Thorax Rückenmarks-Hemisektionschirurgie und Open-Field-Locomotor Assessment in der Ratte

Summary

Die Brustbrust-Spinal-Hemisektion ist ein wertvolles und reproduzierbares Modell der einseitigen Rückenmarksverletzung, um die neuronalen Mechanismen der bewegungsmotorischen Erholung und Behandlungswirksamkeit zu untersuchen. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung, um das Hemisection-Verfahren durchzuführen und die Leistung des Bewegungsapparates in einer Offenen Allee zu bewerten.

Abstract

Rückenmarksverletzungen (SCI) verursachen Störungen der motorischen, sensorischen und autonomen Funktion unterhalb des Niveaus der Läsion. Experimentelle Tiermodelle sind wertvolle Werkzeuge, um die neuronalen Mechanismen zu verstehen, die an der Erholung des Bewegungsapparates nach SCI beteiligt sind, und um Therapien für klinische Populationen zu entwickeln. Es gibt mehrere experimentelle SCI-Modelle, einschließlich Prellungen, Kompression und Transektion Verletzungen, die in einer Vielzahl von Arten verwendet werden. Eine Halbsektion beinhaltet die einseitige Transsektion des Rückenmarks und stört alle auf- und absteigenden Trakte nur auf einer Seite. Die Spinalhemisektion produziert eine hochselektive und reproduzierbare Verletzung im Vergleich zu Konfusions- oder Kompressionstechniken, die für die Untersuchung der neuronalen Plastizität in geschliffenen und beschädigten Wegen im Zusammenhang mit funktioneller Erholung nützlich ist. Wir präsentieren ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Durchführung einer Thorax-Hemisektion auf der T8-Wirbelebene bei der Ratte, die zu einer anfänglichen Lähmung des Hinterbeins an der Seite der Läsion mit abgestufter spontaner Wiederherstellung der Bewegungsfunktion über mehrere Wochen. Wir bieten auch ein Locomotor Scoring-Protokoll, um die funktionelle Wiederherstellung im offenen Feld zu bewerten. Die Lokmotor-Bewertung bietet ein lineares Rückgewinnungsprofil und kann sowohl früh als auch wiederholt nach Verletzungen durchgeführt werden, um Tiere genau auf geeignete Zeitpunkte zu überprüfen, in denen spezialisiertere Verhaltenstests durchgeführt werden können. Die vorgestellte Hemisektionstechnik kann leicht an andere Transektionsmodelle und Arten angepasst werden, und die Bewegungsbewertung kann in einer Vielzahl von SCI- und anderen Verletzungsmodellen verwendet werden, um die Funktion des Bewegungsapparates zu bewerten.

Introduction

Rückenmarksverletzungen (SCI) sind mit schweren Störungen der motorischen, sensorischen und autonomen Funktion verbunden. Experimentelle Tiermodelle von SCI sind wertvolle Werkzeuge, um die anatomischen und physiologischen Ereignisse der SCI-Pathologie zu verstehen, die neuronalen Mechanismen bei der Reparatur und Wiederherstellung zu untersuchen und die Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller therapeutischer Interventionen. Die Ratte ist die am häufigsten verwendete Art in SCI-Forschung¹. Rattenmodelle sind kostengünstig, einfach zu reproduzieren, und eine große Batterie von Verhaltenstests zur Beurteilung der funktionellen Ergebnisse²zur Verfügung. Trotz einiger Unterschiede in den Traktpositionen teilt das Rückenmark der Ratte insgesamt ähnliche sensorimotorische Funktionen mit größeren Säugetieren, einschließlich Primaten^3,4. Ratten teilen auch analoge physiologische und Verhaltensfolgen zu SCI, die sich auf den Menschen beziehen⁵. Nichtmenschliche Primaten- und Großtiermodelle können eine nähere Annäherung an den menschlichen SCI⁶ ermöglichen und sind für den Nachweis der Behandlungssicherheit und -wirksamkeit vor menschlichen Experimenten unerlässlich, werden aber aufgrund des ethischen und Tierschutzes seltener verwendet. Berücksichtigungen, Aufwendungen und regulatorischen Anforderungen⁷.

Rattentransektion SCI-Modelle werden durch die gezielte Unterbrechung des Rückenmarks mit einer selektiven Läsion mit einem Seziermesser oder einer Iritektomieschere nach einer Laminektomie durchgeführt. Im Vergleich zu einer vollständigen Transektion führt die partielle Transektion bei der Ratte zu einer weniger schweren Verletzung, einer leichteren postoperativen Tierpflege, einer spontanen Bewegungsregeneration und genauer enden den Modellen SCI beim Menschen, die überwiegend unvollständig ist, wobei die Gewebe, das das Rückenmark und die supraspinalen Strukturen verbindet⁸. Eine einseitige Halbsektion stört alle aufsteigenden und absteigenden Traktate nur auf einer Seite und erzeugt quantifizierbare und hochreproduzierbare Bewegungsdefizite, wodurch die Erforschung der zugrunde liegenden biologischen Mechanismen verbessert wird. Die prominenteste funktionelle Folge der Hemisektion ist eine anfängliche Gliedmaßenlähmung auf der gleichen Seite und unterhalb des Niveaus der Läsion mit abgestufter spontaner Wiederherstellung der Bewegungsfunktion über mehrere Wochen^{9,10, 11 , 12}. Das Halbschnittmodell ist besonders nützlich, um die neuronale Plastizität beschädigter und Resttrakte und Schaltkreise im Zusammenhang mit der funktionellen Erholung^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. Insbesondere ist die Aufschnitte, die auf thorakaler Ebene durchgeführt werden, d.h. über den Wirbelsäulenkreisläufen, die die Hinterlimb-Fortbewegung steuern, besonders nützlich für die Untersuchung von Veränderungen in der Bewegungssteuerung. Da eine nichtlineare Beziehung zwischen Läsionsschweregrad und Bewegungsrückgewinnung nach SCI¹⁹besteht, sind geeignete Verhaltenstests zur Bewertung der funktionellen Ergebnisse in experimentellen Modellen von größter Bedeutung.

