Summary
O hemisection espinal torácico do rato é um modelo valioso e reprodutível de ferimento unilateral da medula espinal para investigar os mecanismos neural da recuperação locomotora e da eficácia do tratamento. Este artigo inclui um guia detalhado passo a passo para realizar o procedimento de hemisection e avaliar o desempenho locomotor em uma arena de campo aberto.
Abstract
Ferimento da medula espinal (SCI) causa distúrbios na função motora, sensorial, e autonômica abaixo do nível da lesão. Modelos animais experimentais são ferramentas valiosas para compreender os mecanismos neurais envolvidos na recuperação locomotora após a SCI e para projetar terapias para populações clínicas. Existem vários modelos experimentais de SCI, incluindo contusão, compressão e ferimentos de transecção que são usados em uma grande variedade de espécies. Um hemisection envolve o transecção unilateral da medula espinal e interrompe todos os intervalos ascendentes e descendentes em um lado somente. O hemisection espinal produz um ferimento altamente seletivo e reprodutível em comparação às técnicas da contusão ou da compressão que é útil para investigar a plasticidade neural em caminhos poupados e danificados associados com a recuperação funcional. Nós apresentamos um protocolo detalhado passo a passo para executar um hemisection torácico no nível T8 vertebral no rato que conduz a uma paralisia inicial do hindmembro na lateral da lesão com recuperação espontânea graduada da função locomotora sobre diversos Semanas. Nós também fornecemos um protocolo de Pontuação locomotora para avaliar a recuperação funcional no campo aberto. A avaliação locomotora fornece um perfil linear da recuperação e pode ser executada cedo e repetidamente após ferimento a fim fazer exame exatamente dos animais para os pontos de tempo apropriados em que para conduzir um teste comportável mais especializado. A técnica de hemisection apresentada pode ser prontamente adaptada a outros modelos e espécies de transecção, e a avaliação locomotora pode ser utilizada em uma variedade de SCI e outros modelos de lesão para pontuar a função locomotora.
Introduction
Ferimento da medula espinal (SCI) é associado com os distúrbios severos na função motora, sensorial, e autonômica. Modelos experimentais de animais de SCI são ferramentas valiosas para compreender os acontecimentos anatômicos e fisiológicos envolvidos na patologia da SCI, para investigar os mecanismos neurais na reparação e recuperação, e para a tela para a eficácia e segurança do potencial terapêutico Intervenções. O rato é a espécie mais comumente utilizada na pesquisa SCI1. Modelos de ratos são de baixo custo, fácil de reproduzir, e uma grande bateria de testes comportamentais estão disponíveis para avaliar os resultados funcionais2. Apesar de algumas diferenças em locais do trato, a medula espinhal de ratos compartilha funções sensório-motoras globais semelhantes com mamíferos maiores, incluindo primatas3,4. Os ratos também compartilham conseqüências fisiológicas e comportamentais análoga à SCI que se relacionam com os seres humanos5. Primatas não humanos e grandes modelos animais podem proporcionar uma aproximação mais estreita da SCI humana6 e são essenciais para comprovar a segurança e eficácia do tratamento antes da experimentação humana, mas são menos comumente usados devido ao bem-estar ético e animal considerações, despesas e requisitos regulamentares7.
Os modelos da ficção científica da transecção do rato são executados pela interrupção alvejada da medula espinal com uma lesão seletiva usando uma faca da dissecção ou uma tesoura Iridectomia após um laminectomy. Comparado a um transecção completo, o transecção parcial nos resultados do rato em um ferimento menos severo, em um cuidado animal postoperative mais fácil, em uma recuperação espontânea do locomotor, e em uns modelos mais pròxima Sci nos seres humanos que é predominante incompleto com poupar parcial de tecido que conecta a medula espinal e as estruturas do supraspinal8. Um hemisection unilateral interrompe todos os intervalos ascendentes e descendentes em um lado somente, e produz deficits quantificáveis e altamente reprodutíveis do locomotor, melhorando a exploração dos mecanismos biológicos subjacentes. A conseqüência funcional a mais proeminente do hemisection é uma paralisia inicial do membro no mesmo lado e abaixo do nível da lesão com recuperação espontânea graduada da função locomotora sobre diversas semanas9,10, 11 anos de , 12. o modelo de hemisection é particularmente útil para investigar a plasticidade neural de tratos e circuitos danificados e residuais associados à recuperação funcional9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Especificamente, a hemisection realizada no nível torácico, ou seja, acima dos circuitos espinhais que controlam a locomoção do membro posterior, é particularmente útil para investigar mudanças no controle locomotor. Como uma relação não-linear existe entre a severidade da lesão e a recuperação locomotora após SCI19, o teste comportamental adequado para avaliar os desfechos funcionais é primordial em modelos experimentais.
Uma bateria abrangente de testes comportamentais está disponível para avaliar aspectos específicos da recuperação funcional do locomotor no rato2,20. Muitos testes locomotores não fornecem medidas confiáveis cedo após SCI como ratos são muito deficientes para apoiar o seu peso corporal. Uma medida do desempenho locomotor espontâneo que é sensível aos deficits cedo após ferimento, e não exige o treinamento pré-operativo ou o equipamento especializado, é benéfica a fim monitorar a recuperação locomotora para os pontos de tempo apropriados em que para suplemento de testes comportamentais especializados. O escore de avaliação de campo aberto de Martinez10, originalmente desenvolvido para avaliar o desempenho locomotor após Sci cervical no rato, é um escore ordinal de 20 pontos avaliando o desempenho locomotor global durante a locomoção espontânea do overground em um campo aberto. A pontuação é conduzida separadamente para cada membro usando uma rubrica que avalia parâmetros específicos de uma série de medidas locomotoras, incluindo movimento articular do membro, suporte de peso, posição dos dígitos, habilidades de piso, coordenação de membros posteriores, e cauda Posição. O escore de avaliação é derivado da escala de avaliação de campo aberto de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) projetada para avaliar o desempenho locomotor após a contusão torácica21. Ele é adaptado para avaliar de forma precisa e confiável tanto a função locomotora de membros posteriores quanto as do membro posterior, permite a avaliação independente dos diferentes parâmetros de pontuação que não são adaptáveis com a pontuação hierárquica do BBB, e fornece uma recuperação linear do perfil10. Adicionalmente, em comparação com o BBB, o escore de avaliação é sensível e confiável em modelos de lesão mais graves10,11,20,22. O escore de avaliação tem sido utilizado para avaliar o comprometimento locomotor no rato após10,12 cervicais e9 de Sci torácica isoladamente e em combinação com lesão cerebral traumática23.
Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado passo a passo para executar um hemisection torácico SCI no nível T8 vertebral no rato longo-Evans fêmea, e para avaliar a recuperação do locomotor do hindmembro no aberto-campo.
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Protocol
Os experimentos descritos neste artigo foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense de cuidado animal e foram aprovados pelo Comitê de ética da Université de Montréal.
1. cirurgia de hemisection torácica
- Use o equipamento de proteção apropriado (luvas, máscara, e vestido) para manter um ambiente asséptico para a cirurgia. Limpe a área cirúrgica com toalhetes de álcool e coloque cortinas cirúrgicas estéreis sobre o campo cirúrgico. Esterilizar ferramentas cirúrgicas e colocar no campo cirúrgico.
- Anestesie o rato uma mistura de gás isoflurano (3% de indução, 0,5 − 3% de manutenção) e oxigénio (1 L/min). Confirme a profundidade anestésica cirúrgica apropriada verificando a ausência de pitada do dedo do pé e de respostas do reflexo córneo. Monitore continuamente o rato durante todo o procedimento, e ajuste a quantidade de entrega anestésica como exigido para manter a profundidade anestésica cirúrgica.
