Summary
Описан эффективный ферментативный метод изоляции первичных свиных аортальных эндотелиальных клеток (ПАЭК) от миниатюрных свиней. Изолированные первичные PAECs могут быть использованы для исследования иммунной и свертывания ответ в ксенотрансплантации.
Abstract
Ксенотрансплантация является перспективным способом решения проблемы нехватки органов человека для пациентов с отказом органов на конечной стадии, и свинья считается подходящим источником органов. Иммунный отторжение и коагуляция являются двумя основными препятствиями для успеха ксенотрансплантации. Сосудистые эндотелиальные клетки (EC) травмы и дисфункции имеют важное значение для развития воспаления и коагуляции реакции при ксенотрансплантации. Таким образом, изоляция свиных аортальных эндотелиальных клеток (ПАЭК) необходима для исследования иммунного отторжения и реакции свертывания. Здесь мы разработали простой ферментативный подход к изоляции, характеристике и расширению высокоочищенных ПАЭК от миниатюрных свиней. Сначала миниатюрную свинью обезглавили кетамин, и была вырезана длина аорты. Во-вторых, эндотелиальная поверхность аорты подвергалась воздействию 0,005% коллагеназы IV пищеварительного раствора в течение 15 мин. В-третьих, эндотелиальная поверхность аорты была выцарапана только в одном направлении с помощью клеточного скребока (lt;10 раз), и не была сжата в процессе процесса Соскабливания. Наконец, изолированные PAECs Дня 3, и после прохождения 1 и прохода 2, были определены поток цитометрии с анти-CD31 антитела. Проценты CD31-положительных клеток составили 97,4% и 1,2%, 94,4% и 1,1% и 92,4% и 1,7% (средний SD), соответственно. Концентрация коллагеназа IV, пищеварительное время, направление, частота и интенсивность соскабливания имеют решающее значение для уменьшения загрязнения фибробластов и получения высокой чистоты и большого количества ОР. В заключение, наш ферментативный метод является высоко-эффктивный метод для изоляции ЭК от миниатюрной аорты свиньи, и клетки могут быть расширены в пробирке для исследования иммунной и коагуляционной реакции в ксенотрансплантации.
Introduction
Нехватка доступных органов для трансплантации является нерешенной проблемой во всем мире1. По данным Общества Красного Креста Китая, в 2018 году лишь небольшое число пациентов с органной недостаточностью конечной стадии получили подходящий орган в Китае.
Ксенотрансплантация является многообещающим способом решения проблемы нехватки органов. Свиньи органы считаются наиболее подходящими органами для человека из-за анатомических и физиологических сходств2,3. Отказ свиньи ксенотрансплантат в значительной степени связано с приматов иммунного отторжения и свертывания ответов. Свиные эндотелиальные клетки (ECs) имеют решающее значение, поскольку эти клетки являются первыми, чтобы взаимодействовать с иммунной системой приматов, которая включает в себя антитела, дополнение, цитокины, и иммунные клетки (например, Т-клетки, В-клетки, и макрофаги)4,5. Сочные eCs играют жизненно важную роль в орган евеноии и ксенотрансплантации газотечного6,7. Таким образом, ECs являются важными клетками для исследования отторжения и свертывания ответов на свиней трансплантата. Для исследования ксенотрансплантации требуется изоляция высококачественных свиных ЭК.
В попытках изолировать ЭК от различных органов (например, сердца, почек, печени и аорты), несколько протоколов были зарегистрированы в ксенотрансплантациипара8,9,10,11,12. Тем не менее, сохранение ультрачистой культуры изолированных ECs является нерешенной проблемой в стандартных протоколах. Повышенная концентрация переваренных растворов, ненадлежащее время пищеварения и интенсивность скобликов могут способствовать увеличению загрязнения фибробластом в текущих исследованиях8,10,13. Кроме того, менее изучен метод изолированных ПАЭК из миниатюрных свиней. Здесь мы описываем оптимизированный ферментативный метод изоляции высокоочищенных ПАЭК от миниатюрных свиней (Вугишань или Бама). Несколько этапов протокола были разработаны для уменьшения загрязнения фибробластов и получения высокой чистоты ECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных было одобрено Комитетом по этике Второй народной больницы Шэньчжэня в соответствии с принципами защиты животных.
1. Подготовка животных, средних и буферов
- Приготовьте миниатюрную свинью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все миниатюрные свиньи были китайские свиньи Wuzhishan или Bama (мужчины). Возраст и вес свиней составляли 100 дней, 8 дней и 5,7 кг и 1,0 кг (средний возраст, n - 3), соответственно. - Подготовка среды культуры: эндотелиальная клеточная среда (ECM) дополнена 10% (v/v) теплоинактивированной сывороткой крупного рогатого скота (FBS), 1% (v/v) пенициллин/стрептомицин (P/S) и 1% (v/v) эндотелиальная добавка для роста клеток (ECGS).
- Подготовьте стиральный буфер: 1x раствор PBS (pH 7.4) с 1% (v/v) P/S.
- Приготовьте 0,005% коллагеназа IV пищеварительного раствора: 1 мг порошка коллагеназа IV в 20 мл раствора PBS. Предварительно разогреть коллагенеза пищеварительного раствора при 37 градусах Цельсия до пищеварения.
- Подготовка остановочный буфер: модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM) дополнена 10% теплоинактивированным FBS и 1% P/S.
2. Хирургия и подготовка к свиной аортальной эндотелиальной изоляции клеток
- Дезинфекция операционной с помощью УФ-излучения на 1 ч и медицинского дезинфицирующего средства 84 жидкости (доступное содержание хлора составляет 4,0% - 5,0%, Таблица материалов) перед проведением операции.
- После того, как миниатюрная свинья получила внутримышечную инъекцию, образованную 15 мг/кг кетамина, 15 мг/кг гидрохлорида ксилазина и 0,05 мг/кг гидрохлорида фенацетина (объемы: 100 л/кг, Таблица материалов) (Рисунок 1A), подтверждают состояние анестезии с проверкой свина болезненный стимул (например, щипать одно ухо или тряски одного переднего конечности) и физиологический индекс (например, кровяное давление, сердце и дыхательные пути).
ПРИМЕЧАНИЕ: Еще половина дозы инъекции могут быть даны свиньи, если он показывает признаки пробуждения. - Вырезать живот скальпелем, разоблачить нижней полы вены и, следовательно, ввести гепарин натрия (5000 U, Таблица материалов) в нижней полы вены с 5 мл шприца.
- Через пять минут вставьте катетер в брюшную аорту в кровь, разрежьте кожу грудной клетки и разрезайте диафрагму скальпелем, а затем отрежьте левый желудочек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свинья усыпчатой, проверяя аортального импульса после кровопролития и резки сердца. - Акциз ребер с костными щипками (Таблица материалов), и подвергать сердца и легких. Найти аорты задний к сердцу и легким и зажим двух концах. Вымойте аорту один раз с предварительно охлажденный буфер стирки(Рисунок 1B, C).
- Вырежьте аорту ножницами и держите аорту зажатой на каждом конце. Акциз избытка ткани вокруг аорты со стерильными щипцы и ножницы. Положите аорту в 50 мл центрифуги трубки, мыть аорту с предварительно охлажденный буфер стирки 3x (30 мл на стирку), и передать аорту в лабораторию(рисунок 1D).
3. Изоляция свиных аортальных эндотелиальных клеток
- В асептических условиях, удалить свинью аорты из стирального буфера, и поместите его на 150 мм Петри блюдо(рисунок 2A).
- Аккуратно отрежьте два конца аорты и акцизные излишки ткани вокруг аорты с стерильными щипками и ножницами снова(рисунок 2B). Вымойте снаружи и внутри аорты (над культурой блюдо при комнатной температуре) с 20'50 мл стирального буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Попробуйте только сократить области, где зажимы были размещены во время операции, поскольку некоторые ЭК были повреждены в этой области, и удалить избыток тканей и артериальных боковых ветвей. - Пройдите хирургический шов через аорту, а затем связать один конец аорты с помощью хирургического шва (5-0, 90см, Таблица материалов). Держите хирургический шов внутри аорты(рисунок 2C,D).
