L’emisezione spinale toracica del ratto è un modello prezioso e riproducibile di lesioni unilaterali del midollo spinale per studiare i meccanismi neurali del recupero locomotorio e l’efficacia del trattamento. Questo articolo include una guida dettagliata passo-passo per eseguire la procedura di emisezione e per valutare le prestazioni locomotorie in un’arena a campo aperto.
La lesione del midollo spinale (SCI) provoca disturbi nella funzione motoria, sensoriale e autonomica al di sotto del livello della lesione. I modelli animali sperimentali sono strumenti preziosi per comprendere i meccanismi neurali coinvolti nel recupero locomotorio dopo la SCI e per progettare terapie per le popolazioni cliniche. Ci sono diversi modelli sperimentali di SCI, tra cui lesioni di contusione, compressione e transezione che vengono utilizzati in un’ampia varietà di specie. Un’emisezione comporta la transezione unilaterale del midollo spinale e interrompe tutti i tratti ascendenti e discendenti su un solo lato. L’emisezione spinale produce una lesione altamente selettiva e riproducibile rispetto alle tecniche di contusione o compressione che è utile per studiare la plasticità neurale nei percorsi risparmiati e danneggiati associati al recupero funzionale. Presentiamo un protocollo dettagliato passo-passo per eseguire un’emisezione toracica a livello vertebrale T8 nel ratto che si traduce in una paralisi iniziale dell’arto posteriore sul lato della lesione con recupero spontaneo graduato della funzione locomotoria su più Settimane. Forniamo anche un protocollo di punteggio locomotore per valutare il recupero funzionale in campo aperto. La valutazione locomotore fornisce un profilo di recupero lineare e può essere eseguita sia precoce che ripetutamente dopo l’infortunio al fine di vagliare accuratamente gli animali in base ai punti temporali appropriati in cui condurre test comportamentali più specializzati. La tecnica dell’emisezione presentata può essere facilmente adattata ad altri modelli e specie di transezione, e la valutazione locomotore può essere utilizzata in una varietà di Modelli di SCI e altri modelli di lesioni per ottenere la funzione locomotoria.
La lesione del midollo spinale (SCI) è associata a gravi disturbi nella funzione motoria, sensoriale e autonomica. I modelli animali sperimentali di SCI sono strumenti preziosi per comprendere gli eventi anatomici e fisiologici coinvolti nella patologia SCI, per studiare i meccanismi neurali nella riparazione e nel recupero e per valutare l’efficacia e la sicurezza di potenziali terapie Interventi. Il ratto è la specie più comunemente utilizzata nella ricerca SCI1. I modelli di ratto sono a basso costo, sono facili da riprodurre e una grande batteria di test comportamentali sono disponibili per valutare i risultati funzionali2. Nonostante alcune differenze nelle posizioni del tratto, il midollo spinale del ratto condivide nel complesso funzioni sensomotorie simili con i mammiferi più grandi, compresi i primati3,4. I ratti condividono anche conseguenze fisiologiche e comportamentali analoghe alla SCI che si riferiscono agli esseri umani5. I primati non umani e i grandi modelli animali possono fornire un’approssimazione più ravvicinata della SCI6 umana e sono essenziali per dimostrare la sicurezza e l’efficacia del trattamento prima della sperimentazione umana, ma sono meno comunemente utilizzati a causa del benessere etico e animale considerazioni, spese e requisiti normativi7.
