Summary
Die Brustbrust-Spinal-Hemisektion ist ein wertvolles und reproduzierbares Modell der einseitigen Rückenmarksverletzung, um die neuronalen Mechanismen der bewegungsmotorischen Erholung und Behandlungswirksamkeit zu untersuchen. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung, um das Hemisection-Verfahren durchzuführen und die Leistung des Bewegungsapparates in einer Offenen Allee zu bewerten.
Abstract
Rückenmarksverletzungen (SCI) verursachen Störungen der motorischen, sensorischen und autonomen Funktion unterhalb des Niveaus der Läsion. Experimentelle Tiermodelle sind wertvolle Werkzeuge, um die neuronalen Mechanismen zu verstehen, die an der Erholung des Bewegungsapparates nach SCI beteiligt sind, und um Therapien für klinische Populationen zu entwickeln. Es gibt mehrere experimentelle SCI-Modelle, einschließlich Prellungen, Kompression und Transektion Verletzungen, die in einer Vielzahl von Arten verwendet werden. Eine Halbsektion beinhaltet die einseitige Transsektion des Rückenmarks und stört alle auf- und absteigenden Trakte nur auf einer Seite. Die Spinalhemisektion produziert eine hochselektive und reproduzierbare Verletzung im Vergleich zu Konfusions- oder Kompressionstechniken, die für die Untersuchung der neuronalen Plastizität in geschliffenen und beschädigten Wegen im Zusammenhang mit funktioneller Erholung nützlich ist. Wir präsentieren ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung einer Thorax-Hemisektion auf der T8-Wirbelebene bei der Ratte, die zu einer anfänglichen Lähmung des Hinterbeins an der Seite der Läsion mit abgestufter spontaner Wiederherstellung der Bewegungsfunktion über mehrere Wochen. Wir bieten auch ein Locomotor Scoring-Protokoll, um die funktionelle Wiederherstellung im offenen Feld zu bewerten. Die Lokmotor-Bewertung bietet ein lineares Rückgewinnungsprofil und kann sowohl früh als auch wiederholt nach Verletzungen durchgeführt werden, um Tiere genau auf geeignete Zeitpunkte zu überprüfen, in denen spezialisiertere Verhaltenstests durchgeführt werden können. Die vorgestellte Hemisektionstechnik kann leicht an andere Transektionsmodelle und Arten angepasst werden, und die Bewegungsbewertung kann in einer Vielzahl von SCI- und anderen Verletzungsmodellen verwendet werden, um die Funktion des Bewegungsapparates zu bewerten.
Introduction
Rückenmarksverletzungen (SCI) sind mit schweren Störungen der motorischen, sensorischen und autonomen Funktion verbunden. Experimentelle Tiermodelle von SCI sind wertvolle Werkzeuge, um die anatomischen und physiologischen Ereignisse der SCI-Pathologie zu verstehen, die neuronalen Mechanismen bei der Reparatur und Wiederherstellung zu untersuchen und die Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller therapeutischer Interventionen. Die Ratte ist die am häufigsten verwendete Art in SCI-Forschung1. Rattenmodelle sind kostengünstig, einfach zu reproduzieren, und eine große Batterie von Verhaltenstests zur Beurteilung der funktionellen Ergebnisse2zur Verfügung. Trotz einiger Unterschiede in den Traktpositionen teilt das Rückenmark der Ratte insgesamt ähnliche sensorimotorische Funktionen mit größeren Säugetieren, einschließlich Primaten3,4. Ratten teilen auch analoge physiologische und Verhaltensfolgen zu SCI, die sich auf den Menschen beziehen5. Nichtmenschliche Primaten- und Großtiermodelle können eine nähere Annäherung an den menschlichen SCI6 ermöglichen und sind für den Nachweis der Behandlungssicherheit und -wirksamkeit vor menschlichen Experimenten unerlässlich, werden aber aufgrund des ethischen und Tierschutzes seltener verwendet. Berücksichtigungen, Aufwendungen und regulatorischen Anforderungen7.