- Аккуратно исправить аорты вблизи связали конца с щипками, а затем потяните хирургический шов медленно, чтобы обратить вспять аорты, пока эндотелиальная поверхность аорты подвергается (Рисунок 2E-G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исправить аорты вблизи связали конца и не исправить аорты плотно, иначе аорта не может быть отменена, потянув хирургический шов. - Вымойте эндотелиальную поверхность аорты с помощью стирального буфера 3x (10 мл на стирку), а затем отбросьте это решение. Поместите аорту в 15 мл центрифуги трубки, и покрыть аорты с 10 мл 0,005% коллагеназа IV пищеварительного раствора в трубке (Рисунок 2H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно разогреть 0,005% коллагеназа IV пищеварительный раствор на 37 градусов по Цельсию до пищеварения. - Инкубировать при 37 градусах По цельсии в течение 15 мин. Поместите переваренный аорту и пищеварительный раствор в тарелку культуры 100 мм и остановите эффект ы0,005% коллагеназе IV, добавив 10-15 мл предварительно охлажденных остановочных буферов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое время пищеварения составляет от 10 до 20 минут. Убедитесь, что эндотелиальная поверхность аорты покрыта остановочным буфером. - Аккуратно соскребайте pAECs от внутренней поверхности аорты с помощью клеточного скребок(рисунок 2I). Вымойте Царапины аорты 3x с мытья буфера (5 мл за время). Положите раствор из блюда культуры в 50 мл центрифуги трубки. Вымойте дно культуры блюдо 2x с мытья буфера (5 мл за время), и положить раствор в 50 мл центрифуги трубки снова.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите в одном направлении осторожно и не сжимать. Не прикасайтесь к ткани вблизи краев и отверстий. Рекомендуется соскребка 5х8x. - Центрифуга трубки на 600 х г в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант и оставьте 10 мл раствора на дне центрифуги 50 мл. Добавьте 20 мл стирального буфера в 50 мл центрифуги трубки, и resuspend гранулы. Избегайте пузырьков во время этого шага.
- Центрифуга при 600 х г в течение 6 мин при 4 градусах По цельсию. Медленно отбросьте супернатант. Отрежь клеточные гранулы с 1 мл культуры среды и хорошо перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное среднее количество ЭК на см аорты составляет 1,9 х 105 и 1,4 х 104 (среднее значение SD, n no 3). - Подсчитайте клетки с помощью клеточного счетчика. Плита и культуры клеток в сосуде без покрытия каких-либо материалов в соответствии с номером ячейки. Если число клеток меньше или равно 1,0х 10 6, культурные клетки в 25 см2 колбы. Если число клеток больше 1,0х 10 6, культурные клетки в нескольких 25 см2 колбы (1,0 х 106 клеток на колбу). Поместите колбу в инкубатор (без встряхивания) при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 и замените среду каждые 2–3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клетки повреждены скребком клеток. В результате асссы жизнеспособности клеток было установлено, что процент живых клеток составляет 95,7% и 1,7% (средний показатель SD, n no 3). Время удвоения изолированных клеток составляет около 1–2 дней.
4. Урожай и характеристика чистых эндотелиальных клеток
- Оставьте клетки растут в течение 4-5 дней. Когда клетки достигают 80% слияния(Рисунок 3A), переварить клетки с 0,25% трипсин и прохождения клеток. Затем соберите некоторые изолированные клетки (День 3, Проход 1 и Пассаж 2) и определите по потоку цитометрию (с анти-CD31 антитела).
- Этикетка изолированных pAECs (клеточный номер: 1 х 105) (День 3, Проход 1 и Проход 2) с анти-свиной CD31-флуоресцеин изотоцианат (FITC) конъюгированные антитела (10 л антитела на 100 клеток QL, окрашенные в течение 30 минут при 4 c) для анализа цитома потока.
- Ворота общей живой ячейки населения с вперед рассеянный участок, неокрашенные образца в качестве отрицательного контроля. Затем представить CD31 положительные клетки закрытых клеток с гистограммой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность CD31-положительных клеток составляет 97,4% и 1,2% (День 3), 94,4% и 1,1% (P1) и 92,4% (P2) (средний SD), соответственно(рисунок 3B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наш метод направлен на обеспечение эффективного способа изолировать высокоочищенные ОР От аорты от миниатюрных свиней. Процесс операции аорты показан на рисунке 1. Первый шаг заключается в том, что вся аорта вырезана из свиньи. Предотвращение других клеток или бактериального загрязнения очень важно. Таким образом, не травмировать другие органы или ткани в случае, если нецелевые клетки или бактерии загрязняют аорту, и мыть аорту с предварительно охлажденный буфер стирки 3x (Рисунок 1B-D). Другим важным шагом для поддержания жизнеспособности клеток является свести к минимуму период времени между получением хирургического образца и процедурой изоляции.