Eine umfassende Batterie von Verhaltenstests zur Verfügung, um spezifische Aspekte der funktionellen Bewegungsrückgewinnung in der Ratte^2,20zu bewerten. Viele Bewegungstests bieten keine zuverlässigen Maßnahmen früh nach SCI, da Ratten zu behindert sind, um ihr Körpergewicht zu unterstützen. Ein Maß für die spontane Motorleistung, das früh nach einer Verletzung auf Defizite reagiert und keine präoperative Ausbildung oder spezielle Ausrüstung erfordert, ist von Vorteil, um die Erholung des Bewegungsapparates auf geeignete Zeitpunkte zu überwachen, in denen spezielle Verhaltenstests ergänzen. Der Martinez-Open-Field-Bewertungswert¹⁰, der ursprünglich für die Bewertung der Motorikleistung nach zervikalem SCI in der Ratte entwickelt wurde, ist ein 20-Punkte-Ordinal-Score zur Beurteilung der globalen Lokomotor-Leistung während spontaner oberirdischer Fortbewegung in offenes Feld. Die Bewertung erfolgt separat für jedes Glied unter Verwendung einer Rubrik, die bestimmte Parameter einer Reihe von bewegungsförmigen Maßnahmen bewertet, einschließlich Gelenkgelenkbewegung, Gewichtsstütze, Ziffernposition, Schrittfähigkeiten, Vorderglieda-Hinterschritt-Koordination und Schwanz stellung. Der Bewertungswert wird von der offenen Bewertungsskala Basso, Beattie und Bresnahan (BBB) abgeleitet, die zur Bewertung der Motorleistung nach Thoraxkontusion²¹entwickelt wurde. Es ist an die genaue und zuverlässige Bewertung sowohl der Vorder- als auch der Hinterhaut-Bewegungskraft-Funktion angepasst, ermöglicht eine unabhängige Bewertung der verschiedenen Bewertungsparameter, die mit der hierarchischen Bewertung des BBB nicht zugänglich sind, und bietet eine lineare Wiederherstellung. Profil¹⁰. Darüber hinaus ist der Bewertungswert im Vergleich zum BBB bei schwereren Verletzungsmodellen^10,11,20,22sensibel und zuverlässig. Die Bewertungsbewertung wurde verwendet, um die motorische Beeinträchtigung der Ratte nach dem Gebärmutterhals^10,12 und thorakale⁹ SCI allein und in Kombination mit traumatischen Hirnverletzungen²³zu bewerten.

Wir präsentieren hier ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung eines Thorax-Hemisektions-SCI auf T8-Wirbelebene in der weiblichen Long-Evans-Ratte und zur Beurteilung der Rückdlimb-Locomotor-Erholung im offenen Feld.

Protocol

Die in diesem Artikel beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt und von der Ethikkommission der Université de Montréal genehmigt. 1. Thorax-Hemisektions-Operation Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Handschuhe, Maske und Kleid), um eine aseptische Umgebung für die Operation zu erhalten. Reinigen Sie den operationsischen Bereich mit Alkoholtüchern und legen Sie sterile chirurgische Vorhänge über…

Representative Results

Reproduzierbare Läsionen mit hoher Konsistenz können mit der Hemisektionstechnik erzeugt werden. Um läsionengrößen zwischen versuchsexperimentellen Gruppen zu bewerten und zu vergleichen, kann die maximale Fläche der Läsion als Prozentsatz des gesamten Querschnitts des Rückenmarks leicht mit histologischer Färbung von Rückenmarksabschnitten berechnet werden. Abbildung 1 zeigt eine repräsentative Läsion des linken Hämicords und eine Überlagerung des Anteils der maximalen Läsion…

Discussion

Eine wesentliche Stärke der Hemisektionstechnik ist die Selektivität und Reproduzierbarkeit der Läsion, die zu einer verminderten Variabilität in histologischen und verhaltensbildenden Phänotypen zwischen Tieren führt²⁵. Um eine einseitige Läsion auf der entsprechenden Wirbelsäulenebene zu gewährleisten, ist eine genaue Identifizierung sowohl des richtigen Wirbelsegments als auch der Mittellinie des Rückenmarks von entscheidender Bedeutung. Da es eine Tendenz für das Rückenmark sein ka…

Materials

Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc