Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

جراحة استئصال النخاع الشوكي للحبل الشوكي وتقييم المحرك الحركي المفتوح في الفئران

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59738
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Neurosciences, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 2Hôpital du Sacré-Cœur de Montréal, 3Groupe de Recherche sur le Système Nerveux Central (GRSNC), Université de Montréal

Summary

استئصال النخاع الشوكي الصدري الفئران هو نموذج قيّم واستنساخي لإصابة الحبل الشوكي من جانب واحد للتحقيق في الآليات العصبية للشفاء الحركي وفعالية العلاج. تتضمن هذه المقالة دليل مفصل خطوة بخطوة لتنفيذ إجراء استئصال الفص وتقييم الأداء الحركي في ساحة مفتوحة.

Abstract

تسبب إصابة الحبل الشوكي (SCI) اضطرابات في الوظائف الحركية والحسية واللاإرادية دون مستوى الآفة. النماذج الحيوانية التجريبية هي أدوات قيمة لفهم الآليات العصبية المشاركة في الانتعاش الحركي بعد SCI وتصميم العلاجات للسكان السريرية. هناك العديد من نماذج SCI التجريبية بما في ذلك الكدمة، والضغط، وإصابات المقطع التي تستخدم في مجموعة واسعة من الأنواع. ينطوي تشريح الاستئصال على تشريح أحادي الجانب للحبل الشوكي ويعطل جميع المسالك الصاعدة والتنازلية على جانب واحد فقط. ينتج استئصال النخاع الشوكي إصابة انتقائية للغاية وقابلة للاستنساخ بالمقارنة مع تقنيات الكدمة أو الضغط التي هي مفيدة للتحقيق في اللدونة العصبية في المسارات المنفلتة والتالفة المرتبطة بالانتعاش الوظيفي. نقدم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإجراء استئصال الأنسجة الصدريعلى مستوى الفقرات T8 في الفئران الذي يؤدي إلى شلل أولي للأطراف الخلفية على جانب الآفة مع الانتعاش التلقائي متدرج من وظيفة الحركية على مدى عدة اسابيع. كما نقدم بروتوكول تسجيل نقاط الحركية لتقييم الانتعاش الوظيفي في المجال المفتوح. يوفر التقييم الحركي ملف ًا تعريفًا خطيًا للتعافي ويمكن إجراؤه في وقت مبكر ومتكرر بعد الإصابة من أجل فحص الحيوانات بدقة للحصول على نقاط زمنية مناسبة لإجراء اختبارات سلوكية أكثر تخصصًا. ويمكن تكييف تقنية تشريح الاستئصال المقدمة بسهولة مع نماذج وأنواع أخرى من الاستئصال، ويمكن استخدام التقييم الحركي في مجموعة متنوعة من SCI ونماذج الإصابة الأخرى لتسجيل وظيفة المحرك الحركي.

Introduction

ترتبط إصابة الحبل الشوكي (SCI) باضطرابات شديدة في الوظائف الحركية والحسية واللاإرادية. النماذج الحيوانية التجريبية من SCI هي أدوات قيمة لفهم الأحداث التشريحية والفسيولوجية التي تنطوي عليها علم الأمراض SCI، للتحقيق في الآليات العصبية في الإصلاح والتعافي، وللفحص لفعالية وسلامة العلاجية المحتملة التدخلات. الفئران هي الأنواع الأكثر استخداما في البحوث SCI1. نماذج الفئران منخفضة التكلفة، وسهلة التكاثر، وبطارية كبيرة من الاختبارات السلوكية متاحة لتقييم النتائج الوظيفية2. على الرغم من بعض الاختلافات في مواقع المسالك، والحبل الشوكي الفئران يشارك وظائف الحسية مماثلة عموما مع الثدييات أكبر، بما في ذلك الرئيسيات3،4. الفئران أيضا حصة العواقب الفسيولوجية والسلوكية مماثلة لSCI التي تتعلق البشر5. يمكن أن توفر الرئيسيات غير البشرية والنماذج الحيوانية الكبيرة تقريبًا تقريبًا تقريبًا من SCI6 البشري وهي ضرورية لإثبات سلامة العلاج وفعاليته قبل التجارب البشرية، ولكنها أقل شيوعًا بسبب الرعاية الأخلاقية والحيوانية الاعتبارات والنفقات والمتطلبات التنظيمية7.

يتم تنفيذ نماذج SCI تشريح الفئران عن طريق انقطاع المستهدفة من الحبل الشوكي مع آفة انتقائية باستخدام سكين تشريح أو مقص استئصال القزحية بعد استئصال الصفيحة. بالمقارنة مع تشريح كامل، تشريح جزئي في الفئران يؤدي إلى إصابة أقل شدة، أسهل الرعاية الحيوانية بعد العملية الجراحية، والانتعاش الحركي التلقائي، وأكثر عن كثب نماذج SCI في البشر التي هي في الغالب غير مكتملة مع تجنيب جزئي من الأنسجة التي تربط الحبل الشوكيوالهياكل فوق الشوكي8 . ويعطل تشريح الفص اللاإحادي جميع المساحات الصاعدة والمنحدرة على جانب واحد فقط، وينتج عن عجز في المحركات يمكن قياسه كمياً وشديد الانحراف، مما يعزز استكشاف الآليات البيولوجية الأساسية. النتيجة الوظيفية الأبرز للاستئصال هو شلل الأطراف الأولي على نفس الجانب وتحت مستوى الآفة مع الانتعاش التلقائي متدرج من وظيفة الحركية على مدى عدة أسابيع9،10، 11 , 12.نموذج تشريح الاستئصال مفيد بشكل خاص للتحقيق في اللدونة العصبيةمن المسالك التالفة والمتبقية والدوائر المرتبطة الانتعاش الوظيفي 9،11،12، 13،14،15،16،17،18. على وجه التحديد، استئصال النخاع الذي يتم إجراؤه على مستوى الصدر، أي فوق الدوائر الشوكية التي تتحكم في الحركة الخلفية، مفيد بشكل خاص للتحقيق في التغيرات في التحكم الحركي. كما توجد علاقة غير خطية بين شدة الآفة والانتعاش الحركي بعد SCI19، والاختبار السلوكي المناسب لتقييم النتائج الوظيفية أمر بالغ الأهمية في النماذج التجريبية.

تتوفر بطارية شاملة من الاختبارات السلوكية لتقييم جوانب محددة من الاسترداد الحركي الوظيفي في الفئران2،20. العديد من الاختبارات الحركية لا توفر تدابير موثوق بها في وقت مبكر بعد SCI كما يتم تعطيل الفئران جداً لدعم وزن الجسم. مقياس الأداء الحركي التلقائي الذي هو حساس للعجز في وقت مبكر بعد الإصابة، ولا يتطلب التدريب قبل الجراحة أو المعدات المتخصصة، مفيد من أجل رصد الانتعاش الحركي للنقاط الزمنية المناسبة التي تكملة الاختبارات السلوكية المتخصصة. ومارتينيز في مجال مفتوح التقييم النتيجة10، وضعت أصلا لتقييم الأداء الحركي بعد SCI عنق الرحم في الفئران ، هو 20 نقطة درجة ordinal تقييم الأداء الحركي العالمي خلال الحركة فوق الأرض عفوية في حقل مفتوح. يتم إجراء التهديف بشكل منفصل لكل طرف باستخدام قاعدة تقيّم المعلمات المحددة لمجموعة من التدابير الحركية بما في ذلك حركة الأطراف المفصلية، ودعم الوزن، ووضع الأرقام، وقدرات الخطوات، وتنسيق الأطراف الخلفية، والذيل موقف. درجة التقييم مستمدة من مقياس تصنيف باسو وبيتي وبريسناهان (BBB) المفتوح المدى المصمم لتقييم الأداء الحركي بعد كدمة الصدر21. يتم تكييفها لتقييم دقيق وموثوق بها على حد سواء وظيفة اللوكوموتور، ويسمح لتقييم مستقل لمختلف المعلمات التهديف التي لا يمكن أن تكون قابلة للحصول على سجل هرمي من BBB، ويوفر الانتعاش الخطي الملف الشخصي10. بالإضافة إلى ذلك، بالمقارنة مع BBB، درجة التقييم حساسة وموثوق بها في نماذج الإصابات أكثر شدة10،11،20،22. وقد استخدمت درجة التقييم لتقييم ضعف الحركية في الفئران بعد عنق الرحم10،12 والصدر9 SCI وحدها وبالاشتراك مع إصابات الدماغ الصادمة23.

نقدم هنا بروتوكولاً مفصلاً خطوة بخطوة لإجراء عملية استئصال الأنسجة الصدرية SCI على مستوى الفقرات T8 في الفئران ذات الأطراف الطويلة، ولتقييم تعافي اللورومي الخلفي في الحقل المفتوح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت التجارب الموصوفة في هذه المقالة وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في جامعة مونتريال.

1. جراحة استئصال الأنف الصدري

  1. ارتداء معدات واقية مناسبة (القفازات، قناع، وثوب) للحفاظ على بيئة مطهرة للجراحة. تنظيف المنطقة الجراحية مع مناديل الكحول، ووضع الستائر الجراحية العقيمة على المجال الجراحي. تعقيم الأدوات الجراحية ومكان في المجال الجراحي.
  2. التخدير الفئران تحت خليط من غاز الإسفلوران (3٪ التعريفي، 0.5-3٪ صيانة) والأكسجين (1 لتر / دقيقة). تأكد من عمق التخدير الجراحي السليم عن طريق التحقق من عدم وجود قرصة اصبع القدم والاستجابات المنعكسة القرنية. مراقبة الفئران باستمرار خلال العملية بأكملها، وضبط كمية الولادة مخدر كما هو مطلوب للحفاظ على عمق التخدير الجراحي.
  3. اقطع الجذع الظهري بين الورك والرقبة، وضع الفأر في المجال الجراحي، وتطهير موقع الشق بمناديل الكحول وحل بروفيوديود، والحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة يتم التحكم فيها بواسطة المستقيم الحراره.
  4. ضع مرهم العيون على العينين للحفاظ على ترطيبها وإعادة تطبيقها في جميع أنحاء الجراحة كما هو مطلوب.
  5. قم بعمل شق بحجم 2.5 سم في الجلد يتراكب مع الفقرات T6−T10 مع مشرط. سحب الجلد والدهون السطحية باستخدام مقص تشريح حادة.
    ملاحظة: يمكن تحديد الأجزاء الفقرية T6−T10 إما عن طريق الجس لطيف من الأجزاء الشوكية الظهرية من قاعدة الجمجمة بدءا ً من البروز الملحوظ للفقرات الصدريةالثانية 24، أو بواسطة caudally جس الضلع العائم الأكثر الخلفي الذي سوف تحفز الحركة في الفقرات الصدرية 13.
  6. افصل العضلات شبه الفقرية التي تدخل على الجانب الظهري من فقرات T7−T9 باستخدام مقص تشريح حاد وجرار ذاتي الاحتفاظ. إزالة العروس ومسح أي الأنسجة المتبقية باستخدام ملقط غرامة والقطن يميل التطبيقات لفضح العمليات الشائكة ولامينا الفقرات.
    ملاحظة: هذا، والخطوات التالية يساعدها إلى حد كبير التصور المجهري (~ 5−15x).
  7. قطع بعناية الأوجه (المفاصل zygapophysial) ثنائيا على الفقرات T7 و T8 مع الانتهازي العظام الحساسة. قطع النسيج الضام الظهري بين T8 و T9 laminae الفقرات سطحيا مع مشرط (عمق 1 ملم) الحرص على عدم إصابة الحبل تحت.
  8. إزالة العملية العرضية من الفقرة T8 مع الانتهازي العظام. مع ملقط الهيموستاتيك المنحنية فرضت بعناية على عملية سبينوس T7، تدوير نهاية caudal من Laminae rostrally قليلا (~ 20 درجة)، إدراج الانتهازي العظام تحت لامينا T8، وجعل قطع خط الوسط تمتد على طول لامينا. مواصلة استئصال الصفيحة عن طريق تكرار التخفيضات على الجانب الأيسر والأيمن من اللامينا الفقراتي ة إلى العمليات العرضية لفضح الحبل الشوكي.
    ملاحظة: كن حذراً لإزالة كافة شظايا العظام التي تم إنشاؤها من استئصال الصفيحة.
  9. ليدوكائين بالتنقيط (2٪، 0.1 مل) في القناة الشوكية المكشوفة وإزالة دورا تراكب الجزء الشوكي T8 باستخدام ملقط غرامة ومقص استئصال القزحية. كرر إدارة الليدوكائين إلى الحبل المكشوف وحدد خط الوسط للسلك من خلال تصور خط الوسط الذي تم إنشاؤه بين العمليات العرضية التي تمتد بين الفقرات T7−T9 المكشوفة.
    ملاحظة: جنبا إلى جنب مع العمليات العرضية على T7 و T9، يمكن أيضا استخدام العقد الجذرية الظهرية المكشوفة على T8 للمساعدة في تحديد خط الوسط ويمكن وضع إبرة 30 G في خط الوسط من الحبل للمساعدة في استئصال النخاع اللاحقة.
  10. استئصال الحبل الشوكي من خط الوسط نحو جانب واحد بسكين تشريح. يجب الحرص على عدم قطع من خلال الشريان الشوكي الأمامي على الجانب البطني (لا تطبق ضغط ثابت على الجسم الفقري). باستخدام مقص استئصال القزحية، قطع بعناية من خلال أي الأنسجة المتبقية على الجانب الآفة من الحبل الشوكي لضمان مقطع ية البطين بشكل مناسب.
  11. ضع الاسفنج الهيموستاتيك المعقمة المنقوع بالمالحة (~6 × 2 مم) في التجويف المكشوف فوق الحبل الشوكي وخياطة طبقات العضلات (4-0 بوليغلكتين 910). بعد ذلك، خياطة الجلد حول موقع الشق.
  12. توفير مسكن كاف (البوبرينورفين 0.05 ملغ / كغ تحت الجلد [s.c.])، والمضادات الحيوية (enrofloxacin، 10 ملغ / كغ s.c.)، وتجديد السوائل المفقودة مع 5 سم مكعب محلول الرنين الرضاعة (داخل الصفاق [i.p.]) مباشرة بعد الجراحة.
  13. إزالة الفئران من التخدير. ضع الجرذ في بيئة دافئة تحت وسادة التدفئة أو المصباح (~ 33 درجة مئوية) حتى يستيقظ الحيوان تماما.
  14. توفير التسكين التكميلي يوميا على مدى الأيام الثلاثة الأولى بعد الجراحة ومراقبة باستمرار لعلامات الألم، وفقدان الوزن، micturition غير لائق، والعدوى، ومشاكل مع التئام الجروح، أو autophagia.

2. إجراء الاختبار في الميدان المفتوح وسجل الأداء الحركي

  1. التعامل مع الفئران يوميا لمدة أسبوع واحد والعادة لهم إلى الساحة لمدة دورتين 5 دقيقة قبل اختبار للتأقلم إلى أن التقطت، بلطف من منتصف الجذع، بينما في الميدان المفتوح وضمان موثوقية القياس أثناء الاختبار.
  2. ضع كاميرا على مستوى الأرض تواجه ساحة المجالات المفتوحة في زجاج شبكي دائري لتسجيل جلسات الاختبار للتحليل دون اتصال (30-60 إطار/ث كحد أدنى).
  3. بدء تسجيل الفيديو ووضع الفئران في وسط الساحة تحت ظروف الضوء الخافت لتشجيع النشاط الحركي.
  4. استمر في جلسة الاختبار لمدة 4 دقائق لضمان كمية كافية من نوبات المحرك للتحليل. التقاط واستبدال الفئران في وسط الساحة عندما تبقى ثابتة لفترة أطول من 20 ق لتعزيز الحركة.
  5. تسجيل الأداء الحركي لجلسة الاختبار المسجلة من خلال إكمال القاعدة المقدمة فيالجدول 1وفقا للمعلمات في الأقسام الفرعية التالية.
    ملاحظة: من المفيد تسجيل كل معلمة بشكل منفصل عن طريق عرض متكرر لجلسة الاختبار المسجلة باستخدام البرامج التي تسمح لسرعة التشغيل المتغيرة وتحليل إطار بإطار (على سبيل المثال، مشغل وسائط VLC).
    1. بالنسبة لحركات الأطراف المفصلية، يسجل حركات المفاصل الخلفية أثناء الحركة التلقائية بشكل منفصل للكاحل والركبة والورك إما كأمر طبيعي (أكثر من نصف نطاق الحركة، والنتيجة الممنوحة = 2)، طفيفة (أقل من نصف نطاق الحركة، والنتيجة الممنوحة = 1)، أو غائبة (النتيجة الممنوحة = 0).
    2. لدعم الوزن، تقييم قدرة العضلات الموسعة الخلفية على التعاقد ودعم وزن الجسم المحملة عندما يكون الطرف على الأرض بشكل منفصل عندما يكون الفئران ثابتة وكذلك أثناء الحركة النشطة. منح درجة 1 عندما يكون دعم الوزن موجودا ً ودرجة 0 عند غياب دعم الوزن.
      ملاحظة: يعتبر دعم الوزن الثابت perquisite لدعم الوزن النشط.
    3. بالنسبة للموضع الرقمي، قم بتقييم موضع الأرقام الخلفية بينما يكون الجرذ ثابتًا وأثناء الحركة. منح درجة 2 عندما يتم تمديد الأرقام الخلفية، متباعدة بعيدا عن بعضها البعض، ومنشط أثناء الحركة في أكثر من 50٪ من فترة الاختبار (تعتبر طبيعية). منح درجة 1 عندما تبقى الأرقام في الغالب فليكس ودرجة 0 عندما تبقى الأرقام في الغالب atonic.
    4. للخطوة، أكمل هذه المعلمة فقط إذا كان الجرذ يمكنه دعم وزن الجسم أثناء التنقل. تقييم خطوة من خلال تصنيف اتجاه وضع مخلب الطرف الخلفي في وقت الاتصال الأولي وعند الإقلاع من الأرض بالإضافة إلى سيولة مرحلة التأرجح أثناء التنقل.