Процессы, связанные с очисткой ПАЭК, показаны на рисунке 2. Наш метод отличается от других, так как один конец аорты связан и эндотелиальная поверхность подвергается (рисунок 2C-G). Впоследствии эндотелиальная поверхность всей аорты переваривается предварительно разогретым коллагенеза пищеварительным раствором (5-10 мл) в 15 мл центрифуги (рисунок 2H). По сравнению с другими методами, эндотелиальная поверхность более полно, и преимущественно, подвергаются пищеварительного раствора из-за инверсии аорты и погружения в пищеварительный раствор (без пузырьков). После того, как пищеварение останавливается с остановкой буфера, эндотелиальная поверхность аорты должна быть аккуратно Царапины только в одном направлении с клеткой скребок (рисунок 2I). Направление соскабливания важно, чтобы избежать повреждения eCs. Не прикасайтесь к отверстиям и вырезать края переваренной аорты.
После изоляции, ECs проверяются на дни 0, 1 и 2, и после прохождения 1 (P1) и проход 2 (P2) (рисунок 3A). Изолированные ЭК идентифицируются цитометрией потока с помощью анти-CD31-FITC антитела. Анализ цитометрии потока показал, что проценты CD31-положительных клеток составляют 97,4% и 1,2% (Day3), 94,4% и 1,1% (P1) и 92,4% и 1,7% (P2) (средний SD), соответственно (рисунок 3B). Таким образом, изоляция PAECs может быть успешно достигнуто с помощью этого протокола.
Рисунок 1: Хирургическая процедура и иссечение аорты от миниатюрной свиньи.
(A) Фотография миниатюрной свиньи (Бама). (B) Аорта подвергается после лапаротомии и торакотомии. (C) Аорта зажимается на каждом конце. (D) Аорта помещается в трубку 50 мл с холодным буфером стирки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Свиная аорта пищеварения и pAECs изоляции.
(A) Аорта помещается в 150 мм Петри блюдо с холодным буфером стирки. (B) Фотография свиной аорты после удаления соединительной ткани. (C) Стеклянная слитка связана с стерильной хирургической швы, чтобы пройти через свиную аорту. (D) Один конец аорты связан стерильным хирургическим швом, который хранится на внутренней стороне аорты. (E,F) Аорта меняется, потянув хирургический шов. (G) Эндотелиальная поверхность свиной аорты подвергается. (H) Переваренный аорты. (Я) Соскребая эндотелиальную поверхность аорты с помощью клеточного скребока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Идентификация высокоочищенных PAECs по цитометрии потока с анти-CD31 моноклонального антитела.
(A) Представитель изображения изолированных PAECs на дни 0, 1 и 2, и после прохода 1 и прохода 2 (200x увеличение). (B) Анализ цитометрии потока pAECs (День 3, проход 1 и 2) с антителами anti-CD31-FITC. Статистические данные представлены в правом нижнем углу. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов (средний и SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эндотелиальные клетки широко используются в исследованиях сосудистой дисфункции, диабета, регенерации тканей, трансплантации, и рака14,15,16,17,18. Чтобы понять и охарактеризовать биологии и функции ECs в этих заболеваниях, многочисленные методы, чтобы изолировать ECs различных больных органов или тканей были зарегистрированы8,19,20, 21 год , 22 Г. , 23 , 24. В последнее время все большее число докладов показали, что свиные ECs имеют различные функции в иммунном отторжении и свертывания ксенотрансплантации6,25. Однако об изоляции высокоочищенных эндотелиальных клеток аорты от миниатюрных свиней сообщалось реже. Здесь мы описываем стабильный и простой метод изоляции эндотелиальных клеток аорты от миниатюрных свиней.
Коллагенеза может деградировать различные ткани, и превосходит трипсин или другие пищеварительные решения26,27,28,29. Мы использовали 0,005% коллагеназа IV, чтобы отделить PAECs от небольшой аорты свиньи. Важно отметить, что концентрация пищеварительного раствора должна быть оптимизирована для разных свиней. Коллагенеза пищеварительные растворы на 0,025%, 0,05% и 0,2% были использованы соответственно в различных свиней, в зависимости от возраста и породы10,13,30. Здесь мы рекомендуем оптимальную концентрацию коллагеназа IV составить 0,005%, а оптимальное время пищеварения - 15 мин. Время не должно быть lt;10 мин или йgt;20 мин, что согласуется с предыдущими исследованиями8,30. Концентрация коллагеназа IV и пищеварительное время имеют решающее значение для получения высокой чистоты и большого количества ОР. Более низкие концентрации коллагеназа IV или короче пищеварительные раз приведет к меньшему количеству ECs. Более высокие концентрации коллагеназа IV или больше времени пищеварительной приведет к более фибробластов загрязнения.
Повреждение клеток и загрязнение фибробластом являются двумя проблемами в изоляции PAECs. Для того, чтобы уменьшить повреждение клеток и загрязнения фибробластов, мы приняли метод, в котором ECs были Царапины мягко с помощью клеточного скребок. Направление, частота и интенсивность выскабливания имеют решающее значение для предотвращения повреждения клеток и загрязнения фибробластом. Во-первых, мы Царапины эндотелиальной поверхности аорты в одном направлении только. Во-вторых, мы рекомендуем, чтобы частота выскабливания была меньше, чем 10 раз (5 до 8 раз рекомендуется), и интенсивность должна быть мягкой. Наконец, не следует выцарапать области, окружающие отверстия артериальных боковых ветвей и разрезанные края аорты (которые могут привести к клеткам фибробластов и большему ущербу).
Более высокая концентрация коллагеназа, больше времени пищеварения, и увеличение частоты и интенсивности соскабливания может увеличить загрязнение фибробластов. Фибробласты могут быстро перерасти CD31-положительные клетки, тем самым уменьшая чистоту изолированных ECs31. По сравнению с существующими протоколами, хотя протокол был тщательно разработан для предотвращения загрязнения фибробластом, а CD31-положительные клетки на 3-й день достигли 97,4% и 1,2% (средний sD), процент CD31 положительных клеток медленно уменьшался после культуры . Если изолированные ОР используются для проведения экспериментов после 5 проходов, мы предлагаем, чтобы клетки должны быть отсортированы с сортировкой цитометрии потока10.
Как правило, мы не только изолировать эндотелиальные клетки, но и получить другие органы для исследования ксенотрансплантации, таких как поджелудочная железа и почки. По нашему опыту, лучше сначала изолировать поджелудочную железу и легкие, а затем выполнить закупку печени и почек. Даже после этого еще не поздно изолировать сердце и аорту, если хирург достаточно быстр, чтобы закончить всю изоляцию менее чем за полчаса. Во время процесса очень важно сохранить хирургическую область стерильной и холодной. Холодный PBS с антибиотиками был налил в целевой орган, чтобы очистить возможное загрязнение и держать ткани в низкой температуре. Также необходимо предотвратить коагуляцию путем введения гепарина после анестезии животного. Сгусток в микрососудистом сосуде вызовет гибель клеток и воспаление органов с большим количеством капилляров, таких как поджелудочная железа, легкие и печень. Мы всегда вводим гепарин в нижнюю полу вены и вставляем катетер в брюшную аорту в кровь. Это позволит эффективно предотвратить свертывание связанных клеточной смерти.
В заключение мы предоставляем эффективный метод изоляции высокоочищенных ПАЭК от миниатюрных свиней. Изолированные PAECs полезны для исследований ксенотрансплантации. Хотя мы не изолировали pAECs от большой свиньи с помощью протокола, мы считаем, что мы получим высоко очищенные ОР от большой свиньи с протоколом путем изменения некоторых критических шагов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Гуандун, Грант/Наградный номер: 2016A03033028; Медицинский научно-исследовательский фонд провинции Гуандун, Грант/Наградный номер: B2018003; Шэньчжэньский фонд науки и техники, Грант/Наградный номер: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY201602220449975, GJH-20170314171135756, JCYJ201604251030001 1 и JCYJ20164 Фонд науки и техники округа Шэньчжэнь Лонгхуа, номер гранта/премии: 2017013; Национальная программа по НИОКР Китая, Грант/Номер премии: 2017YFC103704; Проект Sanming медицины в Шэньчжэне, Грант/Наградный номер: S'SM201412020; специальные средства на строительство больниц высокого уровня в провинции Гуандун (2019 год); Фонд для строительства медицинской дисциплины высокого уровня Шэньчжэнь, Грант/Наградный номер: 2016031638; Шэньчжэнь фонд здравоохранения и планирования семьи комиссии, Грант / Награда Номер: S'XJ2017021 и S'XJ2018059. Мы благодарим Ханчэн Чжан и Чжичэн Цзоу из Шэньчжэньского университета за помощь в подготовке рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