- Depilar o tronco dorsal entre o quadril e o pescoço, coloque o rato no campo cirúrgico, desinfete o local da incisão com toalhetes de álcool e solução de proviodina, e mantenha a temperatura corporal central a 37 ° c usando uma almofada de aquecimento controlada por feedback monitorada por retal Termômetro.
- Coloque pomada oftálmicas nos olhos para mantê-los hidratados e reaplicar durante a cirurgia, conforme necessário.
- Faça uma incisão de 2,5 cm na pele que sobrepondo as vértebras T6 − T10 com um bisturi. Retrair a pele e a gordura superficial usando tesouras de dissecção contundente.
Nota: os segmentos vertebrais T6-T10 podem ser identificados rostralmente pela palpação delicada dos segmentos espinais dorsais da base do crânio que partem da protuberância notável da vértebra torácica de 2ND 24, ou caudalmente por palpação da costela flutuante mais posterior que induzirá o movimento na 13ª vértebras torácicas. - Separe os músculos paravertebrais que inserem no aspecto dorsal das vértebras de T7 − T9 usando tesouras de dissecção contundente e um retrator de retenção. Debride e limpe todo o tecido restante usando o fórceps fino e os aplicadores derrubados algodão para expor os processos espinhoso e os laminae vertebrais.
Nota: isto, e as seguintes etapas são ajudada extremamente pela visualização microscópica (~ 5 − 15x). - Corte cuidadosamente as facetas (articulações zygapophysial) bilateralmente nas vértebras T7 e T8 com aparadores ósseos delicados. Corte o tecido conjuntivo dorsal entre as lâminas T8 e T9 vertebrais superficialmente com um bisturi (1 mm de profundidade), sendo cuidadoso para não ferir o cabo de underpostura.
- Retire o processo esposo da vértebra T8 com aparadores ósseos. Com o fórceps hemostático curvo cuidadosamente apertado no processo espícuo T7, gire a extremidade caudal das lâminas T8 ligeiramente rostralmente (~ 20 °), insira os aparadores ósseos a lâmina T8 e faça um corte de linha média estendendo-se ao longo da lâmina. Continuar a laminectomia, repetindo os cortes no lado esquerdo e direito da lâmina vertebral medial para os processos transversais para expor a medula espinhal.
Nota: tenha cuidado para remover todos os fragmentos ósseos criados a partir da laminectomia. - Lidocaine do gotejamento (2%, 0,1 ml) no canal espinal expor e remove o dura que sobrepondo o segmento espinal T8 usando o fórceps fino e a tesoura Iridectomia. Repita a administração do Lidocaine ao cabo exposto e identifique o Midline do cabo pela visualização de uma linha de centro criada entre os processos espinhoso que estendem entre a vértebra T7 − T9 expor.
Nota: juntamente com os processos espessas em T7 e T9, os gânglios da raiz dorsal expostos em T8 também pode ser usado para ajudar a identificação da linha média e uma agulha de 30 G pode ser colocada na linha média do cordão para ajudar com a subsequente hemisection. - Hemisect a medula espinal do midline para o um lado com uma faca de dissecação. Tenha cuidado para não cortar a artéria espinhal anterior no lado ventral (não aplique pressão firme no corpo vertebral). Usando a tesoura Iridectomia, corte com cuidado através de todo o tecido restante no lado lesados da medula espinal para assegurar o quadrante ventrolateral é transected apropriadamente.
- Coloc a esponja hemostática Saline-embebido estéril (~ 6 x 2 milímetros) na cavidade exposta acima da medula espinal e suturar as camadas do músculo (4-0 Poliglactina 910). Em seguida, sutura a pele ao redor do local da incisão.
- Fornecer analgésico adequado (buprenorfina 0, 5 mg/kg subcutâneo [s.c.]), antibiótico (enrofloxacina, 10 mg/kg s.c.), e repor líquidos perdidos com solução de Ringer Ringer 5 cc (intraperitoneal [i.p.]) imediatamente após a cirurgia.
- Retire o rato da anestesia. Coloc o rato em um ambiente morno uma almofada ou uma lâmpada de aquecimento (~ 33 ° c) até que o animal esteja acordado inteiramente.
- Fornecer analgesia suplementar diariamente durante os primeiros 3 dias pós-cirúrgicos e monitorar continuamente para sinais de dor, perda de peso, micção inadequada, infecção, problemas com a cicatrização de feridas, ou autophagia.
2. procedimento de teste de campo aberto e pontuação de desempenho locomotor
- Manuseie ratos diariamente durante 1 semana e habituate-os à arena durante duas sessões de 5 min antes do teste para aclimatizar a ser recolhido, suavemente a partir do tronco médio, enquanto no campo aberto e para garantir a fiabilidade da medição durante o teste.
- Coloc uma câmera no nível à terra que enfrenta a arena circular do campo aberto do plexiglass para gravar sessões de teste para a análise fora de linha (30 − 60 frames/s mínimos).
- Iniciar a gravação de vídeo e colocar o rato no centro da arena condições de luz fraca para incentivar a atividade locomotora.
- Continue a sessão do teste por 4 minutos para assegurar uma quantidade adequada de crises locomotoras para a análise. Pegue e substitua os ratos no centro da arena quando eles permanecem estacionários por mais de 20 s para promover a locomoção.
- Score desempenho locomotor da sessão de testes gravados, completando a rubrica fornecida emTabela 1de acordo com os parâmetros nas subseções a seguir.
Nota: é útil para marcar cada parâmetro separadamente pela visualização repetida da sessão de teste gravada usando software que permite a velocidade de reprodução variável e análise frame-by-frame (por exemplo, VLC Media Player).- Para os movimentos articulares do membro, os movimentos da articulação do membro posterior do escore durante a locomoção espontânea separadamente para o tornozelo, joelho e quadril como normal (mais da metade da amplitude de movimento, pontuação atribuída = 2), ligeira (menos da metade da amplitude de movimento, pontuação atribuída = 1), ou ausente (pontuação atribuída = 0).
- Para o suporte de peso, avaliar a capacidade de músculos extensores do membro posterior para contrair e suportar o peso corporal carregado quando o membro está no chão separadamente para quando o rato está parado, bem como durante a locomoção ativa. Premiar uma pontuação de 1 quando o suporte de peso está presente e uma pontuação de 0 quando o suporte de peso está ausente.
Nota: suporte de peso estacionário é considerado um perquisite para suporte de peso ativo. - Para a posição dos dígitos, avalie a posição dos dígitos do membro posterior enquanto o rato está parado e durante a locomoção. Atribuir uma pontuação de 2 quando os dígitos do membro posterior são estendidos, espaçados para além de um outro, e tónico durante a locomoção em mais de 50% do período de teste (considerado normal). Premiar uma pontuação de 1 quando os dígitos permanecem predominantemente flexionados e uma pontuação de 0 quando os dígitos permanecem predominantemente atônicos.
- Para pisar, termine este parâmetro somente se o rato puder suportar seu peso de corpo durante pisar. Avalie a piscada classificando a orientação da colocação da pata do membro posterior na altura do contato inicial e no elevador fora da terra além do que a fluidez da fase do balanço durante pisar.
Nota: existem 3 pontuações para este parâmetro descritos nas seguintes subseções avaliando separadamente: 1) a orientação axial da colocação da pata no contato do membro (colocação dorsal/plantar), 2) a orientação longitudinal da colocação da pata no contato inicial e durante o elevador (paralelo ao eixo do corpo ou girado internamente/externamente), e 3) a qualidade do movimento do membro durante o balanço (regular ou irregular).- Para a colocação da pata no contato do membro, marcar a orientação axial da colocação da pata no contato do membro como 0 quando os posicionamentos dorsais ocorrerem em mais de 50% das etapas.
Nota: a colocação plantar é considerada um perquisite para marcar a orientação da pata no contato e no elevador (etapa 2.5.4.2), movimento do balanço (etapa 2.5.4.3) e coordenação do membro do forelimb-hindin (etapa 2.5.5). - Para a orientação da pata no contato e no elevador do membro, a concessão uma contagem de 2 quando os machados longitudinais da pata e do corpo são paralelos e uma contagem de 1 quando o membro é girado externamente ou internamente, separada para o contato e o elevador do membro.
- Para o movimento do balanço, a concessão uma contagem de 2 quando as junções do hindmembro movem-se em uma maneira harmoniosa e regular durante o balanço e em uma contagem de 1 quando os movimentos jerky ou espasmódico das junções ocorrem durante o balanço.
- Para a colocação da pata no contato do membro, marcar a orientação axial da colocação da pata no contato do membro como 0 quando os posicionamentos dorsais ocorrerem em mais de 50% das etapas.
- Para a coordenação de membros posteriores, conclua este parâmetro somente se 4 etapas consecutivas ocorrerem durante o teste e se os membros podem suportar ativamente o peso corporal. Premiar uma pontuação de 3 quando a coordenação é consistente (> 90% das etapas), 2 quando freqüentes (50 − 90% das etapas), 1 quando ocasional (< 50% das etapas), ou 0 quando ausente (0% das etapas).
Nota: a coordenação do membro posterior é definida como uma alternância regular no passo entre o membro posterior que está sendo pontuado e o membro torácico no mesmo lado do corpo. - Para a posição da cauda, avalie a posição da cauda durante a locomoção como para cima (fora do solo, pontuação atribuída = 1) ou para baixo (tocando o chão, premiado Pontuação = 0).
Nota: uma posição elevada da cauda durante a locomoção é um indicador da estabilidade do tronco no rato. Após o hemisection, a cauda é prendida normalmente perto ou tocando a terra como a estabilidade do tronco é danificada. - Adicione as pontuações individuais de cada parâmetro para fornecer um total para cada membro posterior de um máximo de 20 pontos.
Nota: uma pontuação de 20 indica o desempenho locomotor normal. Os escores < 20 representam quantidades crescentes de comprometimento locomotor e um escore de 0 indica paralisia do membro.
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Representative Results
Lesões reprodutíveis com alto grau de consistência podem ser geradas com a técnica de hemisection. Para avaliar e comparar os tamanhos das lesões entre os grupos experimentais, a área máxima da lesão como uma porcentagem do cross-section total da medula espinal pode prontamente ser calculada com mancha histológica de seções da medula espinal. A Figura 1 mostra uma lesão representativa do hemicord esquerdo e uma sobreposição da proporção da área máxima da lesão compartilhada entre ratos com um tamanho médio de lesão de 47,3% ± 4,0% da área do cordão transversal (n = 6).
Figura 1: lesões representativas da coluna vertebral. (A) Microfotografia de uma seção espinal coronal no epicentro da lesão de um rato homem manchado com violeta do cresil (corpos da pilha, roxo) e azul rápido do luxol (myelin, azul) que indica dano à matéria cinzenta e branca concentrada na esquerda hemicord. D, dorsal; V, ventral; L, esquerda; R, certo. Barra de escala: 1 mm. (B) sobreposição esquemática da proporção compartilhada da área máxima da lesão em um grupo de ratos (n = 6). A posição do intervalo corticospinal cruzado no funiculus dorsal no lado direito é protegida no preto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A principal consequência da hemisecção é a paralisia inicial do membro posterior do lado da lesão durante os primeiros dois a três dias de pós-operatório. O desempenho locomotor do hindmembro mais afetado melhora ràpida no rato após o hemisection sobre as primeiras semanas após ferimento. Os deficits pequenos no hindmembro oposto são observados geralmente inicialmente após o hemisection que pode refletir a compensação para o membro mais afetado, ou os deficits resultando de uma falta da estabilidade postural, da sustentação do peso, e de pisar consistente. Um deficit grande e persistindo no hindmembro oposto indicaria uma lesão bilateral que estende no hemicord opondo.
Uma rubrica de Pontuação de desempenho locomotor de amostra é fornecida na tabela 1.
Tabela 1: folha de pontuação da amostra. Amostra de desempenho locomotor Pontuação rubrica. Para cada parâmetro, as pontuações possíveis são indicadas entre parênteses. I, interno; E, externo; P, paralelo; FL-HL, forelimb-hindmembro. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
O tempo de mudanças representativas no desempenho locomotor no estado intacto e nas primeiras cinco semanas após uma hemisecção do lado esquerdo em grupos separados de ratos (n = 6 por grupo) é representado na Figura 2.
Figura 2: Curso representativo do tempo das mudanças no desempenho locomotor do hindmembro no aberto-campo no estado intacto e por cinco semanas após um hemisection torácico do lado esquerdo. O desempenho do membro posterior esquerdo (a) é prejudicado significativamente dos valores intactos durante as primeiras três semanas após a hemisection, e do membro posterior direito (B) durante a primeira semana após o hemisection. Os dados são plotados como média do grupo ± desvio padrão (DP; n = 6 por grupo). As análises estatísticas foram realizadas com testes não paramétricos de Kruskal-Wallis suplementados com os testes de comparação múltipla de Dunn para avaliar as diferenças de grupo entre os pontos temporais. *p < 0, 5, * * *p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A maior força da técnica de hemisection é a seletividade e reprodutibilidade da lesão que leva à redução da variabilidade nos fenótipos histológicos e comportamentais entre os animais25. A fim assegurar uma lesão unilateral a nível espinal apropriado, a identificação exata do segmento vertebral apropriado e do midline da medula espinal é crítica. Como pode haver uma tendência para a medula espinhal girar na direção do corte durante o procedimento de hemisection, pode ser benéfico estabilizar o cordão delicadamente com pinça fina colocada em ambos os lados durante o procedimento. Coloc o rato em um frame Stereotaxic com a cauda gravada delicadamente a tensão clara pode ajudar com a estabilidade e o alinhamento vertebral apropriado durante o procedimento. Uma braçadeira espinal unida ao frame Stereotaxic e a um processo espinhoso podem igualmente ser usadas para realçar a estabilidade da coluna vertebral, mas nós achamos que sua presença pode restringir o acesso ao cabo com ferramentas cirúrgicas e exige ângulos de aproximação inábeis durante Cirurgia. É igualmente essencial remover todos os fragmentos do osso deixados no canal espinal do laminectomy porque podem causar ferimento de compressão indesejado ao cabo e promover dano secundário.
Os ratos devem ser constantemente observados durante a cirurgia para monitorar os sinais vitais necessários, como a temperatura do núcleo e a respiração, pois a hipotermia é uma das principais causas de mortalidade durante a administração da anestesia e, inicialmente, após a cirurgia. Regulação da temperatura corporal do núcleo com uma sonda retal e almofada de aquecimento controlado por feedback pode evitar muito as complicações da temperatura. Um oxímetro de pulso também pode ser usado para monitorar a oxigenação do sangue e a frequência cardíaca para regular a profundidade anestésica. Nós achamos que o reabastecimento de fluido imediatamente após a cirurgia com solução de lactato Ringer aquecido à temperatura do corpo resulta em um tempo de recuperação mais rápido para o rato para acordar após a cirurgia, recuperar o controle autonômico da temperatura do corpo, e ser capaz de beber e comer.
A monitoração post-Surgical do rato é essencial após a cirurgia do hemisection, especial para sinais do micturition impróprio, da dor, da infecção, da perda de peso, dos problemas com Healing da ferida, ou do autophagia. A consulta com o pessoal veterinário para avaliação e tratamento é crucial em situações de complicações pós-cirúrgicas. Em particular, o choque espinal agudo ou as lesões bilaterais não intencionais podem interferir com o micção que pode conduzir às infecções potencial fatais. Monitore com cuidado a bexiga do rato após a cirurgia e anular manualmente três vezes por o dia se cheio pela pressão delicada do lado ventral da bexiga que desce caudally. Nós usamos ratos fêmeas de Long-Evans porque têm uma uretra significativamente mais curta e mais reta do que machos que conduz a um início mais rápido de uma bexiga urinária automática, a um micturition mais fácil, e a umas mais baixas taxas de infecções de aparelho urinário2. Os pesos também devem ser monitorados e uma perda > 20% do valor inicial justifica a investigação sobre a ingestão de alimentos e água. Os dentes devem ser verificados para a má oclusão, o abdômen para o íleo, e os ratos dados os líquidos e a nutrição complementares apropriados tais como o hidrogel ou uma dieta líquida. Um cisto raramente pode se formar o local da incisão que pode ser drenado com segurança com uma seringa sem complicação em consulta com a equipe veterinária.
O procedimento de avaliação do locomotor de campo aberto de Martinez fornece uma técnica simples que não exija nenhum equipamento especializado, treinamento pré-operativo, ou privação de alimento do animal para executar. A avaliação pode ser realizada tão cedo quanto o animal se recupera da anestesia e pode ser usado para a tela de animais para os índices de recuperação adequados (por exemplo, recuperação do peso corporal apoio) quando mais rigoroso e específico locomotor testes podem ser suplementados como avaliação automatizada da marcha da locomoção overground26,27,28, análises cinemáticas durante a locomoção da esteira rolante29,30,31,32, grade andando33, e escada degrau andando9,34. Importante, enquanto a escala BBB tem sido mostrada para não ser linear com a recuperação locomotora como pontuações tendem a agrupar em torno de certos valores19, a avaliação de locomotor de campo aberto Martinez fornece um perfil de Pontuação linear durante o processo de recuperação 10. para garantir dados comportamentais confiáveis, é importante minimizar o número de confundidores durante o teste e a análise. Para ajudar a reduzir a variabilidade durante o teste, as sessões devem ocorrer na mesma hora do dia, na mesma sala, e pelo mesmo experimentador. A avaliação em campo aberto pode ser realizada de forma confiável em sessões repetidas9,10,11,12,23, mas os ratos podem tornar-se habituados ao ambiente ao longo tempo e reduzir sua atividade durante os testes, resultando em uma quantidade inadequada de crises locomotoras para análise. Para superar a imobilidade durante os testes, os ratos que permanecem estacionários por mais de 20 segundos são apanhados e substituídos no centro da arena para promover a locomoção. Adicionalmente, incluir um conspecific na arena durante o teste que é marcado para a identificação pode ajudar a promover a atividade locomotora no rato do teste. Para assegurar a confiabilidade no locomotor que Marc dois avaliadores, preferivelmente cegos, deve conduzir as análises como descritas previamente10.
Em conclusão, nós descrevemos métodos para conduzir um hemisection torácico da medula espinal no rato e em avaliar o desempenho espontâneo do locomotor do hindmembro em uma arena do aberto-campo. Embora um procedimento para a realização de hemisections laterais fosse descrito, a técnica pode prontamente ser adaptada para executar o hemisections dorsal35, as hemisections alternas alternadas36,37, ou transections cheios 38 dependendo da localização da lesão desejada e da quantidade de inervação supraspinal descendente poupada. É importante ressaltar que a técnica também pode ser usada em modelos animais maiores, incluindo gatos39,40,41 e primatas não humanos6,42 com déficits comparáveis observados entre pequenas e grandes animais, tornando-o útil para investigar os mecanismos neurobiológicos de recuperação e para o teste terapêutico pré-clínico.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR; MOP-142288) para m. h. foi apoiado por um prêmio de salário de Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS), e A. R. B foi apoiado por uma bolsa da FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
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