      ملاحظة: هناك 3 درجات لهذه المعلمة الموضحة في الأقسام الفرعية التالية تقييم منفصل: 1) التوجه المحوري لوضع مخلب في اتصال الأطراف (وضع الدوراتية / الأخمصية)، 2) التوجه الطولي لوضع مخلب عند الاتصال الأولي وأثناء الرفع (بالتوازي مع محور الجسم أو استدارة داخليا / خارجيا)، و 3) نوعية حركة الأطراف أثناء التأرجح (العادية أو غير النظامية).
      1. لوضع مخلب في اتصال الأطراف، ويسجل التوجه المحوري لوضع مخلب عند اتصال الأطراف كما 0 عندما تحدث مواضع الظهر في أكثر من 50٪ من الخطوات.
        ملاحظة: يعتبر موضع الأخمص ية بمثابة موقع لتسجيل اتجاه الكفة عند الاتصال والرفع (الخطوة 2-5-4-2)، وحركة التأرجح (الخطوة 2-5-4-3)، وتنسيق الأطراف الخلفية (الخطوة 2-5-5).
      2. لتوجيه مخلب في اتصال الطرف ورفع، منح درجة من 2 عندما مخلب طولية ومحاور الجسم هي موازية ودرجة 1 عندما يتم تدوير الطرف خارجيا أو داخليا، بشكل منفصل لكلا الاتصال الطرف ورفع.
      3. لحركة التأرجح، منح درجة من 2 عندما تتحرك المفاصل الخلفية بطريقة متناغمة ومنتظمة أثناء التأرجح ودرجة 1 عندما تحدث الحركات المتشنجة أو التشنجية للمفاصل أثناء التأرجح.
    5. لتنسيق الأطراف الأمامية والخلفية، أكمل هذه المعلمة فقط إذا حدثت 4 خطوات متتالية أثناء الاختبار وإذا كانت الأطراف يمكن أن تدعم بنشاط وزن الجسم. منح درجة 3 عندما يكون التنسيق متسقاً (>90% من الخطوات)، أو 2 عند تكرار (50-90% من الخطوات)، أو 1 عند عرضية (<50% من الخطوات)، أو 0 عند غياب (0% من الخطوات).
      ملاحظة: يتم تعريف التنسيق بين الأطراف الخلفية والطرف الخلفي على أنه تناوب منتظم في التنقل بين الطرف الخلفي الذي يتم تسجيله والطرف السفلي على نفس الجانب من الجسم.
    6. لموقف الذيل، وتقييم موقف الذيل أثناء الحركة إما صعودا (من الأرض، منحت درجة = 1) أو أسفل (لمس الأرض، منحت درجة = 0).
      ملاحظة: موقف ذيل مرتفعة أثناء الحركة هو مؤشر على استقرار الجذع في الفئران. بعد استئصال الهُمس، يُعقد الذيل عادةً بالقرب من الأرض أو لمسها مع ضعف استقرار الجذع.
    7. إضافة الدرجات الفردية من كل معلمة لتوفير إجمالي لكل طرف خلفي بحد أقصى 20 نقطة.
      ملاحظة: درجة 20 يشير إلى الأداء الحركي العادي. الدرجات <20 تمثل كميات متزايدة من ضعف الحركية ودرجة 0 يشير إلى شلل الأطراف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن توليد الآفات القابلة للاستنساخ مع درجة عالية من الاتساق مع تقنية استئصال الأنسجة. لتقييم ومقارنة أحجام الآفات بين المجموعات التجريبية ، يمكن حساب المساحة القصوى للآفة كنسبة مئوية من إجمالي المقطع العرضي للحبل الشوكي بسهولة مع تلطيخ النسيج ية لأقسام الحبل الشوكي. ويبين الشكل 1 آفة تمثيلية للهيميكورد الأيسر وتراكب اعلى نسبة من منطقة الآفة القصوى المشتركة بين الفئران مع متوسط حجم الآفة من 47.3٪ ± 4.0٪ من منطقة الحبل المقطعي (ن = 6).

Figure 1
الشكل 1: الآفات التّبيّنية في العمود الفقري. (أ) صورة دقيقة لقسم العمود الفقري الإكليلي في مركز الآفة من فأر مشقوق ملطخ بالبنفسج الكريسيل (أجسام الخلايا، الأرجواني) والأزرق السريع لوكسول (الملين والأزرق) مما يشير إلى تلف المادة الرمادية والبيضاء المركزة في اليسار hemicord. D, dorsal; V, ventral; L، اليسار؛ آر)، صحيح) شريط المقياس: 1مم (B) تراكب تخطيطي للنسبة المشتركة من منطقة الآفة القصوى في مجموعة من الفئران (ن = 6). موقع الجهاز القشري الشوكي المتقاطع في الجنب الظهري على الجانب الأيمن مظلل باللون الأسود. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتيجة الأولية للاستئصال هو الشلل الأولي للأطراف الخلفية على جانب الآفة خلال اليومين أو الثلاثة الأولى بعد العملية الجراحية. يحسن الأداء الحركي للأطراف الخلفية الأكثر تضررا بسرعة في الفئران بعد استئصال الفص خلال الأسابيع القليلة الأولى بعد الإصابة. عادة ما يلاحظ العجز الصغير في الطرف الخلفي المقابل في البداية بعد استئصال الهُم الذي يمكن أن يعكس التعويض عن الطرف الأكثر تضرراً، أو العجز الناجم عن عدم الاستقرار الوضعي، ودعم الوزن، والتنقل المستمر. ومن شأن العجز الكبير والمستمر في الطرف الخلفي المعاكس أن يشير إلى آفة ثنائية تمتد إلى hemicord المتعارضة.

ويرد في الجدول 1 نموذج لسجل الأداء الحركي.

الجدول 1: ورقة تسجيل العينات. عينة من قاعدة تسجيل الأداء الحركي. لكل معلمة، تتم الإشارة إلى الدرجات المحتملة بين قوسين. أنا، الداخلية؛ هاء، خارجي؛ P، موازية؛ FL-HL، الطرف الخلفي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

يتم تصوير مسار الوقت للتغيرات التمثيلية في الأداء الحركي في الحالة السليمة وعلى مدى الأسابيع الخمسة الأولى بعد استئصال الفص في الجانب الأيسر في مجموعات منفصلة من الفئران (n = 6 لكل مجموعة) في الشكل 2.

Figure 2
الشكل 2: مسار الوقت التمثيلي للتغيرات في الأداء الحركي الخلفي في الميدان المفتوح في الحالة السليمة ولمدة خمسة أسابيع بعد استئصال الفص الصدري في الجانب الأيسر. أداء الطرف الخلفي الأيسر(A) يضعف بشكل ملحوظ من القيم السليمة خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد استئصال الهُم، والطرف الخلفي الأيمن (B) خلال الأسبوع الأول بعد استئصال الهُم. يتم رسم البيانات على أنها متوسط المجموعة ± الانحراف المعياري (SD; n = 6 لكل مجموعة). وقد أجريت تحليلات إحصائية مع اختبارات كروسكال-واليس غير البارامترية التي استكملت باختبارات المقارنة المتعددة التي أجرتها دان لتقييم الاختلافات الجماعية بين النقاط الزمنية. *p < 0.05, ***p < 0.001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

قوة رئيسية لتقنية تشريح الاستئصال هي الانتقائية واستنساخ الآفة مما يؤدي إلى انخفاض التباين في الأنماط الظاهرية النسيجية والسلوكية بين الحيوانات25. من أجل ضمان آفة من جانب واحد على مستوى العمود الفقري المناسب، وتحديد دقيق لكل من الجزء الفقري السليم وخط الوسط الحبل الشوكي أمر بالغ الأهمية. كما يمكن أن يكون هناك ميل للحبل الشوكي لتدوير في اتجاه قطع أثناء إجراء تشريح الدم، يمكن أن يكون من المفيد لتثبيت الحبل بدقة مع ملقط غرامة وضعت على أي من الجانبين أثناء الإجراء. وضع الفئران في إطار مجسم مع الذيل مسجلة بلطف تحت التوتر الخفيف يمكن أن تساعد مع الاستقرار ومحاذاة الفقرات المناسبة أثناء الإجراء. كما يمكن استخدام مشبك العمود الفقري المتصل بالإطار المجسم وعملية شائكة لتعزيز استقرار العمود الفقري، ولكننا نجد أن وجوده يمكن أن يقيد الوصول إلى الحبل باستخدام الأدوات الجراحية ويتطلب زوايا نهج غريبة خلال جراحه. من الضروري أيضًا إزالة أي شظايا العظام التي تترك في القناة الشوكية من استئصال الصفيحات لأنها يمكن أن تسبب إصابة ضغط غير مرغوب فيها في الحبل وتعزيز الضرر الثانوي.

وينبغي ملاحظة الفئران باستمرار خلال الجراحة لرصد العلامات الحيوية الضرورية مثل درجة الحرارة الأساسية والتنفس، كما انخفاض حرارة الجسم هو السبب الرئيسي للوفيات سواء أثناء إدارة التخدير وفي البداية بعد الجراحة. تنظيم درجة حرارة الجسم الأساسية مع مسبار المستقيم ووسادة التدفئة التي تسيطر عليها ردود الفعل يمكن أن تجنب إلى حد كبير مضاعفات درجة الحرارة. كما يمكن استخدام مقياس تأكسج النبض لمراقبة أكسجين الدم ومعدل ضربات القلب لتنظيم عمق التخدير. نجد أن تجديد السوائل مباشرة بعد الجراحة مع حل اللاكتات الرنين يسخن إلى درجة حرارة الجسم النتائج في وقت الانتعاش أسرع للفأر أن يستيقظ بعد الجراحة، واستعادة السيطرة اللاإرادية من درجة حرارة الجسم، وتكون قادرة على شرب وتناول الطعام.

الرصد بعد الجراحة للفأر ضروري بعد جراحة استئصال الأنف، وخاصة بالنسبة لعلامات الميكاتوريتيون غير السليم، والألم، والعدوى، وفقدان الوزن، ومشاكل في التئام الجروح، أو autophagia. التشاور مع الموظفين البيطريين للتقييم والعلاج أمر بالغ الأهمية في حالات المضاعفات بعد الجراحة. وعلى وجه الخصوص، قد تتداخل الصدمة الحادة في العمود الفقري أو الآفات الثنائية غير المقصودة مع الميكاتوريتيون الذي يمكن أن يؤدي إلى التهابات قاتلة محتملة. مراقبة بعناية المثانة من الفئران بعد الجراحة وباطلة يدويا ثلاث مرات في اليوم الواحد إذا كان كامل عن طريق الضغط لطيف من الجانب البطني من المثانة تنازلي caudally. نحن نستخدم الإناث الفئران طويلة ايفانز كما لديهم مجرى البول أقصر بكثير وأكثر استقامة من الذكور التي تؤدي إلى بداية أسرع من المثانة البولية التلقائي، وأسهل micturition، وانخفاض معدلات التهابات المسالك البولية2. كما ينبغي رصد الأوزان وخسارة >20% من خط الأساس يبرر التحقيق في تناول الطعام والماء. يجب فحص الأسنان للكشف عن الانسداد، والبطن لللفائفي، والفئران التي تعطى السوائل التكميلية المناسبة والتغذية مثل هيدروجيل أو اتباع نظام غذائي سائل. قد تشكل الكيسة نادراً تحت موقع الشق الذي يمكن تصريفه بأمان بحقنة دون مضاعفات بالتشاور مع الموظفين البيطريين.

يوفر إجراء تقييم المحرك الحركي المفتوح في مارتينيز تقنية بسيطة لا تتطلب أي معدات متخصصة أو تدريب قبل الجراحة أو حرمان الحيوان من الطعام. يمكن إجراء التقييم في وقت مبكر كما يتعافى الحيوان من التخدير ويمكن استخدامه لفحص الحيوانات للحصول على مؤشرات الاسترداد المناسبة (على سبيل المثال، استرداد دعم وزن الجسم) عندما يمكن استكمال اختبارات حركية أكثر صرامة ومحددة مثل تقييم المشي الآلي للحركة فوق الأرض26،27،28، التحليلات الحركية أثناء حركة المشي الحركة29،30،31،32،الشبكة المشي33، وسلم درجة المشي9،34. الأهم من ذلك، في حين أن مقياس BBB قد ثبت أن لا تكون خطية مع الانتعاش الحركي كما عشرات تميل إلى التجمع حول قيم معينة19،ومارتينيز مفتوحة المجال تقييم locomotor يوفر لمحة تسجيل خطي خلال عملية الانتعاش 10.لضمان البيانات السلوكية موثوق بها، من المهم تقليل عدد المشاركين أثناء الاختبار والتحليل. للمساعدة في تقليل التباين أثناء الاختبار، يجب أن تحدث الجلسات في نفس الوقت من اليوم، في نفس الغرفة، ومن قبل نفس المجرب. يمكن إجراء التقييم الميداني المفتوح بشكل موثوق خلال الجلسات المتكررة9و10و11و12و23،ولكن قد تصبح الفئران معتادة على البيئة على مدى الوقت والحد من نشاطهم أثناء الاختبار مما أدى إلى كمية غير كافية من نوبات المحرك للتحليل. للتغلب على الجمود أثناء الاختبار، يتم التقاط الفئران التي تبقى ثابتة لأكثر من 20 ثانية واستبدالها في وسط الساحة لتعزيز الحركة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يساعد تضمين اتصال معين في الساحة أثناء الاختبار الذي تم وضع علامة عليه لتحديد الهوية في تعزيز النشاط الحركي في فأر الاختبار. لضمان الموثوقية في تسجيل المحركات اللولفية اثنين من الدرجات، ويفضل أن يكون أعمى، ينبغي إجراء التحليلات كما سبق وصفها10.

في الختام، نحن نصف أساليب إجراء استئصال الحبل الشوكي الصدري في الفئران وتقييم الأداء الحركي الخلفي التلقائي في ساحة مفتوحة المجال. على الرغم من أنه تم وصف إجراء لإجراء استئصال الهمي الجانبي الجانبي، يمكن تكييف هذه التقنية بسهولة لإجراء إما استئصال الهمي الددورسي35،أو الاستئصالات التتناوبية بالتناوب36أو37،أو عمليات الاستئصال الكامل 38 اعتمادا على موقع الآفة المطلوب وكمية من التعصيب فوق الشوكي تنازلي تجنيب. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية في نماذج حيوانية أكبر، بما في ذلك القطط39،40،41 والرئيسيات غير البشرية6،42 مع العجز مماثلة لوحظت بين الصغيرة والحيوانات الكبيرة، مما يجعلمن المفيد للتحقيق في كل من الآليات العصبية البيولوجية للشفاء وللاختبار العلاجي قبل السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المعهد الكندي للبحوث الصحية؛ تم دعم MOP-142288) إلى M.M.M. بجائزة راتب من مؤسسة البحوث كيبيك سانتي (FRQS)، وكان A.R.B مدعوما ً بزمالة من FRQS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Baytril CDMV 11242
Blunt dissection scissors World Precision Instruments 503669
Buprenorphine hydrochoride CDMV
Camera lens Pentax C31204TH 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera Basler acA2000-165uc 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas Praxair
Cotton tipped applicators CDMV 108703
Delicate bone trimmers Fine Science Tools 16109-14
Dissecting knife Fine Science Tools 10055-12
Dumont fine forceps (#5) Fine Science Tools 11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H) CDMV 111689
Feedback-controlled heating pad Harvard Apparatus 55-7020
Female Long-Evans rats Charles River Laboratories Strain code: 006 225-250g
Gelfoam CDMV 102348
Curved hemostat forceps Fine Science Tools 13003-10
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrogel 70-01-5022 Clear H20
Isofluorane CDMV 118740
Lactated Ringer's solution CDMV 116373
Lidocaine (2%) CDMV 123684
Needle 30 ga CDMV 4799
Open-field area Custom Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment CDMV 110704
Personal computer  With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline CDMV 1399
Proviodine CDMV 4568
Rodent Liquid Diet Bioserv F1268
Scalpal blade #11 CDMV 6671
Self-retaining retractor World Precision Instruments 14240
Vannas iridectomy spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer Dispomed 975-0510-000
VLC media player VideoLAN videolan.org/vlc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
  2. Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
  3. Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
  4. Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
  5. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  6. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
  7. Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
  8. Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
  9. Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
  10. Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
  11. Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
  12. Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
  13. Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
  14. Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
  15. Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
  16. Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
  17. Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
  18. Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
  19. Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
  20. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  21. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  22. Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
  23. Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
  24. Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
  25. Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
  26. Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
  27. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  28. Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
  29. Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
  30. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  31. Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
  32. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
  33. Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
  34. Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
  35. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
  36. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  37. van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
  38. Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
  39. Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
  40. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
  41. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
  42. Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).

Tags

علم الأعصاب، العدد 148، إصابة الحبل الشوكي، استئصال الأنف، الحركة، المجال المفتوح، الطرف الخلفي، الفئران، الجراحة
جراحة استئصال النخاع الشوكي للحبل الشوكي وتقييم المحرك الحركي المفتوح في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic… More

Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat. J. Vis. Exp. (148), e59738, doi:10.3791/59738 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter