة في البروتوكولات القياسية. زيادة تركيز الحل المهضوم، ووقت الهضم غير المناسب وكثافة كشطقد تسهم في زيادة التلوث الليفي في الدراسات الحالية 8،10،13. إلى جانب ذلك، فإن طريقة pAECs معزولة من الخنازير مصغرة هو أقل دراسة. هنا، نقوم بوصف طريقة أنزيمية محسنة لعزل pAECs عالية النقاء من الخنازير المصغرة (Wuzhishan أو Bama). وقد تم تصميم عدة خطوات في البروتوكول للحد من التلوث الليفي والحصول على ECs عالية النقاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة مراجعة الأخلاقيات بمستشفى شنتشن الشعبى الثانى على استخدام الحيوانات وفقا لمبادئ رعاية الحيوان .
1. إعداد الحيوانات والمتوسطة والمخازن المؤقتة
- جهز الخنزير المصغر
ملاحظة: كانت جميع الخنازير المصغرة خنازير ووزيشان الصينية أو الباما (ذكر). وكان عمر ووزن الخنازير 100 يوم ± 8 أيام و 5.7 كجم ± 1.0 كجم (متوسط ± SD، ن = 3)، على التوالي. - إعداد وسط الثقافة: متوسطة الخلايا البطانية (ECM) مع 10٪ (v/v) الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني (FBS)، 1٪ (V / V) البنسلين / العقديات (P / S) و 1٪ (V / V) ملحق نمو الخلايا البطانية (ECGS).
- إعداد المخزن المؤقت للغسيل: 1x حل PBS (pH 7.4) مع 1٪ (v/v) P/S.
- إعداد 0.005٪ كولاجيناز الرابع حل الجهاز الهضمي: 1 ملغ من مسحوق الكولاجين الرابع في 20 مل من محلول PBS. قبل تسخين محلول الكولاجين الهضمي عند 37 درجة مئوية قبل الهضم.
- إعداد العازلة وقف: دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطلة FBS و 1٪ P / S.
2. الجراحة والتحضير لعزل الخلايا الأبهرية الأبهرية
- تطهير غرفة العمليات مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة ومطهر طبي 84 السائل (محتوى الكلور المتاحة هو 4.0٪ - 5.0٪، جدولالمواد) قبل إجراء الجراحة.
- بعد أن تلقى الخنزير المصغر حقنة عضلية مكونة من 15 ملغم/كغم من الكيتامين، و15 ملغم/كغم من هيدروكلوريد إكسلازين و0.05 ملغم/كغم من هيدروكلوريد فيناسيتين (الأحجام: 100 درجة مئوية/كغم، جدولالمواد) (الشكل1A)،تأكيد هيدروكلوريد الحيوان حالة التخدير مع فحص المحفزات المؤلمة (على سبيل المثال، قرصة أذن واحدة أو هز طرف واحد) ومؤشر الفسيولوجية (على سبيل المثال ضغط الدم والقلب ومعدل الجهاز التنفسي).
ملاحظة: يمكن إعطاء حقن نصف جرعة أخرى للخنزير إذا كان يظهر علامات الاستيقاظ. - قطع البطن مع مشرط، وفضح الوريد الأجوف السفلي وبالتالي حقن الصوديوم الهيبارين (5000 U، جدولالمواد) في الوريد الأجوف السفلي مع حقنة 5 مل.
- بعد خمس دقائق، أدخل قسطرة إلى الشريان الأبهري البطني إلى الدم، وقطع جلد الصدر وتقطيع الحجاب الحاجز مع مشرط ثم قطع البطين الأيسر قبالة.
ملاحظة: تأكد من أن يتم قتل الخنزير عن طريق التحقق من نبض الأبهر بعد الدم وقطع القلب. - استئصال الأضلاع بملقطالعظام (جدول المواد)، وفضح القلب والرئتين. العثور على الأبهر الخلفي إلى القلب والرئتين والمشبك طرفي. غسل الأبهر مرة واحدة مع قبل تبريد العازلة الغسيل (الشكل1B،C).
- قطع الأبهر مع مقص والحفاظ على الأبهر فرضت في كل نهاية. مكوس الأنسجة الزائدة حول الأبهر مع ملقط معقمة ومقص. وضع الأبهر في أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وغسل الأبهر مع العازلة الغسيل المبردة مسبقا 3X (30 مل لكل غسل)، ونقل الأبهر إلى المختبر (الشكل1D).