Rattentransektion SCI-Modelle werden durch die gezielte Unterbrechung des Rückenmarks mit einer selektiven Läsion mit einem Seziermesser oder einer Iritektomieschere nach einer Laminektomie durchgeführt. Im Vergleich zu einer vollständigen Transektion führt die partielle Transektion bei der Ratte zu einer weniger schweren Verletzung, einer leichteren postoperativen Tierpflege, einer spontanen Bewegungsregeneration und genauer enden den Modellen SCI beim Menschen, die überwiegend unvollständig ist, wobei die Gewebe, das das Rückenmark und die supraspinalen Strukturen verbindet8. Eine einseitige Halbsektion stört alle aufsteigenden und absteigenden Traktate nur auf einer Seite und erzeugt quantifizierbare und hochreproduzierbare Bewegungsdefizite, wodurch die Erforschung der zugrunde liegenden biologischen Mechanismen verbessert wird. Die prominenteste funktionelle Folge der Hemisektion ist eine anfängliche Gliedmaßenlähmung auf der gleichen Seite und unterhalb des Niveaus der Läsion mit abgestufter spontaner Wiederherstellung der Bewegungsfunktion über mehrere Wochen9,10, 11 , 12. Das Halbschnittmodell ist besonders nützlich, um die neuronale Plastizität beschädigter und Resttrakte und Schaltkreise im Zusammenhang mit der funktionellen Erholung9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Insbesondere ist die Aufschnitte, die auf thorakaler Ebene durchgeführt werden, d.h. über den Wirbelsäulenkreisläufen, die die Hinterlimb-Fortbewegung steuern, besonders nützlich für die Untersuchung von Veränderungen in der Bewegungssteuerung. Da eine nichtlineare Beziehung zwischen Läsionsschweregrad und Bewegungsrückgewinnung nach SCI19besteht, sind geeignete Verhaltenstests zur Bewertung der funktionellen Ergebnisse in experimentellen Modellen von größter Bedeutung.
Eine umfassende Batterie von Verhaltenstests zur Verfügung, um spezifische Aspekte der funktionellen Bewegungsrückgewinnung in der Ratte2,20zu bewerten. Viele Bewegungstests bieten keine zuverlässigen Maßnahmen früh nach SCI, da Ratten zu behindert sind, um ihr Körpergewicht zu unterstützen. Ein Maß für die spontane Motorleistung, das früh nach einer Verletzung auf Defizite reagiert und keine präoperative Ausbildung oder spezielle Ausrüstung erfordert, ist von Vorteil, um die Erholung des Bewegungsapparates auf geeignete Zeitpunkte zu überwachen, in denen spezielle Verhaltenstests ergänzen. Der Martinez-Open-Field-Bewertungswert10, der ursprünglich für die Bewertung der Motorikleistung nach zervikalem SCI in der Ratte entwickelt wurde, ist ein 20-Punkte-Ordinal-Score zur Beurteilung der globalen Lokomotor-Leistung während spontaner oberirdischer Fortbewegung in offenes Feld. Die Bewertung erfolgt separat für jedes Glied unter Verwendung einer Rubrik, die bestimmte Parameter einer Reihe von bewegungsförmigen Maßnahmen bewertet, einschließlich Gelenkgelenkbewegung, Gewichtsstütze, Ziffernposition, Schrittfähigkeiten, Vorderglieda-Hinterschritt-Koordination und Schwanz stellung. Der Bewertungswert wird von der offenen Bewertungsskala Basso, Beattie und Bresnahan (BBB) abgeleitet, die zur Bewertung der Motorleistung nach Thoraxkontusion21entwickelt wurde. Es ist an die genaue und zuverlässige Bewertung sowohl der Vorder- als auch der Hinterhaut-Bewegungskraft-Funktion angepasst, ermöglicht eine unabhängige Bewertung der verschiedenen Bewertungsparameter, die mit der hierarchischen Bewertung des BBB nicht zugänglich sind, und bietet eine lineare Wiederherstellung. Profil10. Darüber hinaus ist der Bewertungswert im Vergleich zum BBB bei schwereren Verletzungsmodellen10,11,20,22sensibel und zuverlässig. Die Bewertungsbewertung wurde verwendet, um die motorische Beeinträchtigung der Ratte nach dem Gebärmutterhals10,12 und thorakale9 SCI allein und in Kombination mit traumatischen Hirnverletzungen23zu bewerten.
Wir präsentieren hier ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung eines Thorax-Hemisektions-SCI auf T8-Wirbelebene in der weiblichen Long-Evans-Ratte und zur Beurteilung der Rückdlimb-Locomotor-Erholung im offenen Feld.
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Protocol
Die in diesem Artikel beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und von der Ethikkommission der Université de Montréal genehmigt.
1. Thorax-Hemisektions-Operation
- Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Handschuhe, Maske und Kleid), um eine aseptische Umgebung für die Operation zu erhalten. Reinigen Sie den operationsischen Bereich mit Alkoholtüchern und legen Sie sterile chirurgische Vorhänge über dem chirurgischen Feld. Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge und legen Sie auf dem chirurgischen Feld.
- Anästhetisieren Sie die Ratte unter einem Gemisch aus Isoflurangas (3% Induktion, 0,5 bis 3% Wartung) und Sauerstoff (1 L/min). Bestätigen Sie die richtige chirurgische Anästhesietiefe, indem Sie das Fehlen von Zehenkneifen und Hornhautreflexreaktionen überprüfen. Kontinuierliche Überwachung der Ratte während des gesamten Eingriffs und Anpassung der Menge der Anästhesie-Zulieferung, wie erforderlich, um die chirurgische Anästhesietiefe zu erhalten.
- Rasieren Sie den dorsalen Rumpf zwischen Hüfte und Hals, legen Sie die Ratte auf das Operationsfeld, desinfizieren Sie die Schnittstelle mit Alkoholtüchern und Proviodinlösung und halten Sie die Körperkerntemperatur bei 37 °C mit einem Rückkopplungs-gesteuerten Heizpad, das von rektal überwacht wird thermometer.
- Legen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen, um sie hydratisiert zu halten und während der operationabhängigen Operation erneut aufzutragen.
- Machen Sie einen 2,5 cm Schnitt in der Haut, der die T6-T10-Wirbel mit einem Skalpell überlagert. Ziehen Sie die Haut und das oberflächliche Fett mit einer stumpfen Sezierschere zurück.
ANMERKUNG: Die Wirbelsegmente T6-T10 können entweder rostral durch sanftes Abtasten der dorsalen Wirbelsäulensegmente von der Schädelbasis ausgehend von der spürbaren Protuberanz des 2. Brustwirbels24oder Palpation der nachträdsten schwimmenden Rippe, die Bewegung in den 13. Brustwirbel ninduzieren wird. - Trennen Sie die paravertebralen Muskeln, die auf dem dorsalen Aspekt der T7-T9-Wirbel einsetzen, mit einer stumpfen Sezierschere und einem selbsterhaltenden Retraktor. Debride und löschen Sie das verbleibende Gewebe mit feinen Zangen und Baumwolle gekippt Applikatoren, um die spinösen Prozesse und Wirbellaminae auszusetzen.
HINWEIS: Dies und die folgenden Schritte werden durch die mikroskopische Visualisierung (ca. 5 x 15x) stark unterstützt. - Schneiden Sie die Facetten (zygapophysiale Gelenke) auf den Wirbeln T7 und T8 mit empfindlichen Knochenschneidern vorsichtig bilateral. Schneiden Sie das dorsale Bindegewebe zwischen dem WirbellaminaT T8 und T9 oberflächlich mit einem Skalpell (1 mm Tiefe) ab, wobei darauf geachtet wird, die Unterlegeschnur nicht zu verletzen.
- Entfernen Sie den spinösen Prozess des T8-Wirbels mit Knochenschneidern. Mit gekrümmten hämostatischen Zangen, die sorgfältig auf den T7-Spinnprozess geklemmt sind, drehen Sie das kaudale Ende der T8-Lamina leicht rostral (ca. 20°), legen Sie die Knochenschneider unter die T8-Lamina ein und machen Sie einen Mittellinieschnitt entlang der Lamina. Setzen Sie die Laminektomie fort, indem Sie die Schnitte auf der linken und rechten Seite der Wirbellamina medial zu den Querprozessen wiederholen, um das Rückenmark freizulegen.
HINWEIS: Achten Sie darauf, alle Knochenfragmente zu entfernen, die aus der Laminektomie erstellt wurden. - Tropf lidocaine (2%, 0,1 ml) in den exponierten Spinalkanal und entfernen Sie die Dura Überlagerung des T8 Wirbelsäulensegments mit feinen Zangen und Iridektomie Schere. Wiederholen Sie die Lidocain-Verabreichung an die exponierte Schnur und identifizieren Sie die Mittellinie der Schnur durch Visualisierung einer Mittellinie, die zwischen den spinösen Prozessen zwischen den exponierten T7-T9-Wirbeln erstellt wurde.
HINWEIS: Neben den spinösen Prozessen auf T7 und T9 können die exponierten rückenförmigen Banditen auf T8 auch zur Identifizierung der Mittellinie verwendet werden und eine 30 G Nadel kann in der Mittellinie der Schnur platziert werden, um bei der anschließenden Halbsektion zu helfen. - Hemisect das Rückenmark von der Mittellinie zur einen Seite mit einem Sezieren Messer. Achten Sie darauf, die vordere Wirbelsäulenarterie auf der ventralen Seite nicht zu durchschneiden (keinen festen Druck auf den Wirbelkörper ausüben). Schneiden Sie mit einer Iridektomieschere das verbleibende Gewebe auf der läsionsgebundenen Seite des Rückenmarks sorgfältig durch, um sicherzustellen, dass der ventrolaterale Quadrant entsprechend transsektiert wird.
- Sterilen, mit Herzsäure getränkten hämostatischen Schwamm (ca. 6 x 2 mm) in den freiliegenden Hohlraum über dem Rückenmark legen und die Muskelschichten (4-0 Polyglactin 910) anähen. Als nächstes, Naht die Haut um die Schnittstelle.
- Ausreichende sanalgetisische (Buprenorphin 0,05 mg/kg subkutane [s.c.]), Antibiotikum (Enrofloxacin, 10 mg/kg s.c.) und füllen Sie verlorene Flüssigkeiten mit 5 cc laktierten Ringerlösung (intraperitoneal [i.p.]) unmittelbar nach der Operation auf.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Anästhesie. Legen Sie die Ratte in eine warme Umgebung unter einem Heizkissen oder einer Lampe (ca. 33 °C), bis das Tier vollständig wach ist.
- Bieten Sie zusätzliche Analgesie täglich über die ersten 3 postoperativen Tage und kontinuierlich auf Anzeichen von Schmerzen überwachen., Gewichtsverlust, unsachgemäße Micturition, Infektion, Probleme mit der Wundheilung, oder Autophagie.
2. Open-Field-Testverfahren und Lokomotor-Leistungsbewertung
- Behandeln Sie Ratten täglich für 1 Woche und gewöhnen Sie sie in die Arena für zwei 5-Min-Sitzungen vor dem Testen, um sich zu akklimatisieren, um abgeholt zu werden, sanft aus dem mittleren Kofferraum, während im offenen Feld und um die Messzuverlässigkeit während der Tests zu gewährleisten.
- Platzieren Sie eine Kamera ebenerisch gegenüber der kreisförmigen Plexiglas-Open-Field-Arena, um Testsitzungen für die Offline-Analyse aufzuzeichnen (mindestens 30 bis 60 Frames/s).
- Beginnen Sie die Videoaufzeichnung und stellen Sie die Ratte in die Mitte der Arena unter lichten Lichtverhältnissen, um die Aktivität des Bewegungsapparates zu fördern.
- Setzen Sie die Testsitzung für 4 min fort, um eine ausreichende Menge an Bewegungskraft-Anfällen für die Analyse sicherzustellen. Nehmen Sie Ratten in der Mitte der Arena auf und ersetzen Sie sie, wenn sie länger als 20 s stehen bleiben, um die Fortbewegung zu fördern.
- Score-Locomotor-Leistung der aufgezeichneten Testsitzung durch Ausfüllen der RubrikTabelle 1entsprechend den Parametern in den folgenden Unterabschnitten.
HINWEIS: Es ist hilfreich, jeden Parameter separat zu bewerten, indem Sie die aufgezeichnete Testsitzung wiederholt mit einer Software betrachten, die eine variable Wiedergabegeschwindigkeit und Frame-by-Frame-Analyse ermöglicht (z. B. VLC-Mediaplayer).- Bei Gelenkbewegungen der Gliedmaßen, Partitur hinterdlimb Gelenkbewegungen während der spontanen Fortbewegung getrennt für Den Knöchel, Knie und Hüfte als normal (mehr als die Hälfte des Bewegungsbereichs, vergebene Punktzahl = 2), leicht (weniger als die Hälfte des Bewegungsbereichs, vergebene Punktzahl = 1) oder abwesend (vergebene Punktzahl = 0).
- Für gewichtsunterstützende Werte, bewerten Sie die Fähigkeit der Hinterlimb ExtensorMuskeln, sich zu zusammenziehen und geladenes Körpergewicht zu unterstützen, wenn die Gliedmaße separat auf dem Boden ist, wenn die Ratte stationär ist, sowie während der aktiven Fortbewegung. Vergeben Sie eine Punktzahl von 1, wenn Gewichtsunterstützung vorhanden ist, und eine Punktzahl von 0, wenn gewichtsunterstützend fehlt.
HINWEIS: Die stationäre Gewichtsunterstützung gilt als Perquisite für aktive Gewichtsunterstützung. - Bewerten Sie für die Ziffernposition die Position der Hinterkieferziffern, während die Ratte stationär ist und während der Fortbewegung. Vergeben Sie eine Punktzahl von 2, wenn hintere Ziffern erweitert werden, abstand senzumbar voneinander, und Tonikum während der Fortbewegung in mehr als 50% des Testzeitraums (als normal betrachtet). Vergeben Sie eine Punktzahl von 1, wenn Ziffern überwiegend gebeugt bleiben, und eine Punktzahl von 0, wenn Ziffern überwiegend atonic bleiben.
- Zum Schrittieren schließen Sie diesen Parameter nur ab, wenn die Ratte ihr Körpergewicht während des Steppings unterstützen kann. Bewerten Sie das Stepping, indem Sie die Ausrichtung der Hinterkieferpfopfotenplatzierung zum Zeitpunkt des ersten Kontakts bewerten und beim Abheben vom Boden zusätzlich zur Fließfähigkeit der Schwingphase während des Steppings.
ANMERKUNG: Es gibt 3 Punkte für diesen Parameter, die in den folgenden Unterabschnitten separat bewertet werden: 1) die axiale Ausrichtung der Pfotenplatzierung beim Gliedmaßenkontakt (dorsale/plantare Platzierung), 2) die Längsausrichtung der Pfotenplatzierung beim Erstkontakt und während des Hebens (parallel zur Körperachse oder innen/extern gedreht) und 3) die Qualität der Gliedmaßenbewegung während des Schwingens (regelmäßig oder unregelmäßig).- Für die Pfotenplatzierung am Gliedmaßenkontakt, bewerten Sie die axiale Ausrichtung der Pfotenplatzierung beim Gliedmaßenkontakt als 0, wenn dorsale Platzierungen in mehr als 50% der Schritte auftreten.
ANMERKUNG: Die Plantarplatzierung gilt als Perquisite zur Bewertung der Ausrichtung der Pfote beim Kontakt und Beim Heben (Schritt 2.5.4.2), der Schwenkbewegung (Schritt 2.5.4.3) und der Vorderglied-Hinterschritt-Koordination (Schritt 2.5.5). - Für die Pfotenausrichtung beim Gliedmaßenkontakt und -lift eine Punktzahl von 2 vergeben, wenn die Längspfote und die Körperachsen parallel sind, und eine Punktzahl von 1, wenn die Gliedmaße nach außen oder innen gedreht wird, getrennt für Gliedmaßenkontakt und Lift.
- Für die Swing-Bewegung, vergeben Sie eine Punktzahl von 2, wenn hintere limb Gelenke bewegen sich in einer harmonischen und regelmäßigen Weise während des Schwingens und eine Punktzahl von 1, wenn ruckartige oder spasmodische Bewegungen der Gelenke während des Schwingens auftreten.
- Für die Pfotenplatzierung am Gliedmaßenkontakt, bewerten Sie die axiale Ausrichtung der Pfotenplatzierung beim Gliedmaßenkontakt als 0, wenn dorsale Platzierungen in mehr als 50% der Schritte auftreten.
- Für die Vorderlimb-Hindlimb-Koordination, vervollständigen Sie diesen Parameter nur, wenn 4 aufeinander folgende Schritte während der Tests auftreten und wenn die Gliedmaßen das Körpergewicht aktiv unterstützen können. Vergeben Sie eine Punktzahl von 3, wenn die Koordination konsistent ist (>90% der Schritte), 2 bei häufigen (50-90% der Schritte), 1, wenn gelegentlich (<50% der Schritte) oder 0, wenn sie nicht vorhanden sind (0% der Schritte).
HINWEIS: Die Forelimb-hindlimb-Koordination ist definiert als ein regelmäßiger Wechsel beim Schritt zwischen dem gepunkteten Hinterglied und dem Vorderglied auf der gleichen Seite des Körpers. - Bewerten Sie für die Schwanzposition während der Fortbewegung entweder nach oben (off the ground, awarded score = 1) oder down (Berühren des Bodens, vergebene Punktzahl = 0).
HINWEIS: Eine erhöhte Schwanzposition während der Fortbewegung ist ein Indikator für die Rumpfstabilität in der Ratte. Nach der Hemisektion wird der Schwanz normalerweise in der Nähe oder beim Berühren des Bodens gehalten, da die Stabilität des Rumpfes beeinträchtigt ist. - Fügen Sie die einzelnen Punkte aus jedem Parameter hinzu, um eine Summe für jedes Hinterglied von maximal 20 Punkten bereitzustellen.
HINWEIS: Eine Punktzahl von 20 gibt die normale Motorleistung des Bewegungsapparates an. Die Werte <20 stellen eine zunehmende Anzahl von Motorstörungen dar, und eine Punktzahl von 0 weist auf eine Lähmung der Gliedmaßen hin.
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Representative Results
Reproduzierbare Läsionen mit hoher Konsistenz können mit der Hemisektionstechnik erzeugt werden. Um läsionengrößen zwischen versuchsexperimentellen Gruppen zu bewerten und zu vergleichen, kann die maximale Fläche der Läsion als Prozentsatz des gesamten Querschnitts des Rückenmarks leicht mit histologischer Färbung von Rückenmarksabschnitten berechnet werden. Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Läsion des linken Hämicords und eine Überlagerung des Anteils der maximalen Läsionsfläche, die von Ratten geteilt wird, mit einer mittleren Läsionsgröße von 47,3 % bis 4,0 % der Querschnittsschnurfläche (n = 6).
Abbildung 1: Repräsentative Wirbelsäulenläsionen. (A) Mikrofoto eines koronaren Wirbelsäulenabschnitts im Läsionsepizentrum von einer halbseitig gefärbten Ratte mit Kresylviolett (Zellkörper, violett) und Luxol schnellblau (Myelin, blau), was auf eine Schädigung der in der linken hemicord. D, dorsal; V, ventral; L, links; R, rechts. Maßstabsbalken: 1 mm. (B) Schematische Überlagerung des gemeinsamen Anteils der maximalen Läsionsfläche in einer Rattengruppe (n = 6). Die Lage des gekreuzten Kortikospinaltraktes im dorsalen Funiculus auf der rechten Seite ist schwarz schattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die primäre Folge der Hemisektion ist eine anfängliche Lähmung des Hinterglieds an der Seite der Läsion während der ersten zwei bis drei postoperativen Tage. Die Motorleistung des stärker betroffenen Hinterteils verbessert sich in der Ratte nach der Hemisektion in den ersten Wochen nach der Verletzung rapide. Kleine Defizite in der gegenüberliegenden Hinterbeine werden häufig zuerst nach der Halbsektion beobachtet, die die Kompensation für die stärker betroffene Gliedmaße oder Defizite, die aus einem Mangel an Haltungsstabilität, Gewichtsunterstützung und konsequentem Schritt resultieren, widerspiegeln können. Ein großes und anhaltendes Defizit im gegenüberliegenden Hinterteil würde auf eine bilaterale Läsion hindeuten, die sich bis in die gegnerische Hemicord ausdehnt.
Tabelle 1 enthält eine Rubrik für die Bewertung der Motorleistung.
Tabelle 1: Musterbewertungsbogen. Beispiel für die Bewertung der Motorleistung. Für jeden Parameter werden die möglichen Ergebnisse in Klammern angegeben. Ich, intern; E, extern; P, parallel; FL-HL, Vorderglied-Hindlimb. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Der zeitliche Verlauf repräsentativer Veränderungen der Motorleistung im intakten Zustand und in den ersten fünf Wochen nach einer linken Seitenhalbsektion in getrennten Rattengruppen (n = 6 pro Gruppe) ist in Abbildung 2dargestellt.
Abbildung 2: Repräsentativer Zeitverlauf der Veränderungen der Hinterlimb-Bewegungskraft-Leistung im Offenen Feld im intakten Zustand und für fünf Wochen nach einer linken Brusthalber-Halbsektion. Die Leistung des linken Hinterglieds (A) ist durch intakte Werte in den ersten drei Wochen nach der Halbsektion und des rechten Hinterglieds (B) in der ersten Woche nach der Halbsektion erheblich beeinträchtigt. Die Daten werden als Gruppenmittelwert dargestellt , Standardabweichung (SD; n = 6 pro Gruppe). Statistische Analysen wurden mit Kruskal-Wallis nicht-parametrischen Tests durchgeführt, die durch Dunns Mehrfachvergleichstests ergänzt wurden, um Gruppenunterschiede zwischen Zeitpunkten zu bewerten. *p < 0,05, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine wesentliche Stärke der Hemisektionstechnik ist die Selektivität und Reproduzierbarkeit der Läsion, die zu einer verminderten Variabilität in histologischen und verhaltensbildenden Phänotypen zwischen Tieren führt25. Um eine einseitige Läsion auf der entsprechenden Wirbelsäulenebene zu gewährleisten, ist eine genaue Identifizierung sowohl des richtigen Wirbelsegments als auch der Mittellinie des Rückenmarks von entscheidender Bedeutung. Da es eine Tendenz für das Rückenmark sein kann, sich während des Halbschnitts in Richtung des Schnittes zu drehen, kann es vorteilhaft sein, die Schnur mit feinen Zangen, die während des Eingriffs auf beiden Seiten platziert werden, empfindlich zu stabilisieren. Das Platzieren der Ratte in einem stereotaxic Rahmen mit dem Schwanz sanft unter Lichtspannung verklebt kann mit Stabilität und richtige Wirbelausrichtung während des Verfahrens helfen. Eine Am stereotaxic-Rahmen befestigte Wirbelsäulenklemme und ein spinaler Prozess können auch verwendet werden, um die Stabilität der Wirbelsäule zu verbessern, aber wir stellen fest, dass ihre Anwesenheit den Zugang zur Schnur mit chirurgischen Werkzeugen einschränken kann und umständliche Anflugwinkel während der chirurgie. Es ist auch wichtig, alle Knochenfragmente im Spinalkanal aus der Laminektomie zu entfernen, da sie unerwünschte Kompressionsverletzungen an der Schnur verursachen und sekundäre Schäden fördern können.
Ratten sollten während der Operation ständig beobachtet werden, um notwendige Vitalsymptome wie Kerntemperatur und Atmung zu überwachen, da Hypothermie eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit sowohl während der Anästhesieverabreichung als auch zunächst nach der Operation ist. Die Regulierung der Körperkerntemperatur mit einer rektalen Sonde und einem rückkopplungsgesteuerten Heizkissen kann Temperaturkomplikationen stark vermeiden. Ein Pulsoximeter kann auch verwendet werden, um die Sauerstoffversorgung und Herzfrequenz des Blutes zu überwachen, um die Anästhesietiefe zu regulieren. Wir stellen fest, dass die Flüssigkeitsauffüllung unmittelbar nach der Operation mit laktatringer Lösung auf Körpertemperatur erwärmt führt zu einer schnelleren Erholungszeit für die Ratte nach der Operation zu erwachen, autonome Kontrolle der Körpertemperatur zu gewinnen, und in der Lage zu trinken und zu essen.
Post-chirurgische Überwachung der Ratte ist wichtig nach der Hemisektion Chirurgie, vor allem für Anzeichen einer unsachgemäßen Micturition, Schmerzen, Infektion, Gewichtsverlust, Probleme mit der Wundheilung, oder Autophagie. Die Konsultation des Veterinärpersonals zur Bewertung und Behandlung ist bei postoperativen Komplikationen von entscheidender Bedeutung. Insbesondere können akutewirbelsäulenschocks oder unbeabsichtigte bilaterale Läsionen die Micturition stören, die zu potenziell tödlichen Infektionen führen kann. Überwachen Sie sorgfältig die Blase der Ratte nach der Operation und löschen Sie manuell dreimal pro Tag, wenn sie durch sanften Druck von der ventralen Seite der Blase, die kauarisch absteigt, voll ist. Wir verwenden weibliche Long-Evans Ratten, da sie eine deutlich kürzere und geradere Harnröhre als Männchen haben, was zu einem schnelleren Auftreten einer automatischen Harnblase, einfachere Micturition und niedrigere Raten von Harnwegsinfektionen führt2. Die Gewichte sollten ebenfalls überwacht werden, und ein Verlust von >20 % aus der Ausgangsuntersuchung der Lebensmittel- und Wasseraufnahme. Die Zähne sollten auf Maloklusion, den Bauch auf Ileus und Ratten, die geeignete Zusatzflüssigkeiten und Ernährung wie Hydrogel oder eine flüssige Ernährung erhalten, überprüft werden. Eine Zyste kann sich selten unter der Einschnittstelle bilden, die in Absprache mit dem Veterinärpersonal ohne Komplikationen mit einer Spritze sicher entleert werden kann.
Das Martinez-Verfahren zur Bewertung von Bewegungslokomotiven bietet eine einfache Technik, die keine spezielle Ausrüstung, eine präoperative Ausbildung oder Nahrungsentzug des Tieres erfordert. Die Bewertung kann so früh durchgeführt werden, wie sich das Tier von der Anästhesie erholt und kann verwendet werden, um Tiere auf geeignete Rückgewinnungsindizes (z. B. Rückgewinnung der Körpergewichtsunterstützung) zu überprüfen, wenn strengere und spezifischere Bewegungstests wie automatisierte Gangbewertung der oberirdischen Fortbewegung26,27,28, kinematische Analysen bei Laufband-Fortbewegung29,30,31,32, Gitter gehen33, und Leiter sprosse zu Fuß9,34. Wichtig ist, dass die BBB-Skala zwar nachweislich nicht linear mit der Wiederherstellung des Bewegungsapparates ist, da die Werte tendenziell um bestimmte Werte19gruppiert werden, die Martinez-Freifeld-Lokomotor-Bewertung ein lineares Bewertungsprofil während des Wiederherstellungsprozesses bietet. 10. Um zuverlässige Verhaltensdaten zu gewährleisten, ist es wichtig, die Anzahl der Störfaktoren während des Testens und der Analyse zu minimieren. Um die Variabilität während des Tests zu reduzieren, sollten Sitzungen zur gleichen Tageszeit, im selben Raum und vom gleichen Experimentator stattfinden. Die Freifeldbewertung kann zuverlässig über wiederholte Sitzungen9,10,11,12,23, aber Ratten können sich an die Umwelt über und reduzieren ihre Aktivität während der Tests, was zu einer unzureichenden Menge an Motoranfällen für die Analyse führt. Um die Unbeweglichkeit während der Tests zu überwinden, werden Ratten, die länger als 20 Sekunden stehen bleiben, in der Mitte der Arena abgeholt und ersetzt, um die Fortbewegung zu fördern. Darüber hinaus kann die Einbeziehung eines Conspezifischen in der Arena während des Tests, das zur Identifizierung gekennzeichnet ist, dazu beitragen, die Motoraktivität in der Testratte zu fördern. Um die Zuverlässigkeit bei der Lokomotorwertung zu gewährleisten, sollten zwei, vorzugsweise geblendete, die Analysen wie zuvor beschrieben10durchführen.
Abschließend beschreiben wir Methoden zur Durchführung einer thorakalen Rückenmarks-Hemisektion in der Ratte und zur Beurteilung der spontanen Hinterkiefer-Bewegungskraftleistung in einer Offenen Wiese. Obwohl ein Verfahren zur Durchführung von lateralen Halbsektionen beschrieben wurde, kann die Technik leicht angepasst werden, um entweder dorsale Halbsektionen35, gestaffelte abwechselnde Halbsektionen36,37oder vollständige Transektionen durchzuführen 38 je nach gewünschter Läsionsposition und Menge der ersparten absteigenden supraspinalen Innervation. Wichtig ist, dass die Technik auch in größeren Tiermodellen eingesetzt werden kann, einschließlich Katzen39,40,41 und nicht-menschliche Primaten6,42 mit vergleichbaren Defiziten zwischen kleinen und große Tiere, was es nützlich für die Untersuchung sowohl der neurobiologischen Mechanismen der Genesung als auch für präklinische therapeutische Tests macht.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes for Health Research (CIHR; MOP-142288) an M.M. M.M. wurde durch eine Gehaltsprämie des Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS) und A.R.B. durch ein Stipendium der FRQS unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
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