Summary
De thoracale spinale hemisectie van de rat is een waardevol en reproduceerbaar model van eenzijdige ruggenmergletsel om de neurale mechanismen van het motorische herstel en de werkzaamheid van de behandeling te onderzoeken. Dit artikel bevat een gedetailleerde stapsgewijze handleiding om de hemisectie-procedure uit te voeren en om de prestaties van het bewegings vermogen in een open-veld Arena te beoordelen.
Abstract
Ruggenmergletsel (SCI) veroorzaakt verstoringen in de motorische, sensorische en autonome functie onder het niveau van de laesie. Experimentele diermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen om de neurale mechanismen die betrokken zijn bij het motorische herstel na SCI te begrijpen en om therapieën voor klinische populaties te ontwerpen. Er zijn verschillende experimentele Sci-modellen, waaronder contusie, compressie en transect blessures die worden gebruikt in een breed scala aan soorten. Een hemisectie omvat de eenzijdige transectie van het ruggenmerg en verstoort alle stijgende en dalende Tracts aan één kant. Spinale hemisectie produceert een zeer selectieve en reproduceerbare verwonding in vergelijking met contusie of compressietechnieken die nuttig is voor het onderzoeken van Neurale plasticiteit in gespaard en beschadigde trajecten in verband met functioneel herstel. We presenteren een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor het uitvoeren van een thoracale hemisectie op het T8-wervel niveau bij de rat, wat resulteert in een initiële verlamming van de achterledemaat aan de zijkant van de laesie met een cijfer spontaan herstel van de motorische functie over verschillende Weken. We bieden ook een locomotief scoring protocol om te beoordelen van functionele herstel in het open-veld. De motorische beoordeling biedt een lineair herstel profiel en kan zowel vroegtijdig als herhaaldelijk na letsel worden uitgevoerd om dieren nauwkeurig op te schermen voor geschikte tijdpunten om meer gespecialiseerde gedragstesten uit te voeren. De voorgestelde hemisectie-techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere transect-modellen en-soorten, en de motorische beoordeling kan worden gebruikt in een verscheidenheid aan SCI-en andere verwondings modellen om de bewegings functie te scoren.
Introduction
Ruggenmergletsel (SCI) wordt geassocieerd met ernstige verstoringen in de motorische, sensorische en autonome functie. Experimentele diermodellen van SCI zijn waardevolle hulpmiddelen om de anatomische en fysiologische gebeurtenissen die betrokken zijn bij SCI-pathologie te begrijpen, om de neurale mechanismen in herstel en herstel te onderzoeken, en om te scherm voor de werkzaamheid en veiligheid van potentiële therapeutische Interventies. De rat is de meest gebruikte soort in SCI Research1. Rat modellen zijn lage kosten, gemakkelijk te reproduceren, en een grote batterij van gedrags tests zijn beschikbaar voor het beoordelen van de functionele uitkomsten2. Ondanks enkele verschillen in Tract locaties, de rat ruggenmerg aandelen algemene soortgelijke sensorimotorische functies met grotere zoogdieren, met inbegrip van primaten3,4. Ratten delen ook analoge fysiologische en gedragsmatige gevolgen voor SCI die betrekking hebben op mensen5. Niet-menselijke primaten en grote diermodellen kunnen een nauwere benadering van humane SCI6 bieden en zijn essentieel om de veiligheid en werkzaamheid van de behandeling te bewijzen voorafgaand aan menselijke experimenten, maar worden minder vaak gebruikt als gevolg van ethisch en dierenwelzijn overwegingen, uitgaven en regelgevingsvereisten7.
Rat transect Sci modellen worden uitgevoerd door de gerichte onderbreking van het ruggenmerg met een selectieve laesie met behulp van een dissectie mes of iridectomie schaar na een laminectomie. Vergeleken met een volledige transect, resulteert partiële transect in de rat in een minder ernstige verwonding, gemakkelijker postoperatieve dierenverzorging, spontaan bewegings herstel, en meer in de gaten in de Sci-modellen bij mensen die overwegend onvolledig zijn met gedeeltelijke kaliumsparende van weefsel dat het ruggenmerg en de supraspinale structuren verbindt8. Een eenzijdige hemisectie verstoort alle stijgende en dalende Tracts aan één kant, en produceert kwantificeerbare en zeer reproduceerbare motorische tekorten, waardoor de verkenning van de onderliggende biologische mechanismen wordt versterkt. De meest prominente functionele consequentie van de hemisectie is een verlamming van de initiële ledemaat aan dezelfde kant en onder het niveau van de laesie met Graded spontaan herstel van de bewegings functie gedurende meerdere weken9,10, 11 , 12. het hemisectie-model is met name nuttig voor het onderzoeken van Neurale plasticiteit van beschadigde en residuele Tracts en circuits geassocieerd met functioneel herstel9,11,12, 13,14,15,16,17,18. In het bijzonder is hemisectie uitgevoerd op het thoracale niveau, d.w.z. boven de spinale circuits die de achterste ledematen beheersen, bijzonder nuttig voor het onderzoeken van veranderingen in de bewegingscontrole. Omdat er een niet-lineaire relatie bestaat tussen laesie-ernst en bewegings herstel na SCI19, is het van cruciaal belang om de functionele uitkomsten te beoordelen in experimentele modellen.
Er is een uitgebreide reeks gedragstesten beschikbaar om specifieke aspecten van functioneel bewegings herstel in de rat2,20te beoordelen. Veel bewegings tests bieden geen betrouwbare maatregelen vroeg na SCI omdat ratten te gehandicapt zijn om hun lichaamsgewicht te ondersteunen. Een maat voor de spontane prestaties van het bewegingsapparaat die vroeg na de verwonding gevoelig zijn voor tekorten en waarvoor geen preoperatieve training of gespecialiseerde apparatuur nodig is, is nuttig om het bewegings herstel te bewaken voor geschikte tijdpunten om supplement gespecialiseerde gedragstesten. De Martinez open-Field Assessment score10, oorspronkelijk ontwikkeld voor het evalueren van de motorische prestaties na cervicale SCI in de rat, is een 20-punts ordinale Score die de mondiale motorische prestaties beoordeelt tijdens spontane bovengrondse-motoriek in een Open-Field. Scores worden afzonderlijk voor elke ledemaat uitgevoerd met behulp van een rubriek die specifieke parameters evalueert van een reeks bewegings maatregelen, waaronder de bewegingen van de gewrichts ledematen, gewichtsondersteuning, cijfer positie, stappen mogelijkheden, coördinatie van de forelimb-hindledematen en staart Positie. De beoordelingsscore is afgeleid van de open-veldbeoordelings schaal Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) die is ontworpen om de prestaties van het bewegings vermogen na thoracische contusie21te evalueren. Het is aangepast aan het nauwkeurig en betrouwbaar evalueren van zowel de forelimb en de hindledemaat motorische functie, maakt onafhankelijke beoordeling van de verschillende scoring parameters die niet vatbaar is voor de hiërarchische scoring van de BBB, en biedt een lineair herstel profiel10. Bovendien, in vergelijking met de BBB, de assessment Score is gevoelig en betrouwbaar in ernstiger letsel modellen10,11,20,22. De beoordelingsscore is gebruikt voor het beoordelen van motorische stoornissen bij ratten na cervicale10,12 en thoracale9 Sci alleen en in combinatie met traumatisch hersenletsel23.
We presenteren hier een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor het uitvoeren van een thoracale hemisectie SCI op de T8 Vertebrale niveau in de vrouwelijke Long-Evans rat, en voor het beoordelen van hindledemaat motorische herstel in het open-veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De in dit artikel beschreven experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad voor Dierverzorging en werden goedgekeurd door de ethische Commissie aan de Université de Montréal.
1. thoracische hemisectie chirurgie
- Draag geschikte beschermende uitrusting (handschoenen, masker en jurk) om een aseptische omgeving voor chirurgie te behouden. Reinig het chirurgische gebied met alcoholdoekjes en plaats steriele chirurgische gordijnen over het chirurgische veld. Steriliseren chirurgische gereedschappen en plaats op het chirurgische veld.
- Anesthetiseer de rat onder een mengsel van Isofluraan gas (3% inductie, 0,5 − 3% onderhoud) en zuurstof (1 L/min). Bevestig de juiste chirurgische verdoving diepte door het controleren van de afwezigheid van Teen pinch en corneale reflex reacties. Voortdurend bewaken van de rat tijdens de gehele procedure, en pas de hoeveelheid anestheticum levering zoals vereist voor het handhaven van chirurgische verdoving diepte.
- Scheer de rugromp tussen de heup en de nek, plaats de rat op het chirurgische veld, Desinfecteer de incisieplaats met alcoholdoekjes en proviodine oplossing, en behoud de kerntemperatuur bij 37 °C met behulp van een door de rectale bewaakte verwarmingspad Thermometer.
- Plaats oftalmische zalf op de ogen om ze gehydrateerd te houden en opnieuw toe te passen gedurende de hele operatie.
- Maak een 2,5 cm incisie in de huid die de T6 − T10 wervels met een scalpel overlegt. Trek de huid en het oppervlakkige vet in met botte dissectie schaar.
Opmerking: de T6 − T10 wervel segmenten kunnen worden geïdentificeerd hetzij rostraal door zachte palpatie van de rugrugwervel segmenten vanaf de basis van de schedel vanaf de merkbare knobbel van de 2ND thoracale wervel24, of caudally door palpatie van de meest posterieure zwevende rib die beweging zal opwekken in de 13e thoracische wervels. - Scheid de paravertebrale spieren op het ruggedeelte van de T7 − T9-wervels met behulp van botte dissectie schaar en een zelfbehoudend oprolmechanisme. Debride en wis alle overgebleven weefsel met behulp van fijne Tang en katoen getipt applicatoren om de stekelige processen en vertebrale laminae bloot.
Opmerking: dit, en de volgende stappen worden sterk geholpen door microscopische visualisatie (~ 5 − 15x). - Snijd de facetten (zygapophysiale gewrichten) bilateraal op de T7 en T8 wervels met delicate bottrimmers. Snijd het rugbindweefsel tussen de T8 en T9 Vertebrale laminaten oppervlakkig met een scalpel (diepte van 1 mm) om het onderleg snoer niet te verwonden.
- Verwijder het stekelige proces van de T8 wervel met bottrimmers. Met gebogen hemostatische Tang voorzichtig geklemd op de T7 stekelige proces, draai het caudal uiteinde van de T8 laminaten lichtjes rostrally (~ 20 °), steek de bottrimmers onder de T8 lamina, en maak een middenlijn snede langs de lamina. Doorgaan met de laminectomie door het herhalen van de sneden aan de linker-en rechterkant van de Vertebrale lamina mediale naar de dwarse processen om het ruggenmerg bloot.
Opmerking: Wees voorzichtig met het verwijderen van alle botfragmenten gemaakt van de laminectomie. - Druppel lidocaïne (2%, 0,1 mL) in het blootgestelde wervelkanaal en verwijder de Dura die de T8-wervelkolom overlegt met behulp van fijne Tang en iridectomie-schaar. Herhaal de toediening van lidocaïne aan het blootgestelde snoer en Identificeer de middenlijn van het snoer door visualisatie van een middenlijn die is gecreëerd tussen de stekelige processen die zich uitstrekken tussen de blootgestelde T7 − T9 vertebra.
Let op: samen met de stekelige processen op T7 en T9 kan de blootgestelde rugwortel ganglia op T8 ook worden gebruikt om de identificatie van de middenlijn te helpen en een 30 G naald kan in de middenlijn van het snoer worden geplaatst om te helpen met de daaropvolgende hemisectie. - Hemisect het ruggenmerg van de middenlijn naar de ene kant met een ontleed mes. Zorg ervoor dat u niet door de voorste spinale slagader op de ventrale zijde snijdt (gebruik geen stevige druk op het wervellichaam). Met behulp van iridectomie schaar, zorgvuldig snijden door alle overgebleven weefsel op de lesioned kant van het ruggenmerg om ervoor te zorgen dat de ventrolateral Kwadrant correct wordt getrancteerd.
- Plaats steriele zoutoplossing-geweekte hemostatische spons (~ 6 x 2 mm) in de blootgestelde holte boven het ruggenmerg en hecht de spier lagen (4-0 polyglactin 910). Vervolgens hecht de huid rond de incisieplaats.
- Zorg voor voldoende analgetisch (buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan [s.c.]), antibioticum (enrofloxacine, 10 mg/kg s.c.) en vul de verloren vloeistoffen aan met 5 CC lactaat ringer's Solution (intraperitoneal [i.p.]) onmiddellijk na de operatie.
- Verwijder de rat van anesthesie. Plaats de rat in een warme omgeving onder een verwarmingskussen of lamp (~ 33 °C) totdat het dier volledig wakker is.
- Zorg voor aanvullende analgesie dagelijks gedurende de eerste 3 na chirurgische dagen en voortdurend controleren op tekenen van pijn, gewichtsverlies, onjuiste mictie, infectie, problemen met wondgenezing, of autophagia.
2. open-veld testprocedure en prestatiescore van het bewegings vermogen
- Behandel ratten dagelijks gedurende 1 week en gewend ze aan de arena voor twee 5-minuten sessies voorafgaand aan het testen om te acclimatiseren, zachtjes uit de mid-trunk, terwijl in het open veld en om de meet betrouwbaarheid te garanderen tijdens het testen.
- Plaats een camera op maaiveldhoogte tegenover de open Arena van de circulaire plexiglas om testsessies op te nemen voor offline analyse (30 − 60 frames/s minimum).
- Begin de video-opname en plaats de rat in het midden van de arena onder schemerige lichtomstandigheden om motorische activiteit aan te moedigen.
- Vervolg de testsessie gedurende 4 minuten om te zorgen voor een adequate hoeveelheid motorische aanvallen voor analyse. Pick-up en vervang ratten in het midden van de Arena wanneer ze blijven stilstaan voor langer dan 20 s ter bevordering van de motoriek.
- Scoor de prestaties van de geregistreerde testsessie door de rubriek te voltooien die inTabel 1volgens de parameters in de volgende subsecties.
Opmerking: het is handig om elke parameter afzonderlijk te scoren door herhaalde weergave van de vastgelegde testsessie met behulp van software die variabele afspeelsnelheid en frame-voor-frame analyse mogelijk maakt (bijvoorbeeld VLC Media Player).- Voor articulaire ledematen bewegingen, scoor je gewrichts bewegingen tijdens spontane motoriek afzonderlijk voor de enkel, knie en heup als ofwel normaal (meer dan de helft van het bewegingsbereik, bekroond met Score = 2), licht (minder dan de helft van het bewegingsbereik, bekroond Score = 1), of afwezig (toegekende score = 0).
- Voor gewichtsondersteuning, evalueer het vermogen van hindledeextensor-spieren om te contracteren en het geladen lichaamsgewicht te ondersteunen wanneer de ledemaat afzonderlijk op de grond is voor wanneer de rat stationair is, evenals tijdens actieve motoriek. Award een Score van 1 wanneer gewichtsondersteuning aanwezig is en een Score van 0 wanneer de gewichtsondersteuning afwezig is.
Opmerking: stationaire gewichtsondersteuning wordt beschouwd als een Perquisite voor actieve gewichtsondersteuning. - Voor de cijfer positie, evalueer de positie van de achterledematen terwijl de rat stationair is en tijdens het voortbewegings tijd. Award een Score van 2 wanneer de achterledematen worden verlengd, gescheiden van elkaar, en Tonic tijdens de motoriek in meer dan 50% van de testperiode (beschouwd als normaal). Award een Score van 1 Wanneer cijfers overwegend gebogen blijven en een Score van 0 wanneer cijfers overwegend atonisch blijven.
- Voltooi deze parameter alleen als de rat zijn lichaamsgewicht kan ondersteunen tijdens het Stepping. Evalueer de stap door de oriëntatie van de achterpoot plaatsing op het moment van eerste contact te beoordelen en bij het opstijgen van de grond naast de vloeibaarheid van de swing fase tijdens het stappen.
Opmerking: er zijn 3 scores voor deze parameter die wordt beschreven in de volgende subsecties afzonderlijk evalueren: 1) de axiale oriëntatie van de poot plaatsing op ledemaat contact (dorsale/plantar plaatsing), 2) de longitudinale oriëntatie van de poot plaatsing bij eerste contact en tijdens de lift (parallel aan de body-as of intern/extern gedraaid), en 3) de kwaliteit van de ledematen beweging tijdens Swing (regelmatige of onregelmatige).- Voor de poot plaatsing bij contact met de ledemaat, scoor de axiale oriëntatie van de poot plaatsing in het contact van de ledemaat als 0 wanneer dorsale plaatsingen in meer dan 50% van de stappen plaatsvinden.
Opmerking: plantar plaatsing wordt beschouwd als een Perquisite voor het scoren van de oriëntatie van paw bij contact en lift (stap 2.5.4.2), Swing beweging (stap 2.5.4.3) en forelimb-hindledemaat coördinatie (stap 2.5.5). - Voor de poot oriëntatie op ledemaat contact en Lift, Award een Score van 2 wanneer de longitudinale poot en het lichaam assen parallel en een Score van 1 wanneer de ledemaat extern of intern wordt geroteerd, afzonderlijk voor zowel ledemaat contact en lift.
- Voor de swing beweging, toekenning van een Score van 2 als achterlijf gewrichten bewegen op een harmonieuze en regelmatige manier tijdens de swing en een Score van 1 wanneer schokkerige of krampachtige bewegingen van de gewrichten optreden tijdens de swing.
- Voor de poot plaatsing bij contact met de ledemaat, scoor de axiale oriëntatie van de poot plaatsing in het contact van de ledemaat als 0 wanneer dorsale plaatsingen in meer dan 50% van de stappen plaatsvinden.
- Voor de coördinatie van de forelimb-hindledemaat, vult u deze parameter alleen in als er tijdens het testen 4 opeenvolgende stappen optreden en als de ledematen het lichaamsgewicht actief kunnen ondersteunen. Gunning van een Score van 3 wanneer de coördinatie consistent is (> 90% van de stappen), 2 wanneer frequent (50 − 90% van de stappen), 1 wanneer occasioneel (< 50% van de stappen), of 0 wanneer afwezig (0% van de stappen).
Opmerking: de coördinatie van de Forelimb-hindledemaat wordt gedefinieerd als een regelmatige afwisseling bij het stappen tussen de achterledematen die worden gescoord en de forelimb aan dezelfde kant van het lichaam. - Voor de staart positie, evalueer de staart positie tijdens de motoriek als ofwel omhoog (van de grond, toegekende score = 1) of omlaag (het aanraken van de grond, bekroond score = 0).
Opmerking: een verhoogde staart positie tijdens de motoriek is een indicatie van de stabiliteit van de romp bij de rat. Na hemisectie wordt de staart normaalgesproken in de buurt gehouden of aan de grond geraakt, omdat de romp stabiliteit verstoord is. - Voeg de afzonderlijke scores van elke parameter toe om een totaal te bieden voor elk achterdeel van maximaal 20 punten.
Opmerking: een Score van 20 geeft de normale motorische prestaties aan. Scores < 20 vertegenwoordigen toenemende hoeveelheden motorische stoornissen en een Score van 0 duidt op verlamming van de ledematen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduceerbaar laesies met een hoge mate van consistentie kunnen worden gegenereerd met de hemisectie-techniek. Om de laesies maten tussen experimentele groepen te beoordelen en te vergelijken, kan het maximale gedeelte van de laesie als percentage van de totale dwarsdoorsnede van het ruggenmerg gemakkelijk worden berekend met histologische kleuring van ruggenmerg secties. Figuur 1 toont een representatieve laesie van de linker hemicord en een overlay van het deel van het maximale laesie gebied dat wordt gedeeld tussen ratten met een gemiddelde laesie grootte van 47,3% ± 4,0% van het transversale snoer gebied (n = 6).
Figuur 1: representatieve spinale laesies. (A) micro foto van een coronale wervelkolom bij het epicentrum van de laesie van een geadieerde rat die gekleurd is met Cresylacetaat Violet (cellichamen, paars) en luxol Fast Blue (myeline, blauw), wat wijst op schade aan de grijze en witte stof geconcentreerd in de linker hemicord. D, rugklachten; V, ventrale; L, links; R, rechts. Schaalbalk: 1 mm. (B) Schematische overlay van het gedeelde deel van het maximale laesie gebied in een groep ratten (n = 6). De locatie van het gekruiste corticospinale tractus in de dorsale Funiculus aan de rechterkant is in zwart gearceerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Het primaire gevolg van de hemisectie is een initiële verlamming van de achterledemaat aan de zijkant van de laesie tijdens de eerste twee tot drie postoperatieve dagen. Motorische prestaties van de meer aangetaste achterledemaat verbetert snel bij de rat na hemisectie gedurende de eerste paar weken na het letsel. Kleine tekorten in het tegenoverliggende achterlijf worden gewoonlijk in eerste instantie waargenomen na de hemisectie die compensatie kan weergeven voor het meer aangetaste ledemaat, of tekorten als gevolg van een gebrek aan houdings stabiliteit, gewichtsondersteuning en consistente intensivering. Een groot en aanhoudende tekort in het tegenoverliggende achterlijf zou duiden op een bilaterale laesie die zich uitstrekt tot de tegengestelde hemicord.
In tabel 1 vindt u een voorbeeld van een prestatie scorings rubriek voor locomotief.
Tabel 1: sample scoring Sheet. Voorbeeld locomotief performance scoring rubriek. Voor elke parameter worden de mogelijke scores tussen haakjes aangegeven. I, intern; E, extern; P, parallel; FL-HL, forelimb-hindledemaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Het tijdsverloop van representatieve veranderingen in de prestaties van het bewegingssysteem in de intacte toestand en gedurende de eerste vijf weken na een hemisectie van de linkerzijde in afzonderlijke groepen ratten (n = 6 per groep) wordt afgebeeld in Figuur 2.
Figuur 2: Representatieve tijdsverloop van veranderingen in de prestaties van het achterlijf van het bewegingssysteem in het open veld in de intacte toestand en gedurende vijf weken na een thoracische hemisectie aan de linkerzijde. De prestaties van de linker achterledemaat (a) zijn significant aangetast door intacte waarden gedurende de eerste drie weken na hemisectie, en van de rechter achterpoot (B) gedurende de eerste week na hemisectie. Gegevens worden uitgezet als groeps gemiddelde ± standaarddeviatie (SD; n = 6 per groep). Statistische analyses werden uitgevoerd met niet-parametrische tests van Kruskal-Wallis aangevuld met Dunn's meervoudige vergelijkings tests om de groeps verschillen tussen de tijdpunten te beoordelen. *p < 0,05, * * *p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een belangrijke sterkte van de hemisectie-techniek is de selectiviteit en reproduceerbaarheid van de laesie, wat leidt tot een verminderde variabiliteit in histologische en gedragsfenotypes tussen dieren25. Om een eenzijdige laesie op het juiste ruggenmerg niveau te garanderen, is nauwkeurige identificatie van zowel het juiste wervel segment als de middenlijn van het ruggenmerg van cruciaal belang. Omdat er een neiging kan zijn om het ruggenmerg in de richting van de snede te roteren tijdens de hemisectie-procedure, kan het nuttig zijn om het snoer subtiel te stabiliseren met een fijne Tang die aan beide zijden wordt geplaatst tijdens de procedure. Het plaatsen van de rat in een stereotaxus frame met de staart zachtjes geplakt onder lichte spanning kan helpen met stabiliteit en goede wervel uitlijning tijdens de procedure. Een ruggengraat klem bevestigd aan het stereotaxic frame en een stekelige proces kan ook worden gebruikt om de stabiliteit van de wervelkolom te verbeteren, maar we vinden dat zijn aanwezigheid de toegang tot het snoer met chirurgische gereedschappen kan beperken en vereist lastige benaderings hoeken tijdens de Chirurgie. Het is ook essentieel om alle botfragmenten die in het wervelkanaal achterblijven uit de laminectomie te verwijderen, omdat ze ongewenste compressie schade aan het snoer kunnen veroorzaken en secundaire schade kan bevorderen.
Ratten moeten constant worden geobserveerd tijdens de operatie om de noodzakelijke vitale functies zoals kerntemperatuur en ademhaling te bewaken, aangezien hypothermie een leidende oorzaak van sterfte is, zowel tijdens de anesthesie toediening als in eerste instantie na de operatie. Regulering van de lichaamstemperatuur met een rectale sonde en een met feedback bestuurde verwarmingskussen kan grote temperatuur complicaties voorkomen. Een Pulse Oximeter kan ook worden gebruikt voor het bewaken van de oxygenatie van het bloed en de hartslag voor het reguleren van de verdoving diepte. We vinden dat vloeistof aanvulling onmiddellijk na de operatie met lactaat ringer's oplossing opgewarmd tot lichaamstemperatuur resulteert in een snellere hersteltijd voor de rat te ontwaken na de operatie, herwinnen autonome controle van lichaamstemperatuur, en in staat zijn om te drinken en te eten.
Post-chirurgische controle van de rat is essentieel na de hemisectie chirurgie, vooral voor tekenen van ongepaste mictie, pijn, infectie, gewichtsverlies, problemen met wondgenezing, of autophagia. Overleg met veterinaire medewerkers voor evaluatie en behandeling is cruciaal in situaties van postoperatieve complicaties. In het bijzonder kan acute spinale Shock of onbedoelde bilaterale laesies interfereren met mictie die kan leiden tot potentieel dodelijke infecties. Bewaak de blaas van de rat zorgvuldig na de operatie en vernietigde drie keer per dag handmatig als ze vol zijn door zachte druk van de ventrale kant van de blaas die caudally afdaalt. We gebruiken vrouwelijke Long-Evans ratten omdat ze een aanzienlijk kortere en rechtere urethra hebben dan mannetjes die leiden tot een snellere aanvang van een automatische urineblaas, gemakkelijkere mictie en lagere percentages urineweginfecties2. De gewichten moeten ook worden bewaakt en een verlies > 20% ten opzichte van Baseline warrant onderzoek naar voedsel-en water inname. De tanden moeten worden gecontroleerd op malocclusie, de buik voor ileus, en ratten gegeven passende aanvullende vloeistoffen en voeding zoals hydrogel of een vloeibaar dieet. Een cyste kan zelden vorm krijgen onder de incisie-site die veilig kan worden afgevoerd met een spuit zonder complicaties in overleg met veterinair personeel.
De Martinez-beoordelingsprocedure voor de open-veld-locomotief biedt een eenvoudige techniek die geen gespecialiseerde apparatuur, preoperatieve training of voedsel deprivatie van het dier nodig heeft om te presteren. De beoordeling kan zo vroeg worden uitgevoerd als het dier herstelt van anesthesie en kan worden gebruikt om dieren te schermen voor geschikte herstel indices (bijv. terugwinning van lichaamsgewicht ondersteuning) wanneer strengere en specifieke bewegings tests kunnen worden aangevuld, zoals geautomatiseerde gang-beoordeling van bovengrondse motoriek26,27,28, kinematische analyses tijdens loopband motoriek29,30,31,32, grid wandelen33, en ladder verende lopen9,34. Belangrijk, terwijl de BBB schaal is aangetoond niet lineair met motorische herstel als scores hebben de neiging om cluster rond bepaalde waarden19, de Martinez open-Field locomotief Assessment biedt een lineaire scoringprofiel tijdens het herstelproces 10. om betrouwbare gedragsgegevens te garanderen, is het belangrijk om het aantal medeoprichters te minimaliseren tijdens het testen en analyseren. Om de variabiliteit tijdens het testen te helpen verminderen, moeten sessies plaatsvinden op hetzelfde moment van de dag, in dezelfde ruimte en door dezelfde experimenteerder. De open-veld beoordeling kan op betrouwbare wijze wordenuitgevoerd tijdens herhaalde sessies9,10,11,12,23, maar ratten kunnen gewend raken aan het milieu over en hun activiteit tijdens het testen te verminderen, wat resulteert in een ontoereikende hoeveelheid motorische aanvallen voor analyse. Om immobiliteit tijdens het testen te overwinnen, worden ratten die langer dan 20 seconden stationair blijven, opgepakt en vervangen in het midden van de Arena om motoriek te bevorderen. Bovendien, met inbegrip van een conspecific in de Arena tijdens het testen die is gemarkeerd voor identificatie kan helpen bevorderen motorische activiteit in de testrat. Om te zorgen voor betrouwbaarheid bij het locomotief scoren twee raters, bij voorkeur Blinded, moeten de analyses uitvoeren zoals eerder beschreven10.
Concluderend beschrijven we methoden voor het uitvoeren van een thoracale ruggenmerg hemisectie in de rat en het beoordelen van de spontane prestaties van de achterlijf locomotief in een open veld Arena. Hoewel een procedure voor het uitvoeren van laterale hemisecties werd beschreven, kan de techniek gemakkelijk worden aangepast voor het uitvoeren van dorsale hemisecties35, gespreide alternerende hemisecties36,37of volledige transections 38 afhankelijk van de gewenste laesie locatie en de hoeveelheid gespaard aflopend supraspinale innervatie. Belangrijk is dat de techniek ook kan worden gebruikt in grotere diermodellen, waaronder katten39,40,41 en niet-menselijke primaten6,42 met vergelijkbare tekorten waargenomen tussen kleine en grote dieren, waardoor het nuttig is voor het onderzoeken van zowel de neurobiologische mechanismen van herstel als voor preklinische therapeutische testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (CIHR; MOP-142288) aan M.M. M.M. werd gesteund door een salaris prijs van Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS), en A. R. B werd gesteund door een Fellowship van FRQS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baytril | CDMV | 11242 | |
| Blunt dissection scissors | World Precision Instruments | 503669 | |
| Buprenorphine hydrochoride | CDMV | ||
| Camera lens | Pentax | C31204TH | 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount |
| CMOS video camera | Basler | acA2000-165uc | 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3 |
| Compressed oxygen gas | Praxair | ||
| Cotton tipped applicators | CDMV | 108703 | |
| Delicate bone trimmers | Fine Science Tools | 16109-14 | |
| Dissecting knife | Fine Science Tools | 10055-12 | |
| Dumont fine forceps (#5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2 suture (J392H) | CDMV | 111689 | |
| Feedback-controlled heating pad | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| Female Long-Evans rats | Charles River Laboratories | Strain code: 006 | 225-250g |
| Gelfoam | CDMV | 102348 | |
| Curved hemostat forceps | Fine Science Tools | 13003-10 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Hydrogel | 70-01-5022 | Clear H20 | |
| Isofluorane | CDMV | 118740 | |
| Lactated Ringer's solution | CDMV | 116373 | |
| Lidocaine (2%) | CDMV | 123684 | |
| Needle 30 ga | CDMV | 4799 | |
| Open-field area | Custom | Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height | |
| Opthalmic ointment | CDMV | 110704 | |
| Personal computer | With USB3 connectivity to record video with the listed camera | ||
| Physiological saline | CDMV | 1399 | |
| Proviodine | CDMV | 4568 | |
| Rodent Liquid Diet | Bioserv | F1268 | |
| Scalpal blade #11 | CDMV | 6671 | |
| Self-retaining retractor | World Precision Instruments | 14240 | |
| Vannas iridectomy spring scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer | Dispomed | 975-0510-000 | |
| VLC media player | VideoLAN | videolan.org/vlc |
References
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
- Butler, A. B., Hodos, W. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons. 139-152 (2005).
- Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
- Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
- Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
- Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
- Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
- Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
- Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
- Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Barros Filho, T. E. P. d, Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
- Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
- Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
- Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
- Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
- Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
- Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
- Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
- Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
- Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
- Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
- Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
- van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
- Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
- Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
- Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
- Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).