3. عزل الخلايا الأبهرية الأبهرية
- في ظل الظروف العقيمة، وإزالة الأبهر الخنزير من العازلة الغسيل، ووضعها على طبق بيتري 150 ملم (الشكل2A).
- قطع بلطف طرفي الأبهر والمكوس الأنسجة الزائدة حول الأبهر مع ملقط معقمة ومقص مرة أخرى (الشكل2B). اغسل الجزء الخارجي والداخلي من الأبهر (فوق طبق الثقافة في درجة حرارة الغرفة) بسعة 20-50 مل من مخزن الغسيل المؤقت.
ملاحظة: حاول فقط قطع المنطقة التي تم وضع المشابك أثناء الجراحة منذ تلف بعض ECs في هذه المنطقة، وإزالة الأنسجة الزائدة والفروع الجانبية الشريانية. - تمرير خياطة جراحية من خلال الأبهر ثم ربط نهاية واحدة من الأبهر باستخدام خياطة الجراحية (5-0، 90cm، جدولالمواد). الحفاظ على خياطة الجراحية في داخل الأبهر (الشكل2C،D).
- إصلاح بلطف الأبهر بالقرب من نهاية مرتبطة مع ملقط، ومن ثم سحب خياطة الجراحية ببطء لعكس الأبهر حتى يتعرض سطح بطانة من الأبهر (الشكل2E-G).
ملاحظة: تأكد من إصلاح الأبهر بالقرب من نهاية مرتبطة ولا إصلاح الأبهر بإحكام، وإلا لا يمكن عكس الأبهر عن طريق سحب خياطة الجراحية. - اغسل السطح البطانية للأبهر مع مخزن الغسيل المؤقت 3x (10 مل لكل غسل)، ثم تجاهل هذا الحل. وضع الأبهر في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وتغطية الأبهر مع 10 مل من 0.005٪ كولاجيناز الرابع حل الجهاز الهضمي في الأنبوب (الشكل2H).
ملاحظة: قبل تسخين 0.005٪ كولاجيناز الرابع حل الجهاز الهضمي في 37 درجة مئوية قبل الهضم. - قم بالحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ضع الأبهر المهضوم والحل الهضمي في طبق ثقافة 100 مم وأوقف آثار الكولاجين الرابع بنسبة 0.005% بإضافة 10-15 مل من حاجز التوقف المبرد مسبقًا.
ملاحظة: وقت الهضم الموصى به بين 10 و 20 دقيقة. تأكد من تغطية السطح البطانية للأبهر بواسطة المخزن المؤقت للتوقف. - كشط بلطف pAECs قبالة السطح الداخلي للأبهر باستخدام مكشطة الخلية (الشكل2I). اغسل الأبهر الكشط 3x مع مخزن الغسيل (5 مل في الوقت الواحد). وضع الحل من طبق الثقافة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. غسل الجزء السفلي من طبق الثقافة 2X مع العازلة الغسيل (5 مل في الوقت)، ووضع الحل في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مرة أخرى.
ملاحظة: كشط في اتجاه واحد بلطف ولا ضغط. لا تلمس الأنسجة بالقرب من الحواف والثقوب. يوصى بكشط 5-8x. - الطرد المركزي الأنبوب في 600 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. تخلص من الـ supernatant واترك 10 مل من الحل في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 50 مل. إضافة 20 مل من العازلة الغسيل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل، وإعادة تعليق الكريات. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة.
- الطرد المركزي في 600 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل ببطء supernatant. إعادة تعليق الكريات الخلية مع 1 مل من وسط الثقافة وتخلط جيدا.
ملاحظة: متوسط عدد الـ ECs لكل سم من الأبهر هو 1.9 × 105 ± 1.4 × 104 (متوسط ± SD، n = 3). - عد الخلايا مع عداد خلية. لوحة وثقافة الخلايا في وعاء دون طلاء أي مواد وفقا لرقم الخلية. إذا كان رقم الخلية أقل من أو يساوي 1.0 × 106، خلايا الثقافة في قارورة 25 سم2. إذا كان رقم الخلية أكبر من 1.0 × 106، خلايا الثقافة في عدة قوارير2 2 سم (1.0 × 106 خلايا لكل قارورة). ضع القارورة في حاضنة (دون اهتزاز) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% من ثاني أكسيد الكربون2 واستبدل الوسيط كل 2-3 أيام.
ملاحظة: تلف بعض الخلايا بواسطة مكشطة الخلية. ووجد اختبار صلاحية الخلية أن النسبة المئوية للخلايا الحية 95.7٪ ± 1.7٪ (متوسط ± SD، ن = 3). تبلغ مدة مضاعفة الخلايا المعزولة حوالي يوم أو يومين.
4. حصاد وتوصيف الخلايا البطانية النقية
- اترك الخلايا تنمو لمدة 4-5 أيام تقريبًا. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ (الشكل3A)،هضم الخلايا مع 0.25٪ التربسين ومرور الخلايا. ثم، جمع بعض الخلايا المعزولة (اليوم 3، الممر 1 والممر 2) وتحديد عن طريق قياس التدفق (مع الأجسام المضادة للCD31).
- تسمية pAECs معزولة (رقم الخلية: 1 × 105)(اليوم 3، الممر 1 والممر 2) مع المضادة للبورسيني CD31-fluorescein isothiocyanate (FITC) جسم مضاد مترافق (10 ميكرولتر الأجسام المضادة لكل 100 خلايا مئوية، ملطخة لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية) لتحليل تدفق قياس الخلايا.
- بوابة إجمالي السكان الخلية الحية مع مؤامرة متناثرة إلى الأمام، عينة غير ملطخة كسيطرة سلبية. ثم تقديم الخلايا الإيجابية CD31 من الخلايا المسورة مع الرسم البياني.
ملاحظة: فعالية الخلايا الإيجابية CD31 هي 97.4٪ ± 1.2٪ (اليوم 3)، 94.4٪ ± 1.1٪ (P1) و 92.4٪ ± 1.7٪ (P2) (متوسط ± SD)، على التوالي (الشكل3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تهدف طريقتنا إلى توفير طريقة فعالة لعزل الـ ECs عالية النقاء عن الأبهر من الخنازير المصغرة. تظهر عملية جراحة الأبهر في الشكل 1. الخطوة الأولى هي أن يتم استئصال الأبهر كله من الخنزير. منع تلوث الخلايا أو البكتيريا الأخرى مهم جداً. وبالتالي، لا تصيب الأعضاء أو الأنسجة الأخرى في حالة الخلايا غير المستهدفة أو البكتيريا تلوث الأبهر، وغسل الأبهر مع الغسيل قبل تبريد العازلة 3X (الشكل1B-D). خطوة حاسمة أخرى للحفاظ على صلاحية الخلية هي تقليل الفترة الزمنية بين الحصول على العينة الجراحية وإجراء العزل.
ويبين الشكل 2العمليات التي تنطوي عليها عملية تنقية الـ pAECs. طريقتنا مختلفة عن الآخرين منذ يتم ربط نهاية واحدة من الأبهر قبالة ويتعرض سطح بطانة الرحم (الشكل 2C-G). في وقت لاحق، يتم هضم سطح بطانة الأبهر بأكمله مع محلول الجهاز الهضمي الكولاجين قبل الاحماء (5-10 مل) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل (الشكل 2H). بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، يكون السطح البطانية أكثر تمامًا ، وبشكل تفضيلي ، يتعرض للحل الهضمي بسبب انعكاس الأبهر وغمره في محلول الجهاز الهضمي (بدون فقاعات). بعد توقف الهضم مع وقف العازلة ، يجب كشط سطح بطانة الأبهر بلطف في اتجاه واحد فقط مع مكشطة الخلية (الشكل 2I). اتجاه كشط مهم لتجنب الضرر الذي يلحق باللجان. لا تلمس الثقوب وقطع حواف الأبهر المهضوم.
بعد العزلة، يتم تفتيش ECs في الأيام 0 و 1 و 2، وبعد المرور 1 (P1) والممر 2 (P2) (الشكل 3A). يتم تعريف ECs المعزولة بواسطة قياس التدفق باستخدام جسم مضاد للقرص المضغوط 31-FITC. وقد أشار تحليل قياس التدفق إلى أن النسب المئوية للخلايا الإيجابية CD31 هي 97.4٪ ± 1.2٪ (اليوم 3)، 94.4٪ ± 1.1٪ (P1) و 92.4٪ ± 1.7٪ (P2) (متوسط ± SD)، على التوالي (الشكل 3B). وبالتالي، يمكن تحقيق عزلة البلدان الـ PAECs بنجاح من خلال هذا البروتوكول.
الشكل 1: الإجراء الجراحي واستئصال الأبهر من خنزير مصغر.
(أ) صورة خنزير مصغر (باما). (ب) يتعرض الأبهر بعد استئصال البطن واستئصال الصدر. (C) يتم تثبيت الأبهر في كل نهاية. (D) يتم وضع الأبهر في أنبوب 50 مل مع العازلة الغسيل الباردة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: هضم الأبهر البورسيني وعزل الـ pAECs.
(أ) يتم وضع الأبهر في طبق بيتري 150 مم مع عازل الغسيل البارد. (ب) صورة من الأبهر البورسيني بعد إزالة الأنسجة الضامة. (ج) شريط زجاجي مربوط بخياطة جراحية معقمة لتمرير من خلال الأبهر البورسيني. (د) يرتبط أحد طرفي الأبهر بخياطة جراحية معقمة، والتي يتم الاحتفاظ بها في داخل الأبهر. (E,F) يتم عكس الأبهر عن طريق سحب خياطة الجراحية. (ز) يتعرض السطح البطانية من الأبهر البورسيني. (ح) الأبهر المهضوم. (I) كشط السطح البطانية من الأبهر مع مكشطة الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد pAECs عالية النقاء عن طريق قياس التدفق مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد CD31.
(أ) صور تمثيلية لـ pAECs معزولة في الأيام 0 و 1 و 2، وبعد المقطع 1 والمقطع 2 (200x التكبير). (B) تحليل قياس التدفق للمركبات المضادة للبيانات (اليوم 3، الممر 1 و 2) مع الأجسام المضادة للCD31-FITC. يتم عرض البيانات الإحصائية في أسفل اليمين. البيانات هي ممثلة لثلاث تجارب مستقلة (يعني ± SD). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستخدم الخلايا البطانية عادة في البحوث من خلل الأوعية الدموية, مرض السكري, تجديد الأنسجة, زرع, والسرطانات14,15,16,17,18. لفهم وتوصيف البيولوجيا ووظيفة ECs في هذه الأمراض، تم الإبلاغ عن العديد من الطرق لعزل ECs من مختلف الأجهزة المريضة أو الأنسجة8،19،20، 21 , 22 , 23 , 24.في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت عدد متزايد من التقارير أن ECs porcine لها وظائف مختلفة في رفض المناعة والتخثر من xenotransplant6،25. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن عزل الخلايا البطانية الأبهرية عالية النقاء من الخنازير المصغرة بشكل أقل تواترا. هنا، ونحن نصف طريقة مستقرة وسهلة لعزل الخلايا البطانية الأبهرية من الخنازير مصغرة.
كولاجيناز يمكن أن تتحلل أنسجة مختلفة، ومتفوقة على التربسين أو غيرها من حلول الجهاز الهضمي26،27،28،29. استخدمنا 0.005٪ كولاجيناز الرابع لفصل pAECs من الأبهر الخنزير الصغيرة. الأهم من ذلك ، ينبغي تحسين تركيز الحل الهضمي لمختلف الخنازير. وقد استخدمت حلول الجهاز الهضمي Collagenase في 0.025٪، 0.05٪ و 0.2٪ على التوالي في الخنازير المختلفة، وفقا للعمر وتولد10،13،30. هنا، نوصي بالتركيز الأمثل للكولاجيناز الرابع ليكون 0.005٪، والوقت الأمثل للهضم ليكون 15 دقيقة. يجب ألا يكون الوقت <10 دقيقة أو >20 دقيقة، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة8،30. تركيز الكولاجين الرابع والوقت الهضمي أمر بالغ الأهمية للحصول على عالية النقاء وأعداد كبيرة من ECs. انخفاض تركيزات الكولاجين الرابع أو أقصر أوقات الجهاز الهضمي سيؤدي إلى عدد أقل من ECs. سوف تركيزات أعلى من الكولاجين الرابع أو أوقات الجهاز الهضمي أطول يؤدي إلى المزيد من التلوث الليفي.
تلف الخلايا والتلوث الليفي مشكلتين في عزل ة الـ pAECs. من أجل الحد من تلف الخلايا والتلوث الليفي، اعتمدنا طريقة تم فيها كشط ECs بلطف مع مكشطة الخلية. إن اتجاه الكشط وتواتره وكثافته أمر بالغ الأهمية لمنع تلف الخلايا والتلوث الليفي. أولا، قمنا بكشط السطح البطانية للأبهر في اتجاه واحد فقط. ثانيا، نوصي بأن يكون تردد كشط أقل من 10 مرات (5 إلى 8 مرات ينصح)، ويجب أن تكون كثافة لطيف. وأخيرا، لا ينبغي كشط المناطق المحيطة بثقوب الفروع الجانبية الشريانية وحواف قطع الشريان الأبهري (التي قد تؤدي إلى الخلايا الليفية والمزيد من الخلايا الضرر).
تركيز الكولاجين أعلى، وأطول وقت الهضم، وزيادة وتيرة وكثافة كشط قد تزيد من التلوث الليفي. قد تتفوق الخلايا الليفية بسرعة على الخلايا الإيجابية CD31، مما يقلل من نقاء ECs المعزول31. مقارنة مع البروتوكولات القائمة، على الرغم من أن البروتوكول قد تم تصميمه بعناية لمنع التلوث الليفي، والخلايا إيجابية CD31 في اليوم 3 وصلت إلى 97.4٪ ± 1.2٪ (يعني ± SD)، انخفضت النسبة المئوية للخلايا الإيجابية CD31 ببطء بعد الثقافة . إذا تم استخدام ECs معزولة لإجراء التجارب بعد 5 مقاطع، نقترح أن الخلايا يجب أن يتم فرزها مع تدفق خلية فارز10.
عادة، نحن لا نعزل الخلايا البطانية فحسب، ولكن أيضا الحصول على أعضاء أخرى لبحوث زرع الأكسينو، مثل البنكرياس والكلى. وفقا لتجربتنا، فإنه من الأفضل لعزل البنكرياس والرئة أولا، ومن ثم إجراء شراء الكبد والكلى. حتى بعد ذلك لم يفت الأوان لعزل القلب والأبهر ، إذا كان الجراح سريع ًا بما فيه الكفاية لإنهاء كل العزلة في أقل من نصف ساعة. خلال هذه العملية ، من الأهمية بمكان الحفاظ على المنطقة الجراحية معقمة وباردة. وقد سكب PBS الباردة مع المضادات الحيوية إلى الجهاز المستهدف لتنظيف التلوث المحتمل والحفاظ على الأنسجة في درجة حرارة منخفضة. ومن الضروري أيضا لمنع تخثر الدم عن طريق حقن الهيبارين بعد تخدير الحيوان. الجلطة في الأوعية الدموية الدقيقة من شأنها أن تحفز موت الخلايا والتهاب الأعضاء مع المزيد من الشعيرات الدموية، مثل البنكرياس والرئة والكبد. نحن دائما حقن الهيبارين إلى الوريد الأجوف السفلي وإدراج قسطرة إلى الشريان الأبهر البطني إلى الدم. وهذا من شأنه أن يمنع بشكل فعال موت الخلايا المرتبطة بالتخثر.
في الختام، نحن نقدم طريقة فعالة لعزل pAECs عالية النقاء من الخنازير مصغرة. الـ pAECs المعزولة مفيدة لبحوث زرع الأكسينو. على الرغم من أننا لم نعزل pAECs من خنزير كبير باستخدام البروتوكول، ونحن نعتقد أننا سوف تحصل على ECs عالية النقاء من خنزير كبير مع البروتوكول عن طريق تعديل بعض الخطوات الحرجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: 2016A030313028؛ مؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، منحة / جائزة رقم: B2018003؛ مؤسسة شنتشن للعلوم والتكنولوجيا، منحة / رقم الجائزة: JCYJ20180306172449376، JCYJ20180306172459580, JCJY20202920484975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 و JCYJ201604288142040404045; شنتشن لونغهوا منطقة مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، منحة / جائزة رقم: 2017013؛ البرنامج الوطني لمفاتيح R&D في الصين، منحة / جائزة رقم: 2017YFC1103704؛ مشروع سانمينغ للطب في شنتشن، منحة / جائزة رقم: SZSM201412020؛ صناديق خاصة لبناء مستشفيات عالية المستوى في مقاطعة قوانغدونغ (2019)؛ صندوق للانضباط الطبي العالي المستوى بناء شنتشن، منحة / جائزة رقم: 2016031638؛ مؤسسة شنتشن للصحة وتنظيم الأسرة لجنة، منحة / جائزة رقم: SZXJ2017021 وSZXJ2018059. نشكر هانتشنغ تشانغ وزيتشنغ زو من جامعة شنتشن على مساعدتهما فى اعداد المخطوطة .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