I modelli SCI di transezione del ratto vengono eseguiti dall’interruzione mirata del midollo spinale con una lesione selettiva utilizzando un coltello di dissezione o forbici iridectomia dopo una laminectomia. Rispetto a una transsezione completa, la transezione parziale nel ratto si traduce in una lesione meno grave, una più facile cura degli animali postoperatori, un recupero locomotore spontaneo e modelli più strettamente spettrali di SCI negli esseri umani, che è prevalentemente incompleto con la parsimonia parziale tessuto che collega il midollo spinale e le strutture sovraspinali8. Un’emisezione unilaterale interrompe tutti i tratti ascendenti e discendenti da un solo lato e produce deficit locomotori quantificabili e altamente riproducibili, migliorando l’esplorazione dei meccanismi biologici sottostanti. La conseguenza funzionale più prominente dell’emisezione è una paralisi iniziale degli arti sullo stesso lato e al di sotto del livello della lesione con recupero spontaneo graduato della funzione locomotoria per diverse settimane9,10, 11 Del sistema di , 12.Il modello dell’emisezione è particolarmente utile per studiare la plasticità neurale dei tratti e dei circuiti danneggiati e residui associati al recupero funzionale9,11,12, 13,14,15,16,17,18. In particolare, l’emisezione eseguita a livello toracico, cioè sopra i circuiti spinali che controllano la locomozione degli arti posteriori, è particolarmente utile per studiare i cambiamenti nel controllo locomotore. Poiché esiste una relazione non lineare tra la gravità delle lesioni e il recupero locomotorio dopo SCI19, un test comportamentale appropriato per valutare i risultati funzionali è fondamentale nei modelli sperimentali.
Una batteria completa di test comportamentali sono disponibili per valutare aspetti specifici del recupero locomotore funzionale nel ratto2,20. Molti test locomotori non forniscono misure affidabili nelle prime fasi successive alla SCI, in quanto i ratti sono troppo disabili per sostenere il loro peso corporeo. Una misura delle prestazioni postmotorie spontanee sensibili ai deficit precocemente dopo l’infortunio e non richiede un allenamento preoperatorio o attrezzature specializzate è utile per monitorare il recupero locomotore per i punti di tempo appropriati in cui integrare test comportamentali specializzati. Il punteggio di valutazione open-field Martinez10, originariamente sviluppato per valutare le prestazioni del locomotore dopo la SCI cervicale nel ratto, è un punteggio ordinale di 20 punti che valuta le prestazioni locomotorie globali durante la locomozione sotterranea spontanea in un campo aperto. Il punteggio viene condotto separatamente per ogni arto utilizzando una rubrica che valuta parametri specifici di una serie di misure locomotorie, tra cui il movimento degli arti articolari, il supporto del peso, la posizione della cifra, le capacità di stepping, la coordinazione degli arti anteriori e dell’arto posteriore e la coda posizione. Il punteggio di valutazione è derivato dalla scala di valutazione open-field Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) progettata per valutare le prestazioni locomotorie dopo la contusione toracica21. È adattato per valutare in modo accurato e affidabile sia la funzione locomotore anteriore che quella degli arti posteriori, consente una valutazione indipendente dei diversi parametri di punteggio che non sono disponibili con il punteggio gerarchico della BBB e fornisce un recupero lineare profilo10. Inoltre, rispetto alla BBB, il punteggio di valutazione è sensibile e affidabile nei modelli di infortunipiù più gravi10,11,20,22. Il punteggio di valutazione è stato utilizzato per valutare la compromissione locomotoria nel ratto dopo la sierzia10,12 e la sola SCI toracica9 e in combinazione con lesioni cerebrali traumatiche23.
Vi presentiamo qui un protocollo dettagliato passo-passo per l’esecuzione di un’emisezione toracica SCI a livello vertebrale T8 nel ratto femmina Long-Evans, e per valutare il recupero locomotore degli arti posteriori nel campo aperto.
Un punto di forza della tecnica dell’emisezione è la selettività e riproducibilità della lesione che porta a una ridotta variabilità nei fenotipi istologici e comportamentali tra gli animali25. Al fine di garantire una lesione unilaterale al livello spinale appropriato, è fondamentale un’identificazione accurata sia del segmento vertebrale appropriato che della linea mediana del midollo spinale. Poiché può esserci una tendenza per il midollo spinale a ruotare nella direzione del taglio dura…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes for Health Research (CIHR; MOP-142288) a M.M. M.M. è stato sostenuto da un premio salariale da Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS), e A.R.B è stato sostenuto da una borsa di studio da FRQS.
Baytril | CDMV | 11242 | |
Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
Compressed oxygen gas | Praxair | ||
Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
Gelfoam | CDMV | 102348 | |
Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
Isofluorane | CDMV | 118740 | |
Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
Physiological saline | CDMV | 1399 | |
Proviodine | CDMV | 4568 | |
Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |