Summary
En effektiv enzymatisk metod för isolering av primära svin aorta endotelceller (pAECs) från miniatyr grisar beskrivs. De isolerade primära pAECs kan användas för att undersöka immun-och koagulations reaktionen vid xenotransplantation.
Abstract
Xenotransplantation är ett lovande sätt att lösa bristen på mänskliga organ för patienter med slutstadiet organsvikt, och grisen betraktas som en lämplig organ källa. Immun avvisande och koagulering är två stora hinder för en lyckad xenotransplantation. Vaskulär endotelcell (EG) skada och dysfunktion är viktiga för utvecklingen av inflammation och koagulation svar i xenotransplantation. Sålunda, isolering av svin aorta endotelceller (paecs) är nödvändig för att undersöka immun avvisande och koagulation svar. Här har vi utvecklat en enkel enzymatisk metod för isolering, karakterisering och utbyggnad av höggradigt renade pAECs från minigrisar. Först var miniatyr gris bedövas med ketamin, och en längd av aorta var excised. För det andra, den endoteliala ytan av aorta utsattes för 0,005% kollagenase IV matsmältnings lösning för 15 min. för det tredje, den endoteliala ytan av aorta skrapades i endast en riktning med en cell skrapa (< 10 gånger), och var inte komprimeras under processen för Skrapa. Slutligen identifierades de isolerade pAECs av dag 3, och efter passage 1 och passage 2, av flödescytometri med en anti-CD31 antikropp. Andelen CD31-positiva celler var 97,4% ± 1,2%, 94,4% ± 1,1%, och 92,4% ± 1,7% (medelvärde ± SD), respektive. Koncentrationen av kollagenas IV, matsmältnings tiden, riktningen, och frekvens och intensitet av skrapning är avgörande för att minska fibroblast förorening och få hög renhet och ett stort antal ECs. Sammanfattningsvis är vår enzymatiska metod en mycket effktiv metod för att isolera ECs från miniatyr svinaorta, och cellerna kan utökas in vitro för att undersöka immun-och koagulations svaren i xenotransplantation.
Introduction
Bristen av tillgängliga organ för transplantation är ett utstående problem World-Wide1. Enligt röda korset i Kina, fick endast ett litet antal patienter med slutstadiet organsvikt ett lämpligt organ i Kina 2018.
Xenotransplantation är ett lovande sätt att lösa problemet med organbrist. Gris organ anses vara de lämpligaste organen för människor på grund av anatomiska och fysiologisk likheter2,3. Misslyckandet med en gris xenograft är till stor del relaterad till primater immun avvisande och koagulation svar. Porcin endotelceller (ECs) är kritiska eftersom dessa celler är de första att interagera med primat immunsystemet, som inkluderar antikropp, komplement, cytokiner, och immunceller (t. ex., t-celler, B-celler, och makrofager)4,5. Svin ECs spelar en viktig roll i gris-orgel och Holmen xenotransplantation6,7. Därför är ECs viktiga celler för att undersöka avstötning och koagulering svar på en gris transplantat. För xenotransplantations forskning krävs isolering av högkvalitativa svin.
I försök att isolera ECs från olika organ (t. ex. hjärta, njure, lever och aorta) har flera protokoll rapporterats i en xenotransplantationinställning8,9,10,11,12. Men att hålla en ultrarent kultur av isolerade ECs är ett enastående problem i standardprotokoll. Den ökade koncentrationen av den smälta lösningen, olämplig digestionstid och skrapintensitet kan bidra till ökad fibroblastkontamination i aktuella studier8,10,13. Dessutom undersöks metoden med isolerade pAECs från minigrisar. Här beskriver vi en optimerad enzymatisk metod för att isolera högrenade pAECs från miniatyr grisar (Wuzhishan eller Bama). Flera steg i protokollet har utformats för att minska fibroblastkontaminering och få hög renhet ECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av djur godkändes av etik prövnings kommittén i Shenzhen Second People ' s Hospital, i enlighet med principerna för djurens välbefinnande.
1. beredning av djur, medium och buffertar
- Förbered miniatyr gris.
Obs: alla miniatyr grisar var kinesiska Wuzhishan eller Bama svin (hane). Svinens ålder och vikt var 100 dagar ± 8 dagar och 5,7 kg ± 1,0 kg (medelvärde ± SD, n = 3). - Förbered odlingsmediet: endotelcellmedium (ECM) kompletterat med 10% (v/v) värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 1% (v/v) penicillin/streptomycin (P/S) och 1% (v/v) endotelial celltillväxt tillägg (EKG).
- Förbered tvättbufferten: 1x PBS-lösning (pH 7,4) med 1% (v/v) P/S.
- Bered en 0,005% kollagenase IV matsmältnings lösning: 1 mg kollagenase IV pulver i 20 mL PBS-lösning. Förvärm kollagenase matsmältnings lösning vid 37 ° c före matsmältningen.
- Förbered stoppbufferten: Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medium (DMEM) kompletterat med 10% Värmeinaktiverade FBS och 1% P/S.
2. kirurgi och förberedelse för porcin aorta endotelcell isolering
- Desinficering operationssalen med UV-ljus för 1 h och medicinskt desinfektionsmedel 84 vätska (tillgänglig klorhalt är 4,0%-5,0%, tabell över material) innan du utför kirurgi.
- Efter miniatyr gris fått en intramuskulär injektion som bildas av 15 mg/kg ketamin, 15 mg/kg Xylazine hydroklorid och 0,05 mg/kg fenacetin hydroklorid (volymer: 100μL/kg, tabell över material) (figur 1a), bekräfta djurets anestesi status med kontroll svin smärtsam stimulans (t. ex. klämmande ena örat eller skakar en forelimb) och fysiologiska index (t. ex. blodtryck, hjärta och andningsfrekvens).
En annan halv dos injektion kan ges till grisen om den visar tecken på att vakna upp. - Skär buken med en skalpell, exponera sämre Vena Cava och därmed injicera heparin natrium (5 000 U, tabell över material) i sämre Vena Cava med 5 ml spruta.
- Fem minuter senare, sätt en kateter till bukaorta till blod, klippa huden på bröstet och incisionsfilm membranet med en skalpell och därefter skära vänster kammare av.
Obs: se till att gris är euthanized genom att kontrollera aorta puls efter blooding och skära hjärtat. - Punktskatter revbenen med benpinps (tabell över material), och utsätta hjärtat och lungorna. Hitta aorta posteriort om hjärtat och lungorna och klämma de två ändarna. Tvätta aorta en gång med förkyld tvättbuffert (figur 1B, C).
- Klipp ut aorta med sax och hålla aorta fastspänd i varje ände. Accis överskott vävnad runt aorta med sterila pinps och sax. Sätt aorta i en 50 mL Centrifugera röret, tvätta aorta med förkyld tvätt buffert 3x (30 mL per tvätt), och överföra aorta till laboratoriet (figur 1d).
3. isolering av svin aorta endotelceller
- Under aseptiska förhållanden, ta bort svinaorta från tvättbuffert, och placera den på en 150 mm petriskål (figur 2A).
- Försiktigt skära av de två ändarna av aorta och punktskatter överskott vävnad runt aorta med sterila pinvett och sax igen (figur 2b). Tvätta utsidan och insidan av aorta (över kultur skålen vid rumstemperatur) med 20 − 50 mL tvättbuffert.
Anmärkning: försök att bara klippa området där klämmorna placerades under operationen eftersom vissa ECs skadades i detta område, och ta bort överskott vävnader och arteriella sidan grenar. - Passera en kirurgisk sutur genom aorta och sedan binda ena änden av aorta med hjälp av kirurgisk suturen (5-0, 90cm, tabell över material). Förvara den kirurgiska suturen på insidan av aorta (figur 2C,D).
- Försiktigt fixa aorta nära den bundna änden med tång, och sedan dra den kirurgiska suturen långsamt att vända aorta tills endoteliala ytan av aorta exponeras (figur 2E-G).
Obs: se till att fixa aorta nära den bundna änden och inte fixa aorta tätt, annars aorta kan inte vändas genom att dra den kirurgiska suturen. - Tvätta endoteliala ytan av aorta med tvättbuffert 3x (10 mL per tvätt), och sedan kassera denna lösning. Placera aorta i en 15 mL Centrifugera röret, och täck aorta med 10 mL 0,005% kollagenase IV matsmältningssystemet i röret (figur 2H).
Anmärkning: förvärma 0,005% kollagenase IV matsmältningssystemet vid 37 ° c före matsmältningen. - Inkubera vid 37 ° c i 15 min. Placera den smälta aorta-och matsmältnings lösningen i en 100 mm kultur rätt och stoppa effekterna av 0,005% kollagenase IV genom att tillsätta 10 − 15 mL förkyld stoppbuffert.
Obs: den rekommenderade digestionstiden är mellan 10 och 20 minuter. Se till att endoteliala ytan av aorta täcks av stoppbufferten. - Försiktigt skrapa pAECs från insidan av aorta med hjälp av en cell skrapa (figur 2I). Tvätta den skrapade aorta 3x med tvättbuffert (5 mL per gång). Sätt lösningen från kultur skålen i ett 50 mL centrifugertub. Tvätta botten av kulturen skålen 2x med tvättbuffert (5 mL per gång), och sätta lösningen i en 50 mL Centrifugera röret igen.
Anmärkning: skrapa i en riktning försiktigt och inte komprimera. Vidrör inte vävnaden nära kanterna och hålen. Skrapning 5 − 8x rekommenderas. - Centrifugera röret med 600 x g i 6 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och lämna 10 mL lösning i botten av ett 50 mL centrifugerör. Tillsätt 20 mL tvättbuffert till 50 mL centrifugertub och Omsuspendera pelleten. Undvik bubblor under detta steg.
- Centrifugera vid 600 x g i 6 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten långsamt. Omsuspendera cell pellets med 1 mL odlingssubstrat och blanda väl.
Anmärkning: det erhållna genomsnittliga antalet ECs per cm aorta är 1,9 x 105 ± 1,4 x 104 (medelvärde ± SD, n = 3). - Räkna cellerna med en cell räknare. Tallrik och odla cellerna i ett kärl utan att belägga något material enligt cellnumret. Om cellnumret är mindre än eller lika med 1,0 x 106, kultur celler i en 25 cm2 kolv. Om cellnumret är större än 1,0 x 106, kultur celler i flera 25 cm2 kolvar (1,0 x 106 celler per kolv). Placera kolven i en inkubator (utan skakning) vid 37 ° c med 5% CO2 och Byt ut mediet var 2 − 3 dagar.
Obs: vissa celler skadas av cell skrapan. En cell lönsamhetsanalys fann att andelen levande celler var 95,7% ± 1,7% (medelvärde ± SD, n = 3). Fördubblings tiden för de isolerade cellerna är ca 1 − 2 dagar.
4. skörd och karakterisering av rena endotelceller
- Låt cellerna växa i ca 4 − 5 dagar. När cellerna når 80% sammanflödet (figur 3a), smälta cellerna med 0,25% trypsin och passage cellerna. Sedan, samla in några av de isolerade cellerna (dag 3, passage 1 och passage 2) och identifiera genom flödescytometri (med en anti-CD31 antikropp).
- Etikett isolerade pAECs (cell nummer: 1 x 105) (dag 3, passage 1 och passage 2) med anti-PORCIN CD31-fluorescein isotiocyanat (FITC) konjugerad antikropp (10 μl antikropp för per 100 μl celler, färgas i 30 min vid 4 ° c) för flödescytometri analys.
- Gate total levande cellpopulation med en framåt spridda tomt, obefläckade prov som en negativ kontroll. Sedan presentera de CD31 positiva cellerna i de gated cellerna med histogram.
Anmärkning: effekten av CD31-positiva celler är 97,4% ± 1,2% (dag 3), 94,4% ± 1,1% (P1) och 92,4% ± 1,7% (P2) (medelvärde ± SD), respektive (figur 3b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår metod syftar till att ge ett effektivt sätt att isolera högrenade ECs från artärer från miniatyr grisar. Processen för aorta kirurgi visas i figur 1. Det första steget är att hela aorta är censurerade från grisen. Att förhindra annan cell-eller bakterieförorening är mycket viktigt. Således, inte skadar andra organ eller vävnader i fall oriktade celler eller bakterier förorenat aorta, och tvätta aorta med förkyld tvätt buffert 3x (figur 1B-D). Ett annat kritiskt steg för att bibehålla cellernas lönsamhet är att minimera tidsperioden mellan att få det kirurgiska provet och isolerings proceduren.
De processer som ingår i rening av pAECs visas i figur 2. Vår metod skiljer sig från andra eftersom ena änden av aorta är bunden och endotelytan exponeras (figur 2C-G). Därefter, den endoteliala ytan av hela aorta bryts ned med förvärmda kollagenase matsmältningssystemet (5-10 mL) i en 15 mL centrifug röret (figur 2H). Jämfört med andra metoder, den endoteliala ytan är mer fullständigt, och företrädesvis, utsätts för matsmältningssystemet på grund av inversion av aorta och nedsänkning i matsmältningssystemet (utan bubblor). Efter uppslutning stoppas med stoppbuffert, den endoteliala ytan av aorta måste försiktigt skrapas i endast en riktning med en cell skrapa (figur 2i). Riktningen för skrapning är viktigt för att undvika skador på ECs. Vidrör inte hålen och skär kanterna av smält aorta.
Efter isolering kontrolleras ECs på dag 0, 1 och 2, och efter passage 1 (P1) och passage 2 (P2) (figur 3a). Isolerade ECs identifieras med flödescytometri med en anti-CD31-FITC-antikropp. Flödescytometrianalys har visat att andelen CD31-positiva celler är 97,4% ± 1,2% (Day3), 94,4% ± 1,1% (P1) och 92,4% ± 1,7% (P2) (medelvärde ± SD), respektive (figur 3b). Därför kan isoleringen av pAECs framgångsrikt åstadkommas med detta protokoll.
Figur 1: det kirurgiska ingreppet och excision av aorta från en miniatyr gris.
A) fotografi av en miniatyr gris (Bama). Baorta exponeras efter laparotomi och torakotomi. (C) aorta är fastspänd i vardera änden. (D) aorta är placerad i en 50 ml tub med kall tvättbuffert. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: aortanedbrytning och pAECs-isolering.
(A) aorta placeras i en 150 mm petriskål med kall tvättbuffert. (B) fotografi av svin aorta efter avlägsnande av bindväv. (C) glaset bar bunden med en steril kirurgisk sutur att passera genom svin aorta. (D) ena änden av aorta binds med en steril kirurgisk sutur, som hålls på insidan av aorta. (E, F) Aorta är omvänd genom att dra den kirurgiska suturen. Gden endoteliala ytan av svin aorta exponeras. H) den rötas aorta. I) skrapning av endotelytan på aorta med en cell skrapa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: identifiering av högrenade pAECs med flödescytometri med en anti-CD31 monoklonal antikropp.
Arepresentativa bilder av isolerade paecs på dag 0, 1 och 2 samt efter passage 1 och passage 2 (200x förstoring). B) flödescytometrianalys av paecs (dag 3, passage 1 och 2) med anti-CD31-FITC-antikropp. Statistiska uppgifter presenteras längst ner till höger. Data är representativa för tre oberoende experiment (medelvärde ± SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotelceller används ofta i forskning av vaskulär dysfunktion, diabetes, vävnadsregenerering, transplantation, och cancer14,15,16,17,18. För att förstå och karakterisera ECS biologi och funktion i dessa sjukdomar har många metoder för att isolera ECS av olika sjuka organ eller vävnader rapporterats8,19,20, 21 , 22 , 23 , 24. på senare tid har ett ökande antal rapporter visat att porcin ECs har olika funktioner i immun avvisande och koagulering av xenotransplantation6,25. Emellertid, isoleringen av högrenade aorta endotelceller från miniatyr svin har rapporterats mindre ofta. Här beskriver vi en stabil och enkel metod för isolering av aorta endotelceller från miniatyr grisar.
Kollagenase kan försämra olika vävnader, och är överlägsen trypsin eller andra matsmältnings lösningar26,27,28,29. Vi använde 0,005% kollagenas från IV att separera paecs från en liten gris aorta. Viktigt, koncentrationen av matsmältningssystemet bör optimeras för olika svin. Kollagenase matsmältnings lösningar på 0,025%, 0,05% och 0,2% har använts i olika svin, beroende på ålder och ras10,13,30. Här, vi rekommenderar den optimala koncentrationen av kollagenase IV att vara 0,005%, och den optimala matsmältnings tid att vara 15 min. Tiden bör inte vara < 10 min eller > 20 min, vilket är förenligt med tidigare studier8,30. Koncentrationen av kollagenase IV och matsmältnings tiden är avgörande för att erhålla hög renhet och ett stort antal ECs. Lägre koncentrationer av kollagenas IV eller kortare matsmältnings tider kommer att resultera i färre ECs. Högre koncentrationer av kollagenase IV eller längre matsmältnings tider kommer att leda till mer fibroblastkontaminering.
Cell skador och fibroblastkontaminering är två problem i isoleringen av pAECs. För att minska cellskador och fibroblastkontaminering, antog vi en metod där ECs skrapades försiktigt med en cell skrapa. Riktningen, frekvensen och intensiteten i skrapningen är avgörande för att förhindra cellskador och fibroblastkontaminering. Först skrapade vi endoteliala ytan av aorta i en riktning bara. För det andra rekommenderar vi att skrapnings frekvensen är mindre än 10 gånger (5 till 8 gånger rekommenderas), och intensiteten måste vara skonsam. Slutligen, de områden som omger hålen i arteriella sidan grenar och snitt kanterna på aorta (som kan leda till fibroblastceller och mer skada celler) bör inte skrapas.
En högre kollagenas koncentration, längre digestionstid, och ökad frekvens och intensitet av skrapning kan öka fibroblast förorening. Fibroblaster kan snabbt växa ur CD31-positiva celler, vilket minskar renheten av isolerade ECs31. Jämfört med befintliga protokoll, även om protokollet har noggrant utformats för att förhindra fibroblastkontaminering, och de CD31-positiva cellerna på dag 3 nådde 97,4% ± 1,2% (medelvärde ± SD), andelen CD31 positiva celler sakta minskade efter kultur . Om isolerade ECs används för att genomföra experiment efter 5 passager, föreslår vi att cellerna ska sorteras med en flödescytometri cell sorterare10.
Vanligtvis, vi inte bara isolera endotelceller, men också få andra organ för xenotransplantation forskning, såsom bukspottkörteln och njurarna. Enligt vår erfarenhet, det skulle bättre att isolera bukspottkörteln och lungan först, och sedan utföra upphandling av lever och njure. Även efter att det inte är för sent att isolera hjärtat och aorta, om kirurgen är tillräckligt snabb för att avsluta alla isoleringen på mindre än en halvtimme. Under processen är det mycket viktigt att hålla det kirurgiska området sterilt och kallt. Den kalla PBS med antibiotika hälldes till målorganet för att rengöra eventuell kontaminering och för att hålla vävnaderna i låg temperatur. Det är också nödvändigt att förhindra koagulationen genom att injicera heparin efter anestesi av djur. Den propp i Micro vaskulära kärlet skulle framkalla celldöd och inflammation i organ med fler kapillärer, såsom bukspottkörteln, lungan och levern. Vi injicerar alltid heparin till sämre Vena Cava och sätter en kateter till bukaorta till blod. Detta kommer att effektivt förhindra koagulations relaterade celldöd.
Sammanfattningsvis erbjuder vi en effektiv metod för att isolera högrenade pAECs från minigrisar. De isolerade pAECs är nyttiga för xenotransplantationforskning. Även om vi inte har isolerat de pAECs från en stor gris med hjälp av protokollet, tror vi att vi kommer att få mycket renade ECs från en stor gris med protokollet genom att ändra några kritiska steg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av bidrag från Natural Science Foundation i Guangdongprovinsen, Grant/Award nummer: 2016A030313028; Medicinsk vetenskaplig forskning stiftelse i Guangdongprovinsen, Grant/Award nummer: B2018003; Shenzhen Stiftelsen för vetenskap och teknik, Grant/Award nummer: JCYJ20180306172449376, JCYJ20180306172459580, JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425103000011 och JCYJ20160428142040945; Shenzhen Longhua District Stiftelsen för vetenskap och teknik, Grant/Award nummer: 2017013; Nationella nyckel R & D program i Kina, Grant/Award nummer: 2017YFC1103704; Sanming projekt av medicin i Shenzhen, Grant/Award nummer: SZSM201412020; Särskilda fonder för byggande av sjukhus på hög nivå i Guangdongprovinsen (2019); Fond för hög nivå medicinsk disciplin konstruktion av Shenzhen, Grant/Award nummer: 2016031638; Shenzhen Foundation of Health och familjeplanering provision, Grant/Award nummer: SZXJ2017021 och SZXJ2018059. Vi tackar Hancheng Zhang och Zhicheng ZOU från Shenzhen University för att bistå vid utarbetandet av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSAria II | BD Bioscience | ||
| Boneforceps | Beijing HeLi KeChuang Technology Development CO.,Ltd. China | HL-YGQ | |
| BOON Disposable Syringe (10ml) | Jiangsu Yile medical Article Co., Ltd. China | ||
| CD31-FITC antibody | Bio-Rad | MCA1746F | |
| Cell scraper | Corning | 3010# | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138#-1G | |
| Compound ketamine injection | Veterinary Pharmaceutical Factory of Shenyang, China | Ketamine Hydrochloride?0.3g/2ml,Xylazine hydrochloride:0.3g/2ml, Phenacetin hydrochloride?1mg/2ml | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306# | |
| DMEM | Life Technologies | 11965118# | |
| ECM | Sciencell | 1001# | |
| ECGS | Sciencell | 1052# | |
| Eppendorf Snap-Cap Microtube(1.5mL) | AXYGEN | MCT-150-C# | |
| Falcon 100mm Cell Culture Dish | Corning | 353003# | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10270-106# | |
| Flowjo v10.0 | |||
| Forceps | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Heparin sodium | Jiangsu WanBang biopharmaceutical Co.,Ltd.China | ||
| Iodine tincture | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| Miniature Pig (Bama or Wuzhishan) | Kang Yi Ecological Agriculture Co., Ltd, China | ||
| Mshot microscope | Guangzhou Micro-shot Technology Co., Ltd. | M152 | |
| Petri Dishes (150 x 15 mm) | Biologixgroup | 66-1515# | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063# | |
| Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap ?T25? | Corning | 3289# | |
| Scissors | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | ||
| Serological Transfer Pipettes (10ml) | JET Biofil | GSP010010# | |
| Sterile Pasteur Pipette | GeneBrick | GY0025# | |
| Sterile Syringe Filter (0.22µm) | Millipore | SLGV033RS# | |
| Surgical scalpel | ShangHai medical instruments Co.,Ltd.China | 22# | |
| Surgical suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd | 5-0# | |
| Syringe?5mL? | Shengguang Medical Instrument Co., Ltd.China | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056# | |
| 75% Medical alcohol | Guilin LiFeng Medical Supplies Co.,Ltd.China | ||
| 20 x PBS solution (pH 7.4,Nuclease free) | Sangon Biotech | B540627# | |
| Medical disinfectant 84 liquid | Sichuan Province Yijieshi Medical Technology Co., Ltd | 450ml/bottle |
References
- Zhang, G. Y., Liao, T., Fu, X. B., Li, Q. F. Organ transplantation in China: concerns remain. Lancet. 385 (9971), 854-855 (2015).
- Ekser, B., et al. Clinical xenotransplantation: the next medical revolution? Lancet. 379 (9816), 672-683 (2012).
- Cooper, D. K., Ekser, B., Ramsoondar, J., Phelps, C., Ayares, D. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research. The Journal of Pathology. 238 (2), 288-299 (2016).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nature Reviews Immunology. 7 (10), 803-815 (2007).
- McGill, S. N., Ahmed, N. A., Christou, N. V. Endothelial cells: role in infection and inflammation. World Journal of Surgery. 22 (2), 171-178 (1998).
- Ekser, B., Cooper, D. K. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Review of Clinical Immunology. 6 (2), 219-230 (2010).
- Yeom, H. J., et al. Porcine aortic endothelial cell genes responsive to selected inflammatory stimulators. The Journal of Veterinary Medical Science. 71 (11), 1499-1508 (2009).
- Beigi, F., et al. Optimized method for isolating highly purified and functional porcine aortic endothelial and smooth muscle cells. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3139-3145 (2017).
- Jansen of Lorkeers, S. J., et al. Xenotransplantation of Human Cardiomyocyte Progenitor Cells Does Not Improve Cardiac Function in a Porcine Model of Chronic Ischemic Heart Failure. Results from a Randomized, Blinded, Placebo Controlled Trial. PLOS One. 10 (12), e0143953 (2015).
- Zhang, J., et al. Potential Antigens Involved in Delayed Xenograft Rejection in a Ggta1/Cmah Dko Pig-to-Monkey Model. Scientific Reports. 7 (1), 10024 (2017).
- Paris, L. L., et al. ASGR1 expressed by porcine enriched liver sinusoidal endothelial cells mediates human platelet phagocytosis in vitro. Xenotransplantation. 18 (4), 245-251 (2011).
- Paris, L. L., Chihara, R. K., Sidner, R. A., Tector, A. J., Burlak, C. Differences in human and porcine platelet oligosaccharides may influence phagocytosis by liver sinusoidal cells in vitro. Xenotransplantation. 19 (1), 31-39 (2012).
- Bernardini, C., et al. Heat shock protein 70, heat shock protein 32, and vascular endothelial growth factor production and their effects on lipopolysaccharide-induced apoptosis in porcine aortic endothelial cells. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 340-348 (2005).
- Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (8), 1983-1992 (2004).
- Graupera, M., Claret, M. Endothelial Cells: New Players in Obesity and Related Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 29 (11), 781-794 (2018).
- Kawamoto, A., Asahara, T., Losordo, D. W. Transplantation of endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Cardiovascular Radiation Medicine. 3 (3-4), 221-225 (2002).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature Medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Jain, R. K., et al. Endothelial cell death, angiogenesis, and microvascular function after castration in an androgen-dependent tumor: role of vascular endothelial growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (18), 10820-10825 (1998).
- Pratumvinit, B., Reesukumal, K., Janebodin, K., Ieronimakis, N., Reyes, M. Isolation, characterization, and transplantation of cardiac endothelial cells. BioMed Research International. 2013, 359412 (2013).
- Crouch, E. E., Doetsch, F. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions. Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).
- Nakano, H., Nakano, K., Cook, D. N. Isolation and Purification of Epithelial and Endothelial Cells from Mouse Lung. Methods in Molecular Biology. 1799, 59-69 (2018).
- Naschberger, E., et al. Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol. Journal of Visualized Experiments. (134), e57400 (2018).
- Yu, S., et al. Isolation and characterization of endothelial colony-forming cells from mononuclear cells of rat bone marrow. Experimental Cell Research. 370 (1), 116-126 (2018).
- Chi, L., Delgado-Olguin, P. Isolation and Culture of Mouse Placental Endothelial Cells. Methods in Molecular Biology. 1752, 101-109 (2018).
- Hawthorne, W. J., Lew, A. M., Thomas, H. E. Genetic strategies to bring islet xenotransplantation to the clinic. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (5), 476-483 (2016).
- Yi, E., et al. Mechanical Forces Accelerate Collagen Digestion by Bacterial Collagenase in Lung Tissue Strips. Frontiers in Physiology. 7, 287 (2016).
- Masson-Pevet, M., Jongsma, H. J., De Bruijne, J. Collagenase- and trypsin-dissociated heart cells: a comparative ultrastructural study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 8 (10), 747-757 (1976).
- Yonenaga, K., et al. Optimal conditions of collagenase treatment for isolation of articular chondrocytes from aged human tissues. Regenerative Therapy. 6, 9-14 (2017).
- French, M. F., Mookhtiar, K. A., Van Wart, H. E. Limited proteolysis of type I collagen at hyperreactive sites by class I and II Clostridium histolyticum collagenases: complementary digestion patterns. Biochemistry. 26 (3), 681-687 (1987).
- Hara, H., et al. In vitro investigation of pig cells for resistance to human antibody-mediated rejection. Transplant International: Official Journal of the European Society for Organ Transplantation. 21 (12), 1163-1174 (2008).
- Takashima, A. Establishment of fibroblast cultures. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 2, 2.1.1-2.1.12 (2001).
