Summary

Bryst spinal Cord Hemisection kirurgi og åpen felt Locomotor vurdering i Rat

Published: June 26, 2019
doi:

Summary

Rotte bryst spinal hemisection er en verdifull og reproduserbar modell av ensidig ryggmargsskade for å undersøke nevrale mekanismer for Locomotor utvinning og behandling effekt. Denne artikkelen inneholder en detaljert steg-for-steg-veiledning for å utføre hemisection prosedyren og for å vurdere Locomotor ytelse på en åpen Arena.

Abstract

Ryggmargsskade (SCI) forårsaker forstyrrelser i motor, sensorisk, og autonom funksjon under nivået av lesjon. Eksperimentelle dyremodeller er verdifulle verktøy for å forstå nevrale mekanismer involvert i Locomotor utvinning etter SCI og til design terapi for kliniske populasjoner. Det er flere eksperimentelle SCI modeller inkludert kontusjon, kompresjon, og transection skader som brukes i en rekke arter. En hemisection innebærer ensidig transection av ryggmargen og forstyrrer alle stigende og synkende traktater på den ene siden bare. Spinal hemisection produserer en svært selektiv og reproduserbar skade i forhold til kontusjon eller komprimering teknikker som er nyttig for å undersøke neural plastisitet i spart og skadet trasé forbundet med funksjonell utvinning. Vi presenterer en detaljert steg-for-steg protokoll for å utføre en bryst hemisection på T8 vertebrale nivå i rotte som resulterer i en innledende lammelse av hindlimb bentap på siden av lesjon med gradert spontan utvinning av Locomotor funksjon over flere Uker. Vi tilbyr også en Locomotor scoring protokoll for å vurdere funksjonell utvinning i åpen-feltet. Det Locomotor vurderingen skaffer en lineær det å bli frisk profil og kan utført begge to tidlig og gjentatte ganger etter skaden for at akkurat skjermen dyrene for passende tid meningene i hvilket å oppførsel flere spesialisert opptreden tester. Den hemisection teknikken presenteres kan lett tilpasses andre transection modeller og arter, og Locomotor vurderingen kan brukes i en rekke SCI og andre skader modeller å score Locomotor funksjon.

Introduction

Ryggmargsskade (SCI) er forbundet med alvorlige forstyrrelser i motor, sensorisk, og autonom funksjon. Eksperimentelle dyr modeller av SCI er verdifulle verktøy for å forstå anatomiske og fysiologiske hendelser involvert i SCI patologi, for å undersøke nevrale mekanismer i reparasjon og utvinning, og til skjermen for effekt og sikkerhet for potensielle terapeutiske Intervensjoner. Rotta er de fleste vanligvis anvendt Art inne SCI forskning1. Rat modeller er lave kostnader, lett å reprodusere, og et stort batteri av atferdsmessige tester er tilgjengelige for å vurdere funksjonelle resultater2. Til tross for noen forskjeller i skriftsteder, den Rat ryggmargen aksjer samlet lignende Sensorimotor funksjoner med større pattedyr, inkludert primater3,4. Rotter likeledes aksje analog fysiologisk og opptreden konsekvensene å SCI det knytte til Human5. Ikke-menneskelige primater og store dyremodeller kan gi en nærmere tilnærming av menneskelig SCI6 og er avgjørende for å bevise behandling sikkerhet og effekt før menneskelig eksperimentering, men er mindre vanlig på grunn av etiske og dyrevelferd hensyn, utgifter og regulatoriske krav7.

Rat transection SCI modeller er utført av målrettede avbrudd i ryggmargen med en selektiv lesjon ved hjelp av en disseksjon kniv eller iridektomi saks etter en laminectomy. Sammenlignet med en fullstendig transection, delvis transection inne rotta resultater inne en færre meget streng skaden, lettere postoperativ dyr bekymre, spontan Locomotor det å bli frisk, og flere nær modeller SCI inne human hvilke er hovedsakelig ufullstendig med delvis sparing av vev som forbinder ryggmargen og supraspinal strukturer8. En ensidig hemisection forstyrrer alle stigende og synkende traktater på den ene siden, og produserer målbare og svært reproduserbar Locomotor underskudd, styrking utforskning av underliggende biologiske mekanismer. Den mest fremtredende funksjonell konsekvens av hemisection er en innledende lem lammelse på samme side og under nivået av lesjon med gradert spontan utvinning av Locomotor funksjon over flere uker9,10, 11 flere , 12. den hemisection modellen er spesielt nyttig for å undersøke neural plastisitet av skadede og gjenværende traktater og kretser forbundet med funksjonell utvinning9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Nærmere bestemt er hemisection utført på bryst nivå, det vil si over rygg kretsene som kontrollerer hindlimb bentap bevegelse, spesielt nyttig for å undersøke endringer i Locomotor kontroll. Som en ikke-lineær sammenheng eksisterer mellom lesjon alvorlighetsgrad og Locomotor utvinning etter SCI19, hensiktsmessig atferds-testing for å vurdere funksjonelle resultater er avgjørende i eksperimentelle modeller.

En allsidig akkumulator av opptreden prøver er anvendelig å vurdere spesifikk aspektene av funksjonell Locomotor det å bli frisk inne rotta2,20. Mange Locomotor prøver ikke skaffe pålitelig måler tidlig etter SCI idet rotter er også ufør å oppbacking deres kropp vekt. Et mål på spontan Locomotor ytelse som er følsom for underskudd tidlig etter skade, og krever ikke preoperativ opplæring eller spesialisert utstyr, er gunstig for å overvåke Locomotor utvinning for passende tidspunkt punkter for å supplement spesialiserte atferdsdata testing. The Martinez åpen felt vurdering10, opprinnelig utviklet for å evaluere Locomotor ytelse etter cervical sci i rotte, er en 20-punkts ordenstall score vurdere global Locomotor ytelse under spontan Overground bevegelse i en åpen-feltet. Scoring gjennomføres separat for hvert lem ved hjelp av en vurderingsmatrise som evaluerer spesifikke parametre for en rekke Locomotor tiltak inkludert bevegelse av ledd lem, vekt støtte, siffer posisjon, stepping evner, forlemen-hindlimb bentap koordinering, og hale Posisjon. Vurderings resultatet er avledet fra Beattie og Bresnahan (BBB) åpen felts skala, utformet for å evaluere Locomotor ytelse etter bryst kontusjon21. Det er tilpasset nøyaktig og pålitelig evaluere både forlemen og hindlimb bentap Locomotor funksjon, gjør det mulig for uavhengig vurdering av de ulike scoring parametre som ikke er mottagelig for den hierarkiske scoring av BBB, og gir en lineær utvinning profil10. I tillegg, i forhold til BBB, er vurderingen poengsum følsom og pålitelig i mer alvorlig skade modeller10,11,20,22. Vurderingen score har blitt brukt til å vurdere Locomotor svekkelse i rotte etter cervical10,12 og bryst9 sci alene og i kombinasjon med traumatisk hjerneskade23.

Vi presenterer her en detaljert steg-for-steg protokoll for å utføre en bryst hemisection SCI på T8 vertebrale nivå i den kvinnelige Long-Evans rotte, og for å vurdere hindlimb bentap Locomotor utvinning i åpen-feltet.

Protocol

Eksperimentene beskrevet i denne artikkelen ble utført i samsvar med retningslinjene for den kanadiske Council on Animal Care og ble godkjent av etikk komiteen ved Université de Montréal. 1. bryst hemisection kirurgi Bruk egnet verneutstyr (hansker, maske og kappe) for å opprettholde en aseptisk miljø for kirurgi. Rengjør operasjonsområdet med alkohol kluter, og plasser sterile kirurgiske forheng over operasjonsfeltet. Sterilisere kirurgiske verktøy og plasser på operasjonsf…

Representative Results

Å reproduserbar lesjoner med en høy grad av konsistens kan genereres med hemisection teknikk. Å vurdere og sammenligne lesjoner størrelser mellom eksperimentelle grupper, det maksimale arealet av lesjon som en prosentandel av den totale tverrsnitt av ryggmargen kan lett beregnes med histologiske farging av ryggmargen seksjoner. Figur 1 viser en representativ lesjon av venstre hemicord og en overlapping av andelen av maksimal lesjon område som deles mellom rotter med en gjennomsnittlig l…

Discussion

En stor styrke av det hemisection teknikk er det selektivitet og reproduserbarhet av det lesjon hvilke innlede å nedsatte variasjon inne histologiske og opptreden fenotyper imellom dyrene25. For å sikre en ensidig lesjon på riktig spinal nivå, er nøyaktig identifisering av både riktig vertebrale segmentet og ryggmargen midtlinjen kritisk. Som det kan være en tendens til ryggmargen å rotere i retning av kuttet under hemisection prosedyren, kan det være fordelaktig å stabilisere ledningen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institutes for Health Research (CIHR; MOP-142288) til m. m. ble støttet av en lønns pris fra fonds de Recherche Québec santé (FRQS), og en ble støttet av et fellesskap fra FRQS.

Materials

Baytril CDMV 11242
Blunt dissection scissors World Precision Instruments 503669
Buprenorphine hydrochoride CDMV
Camera lens Pentax C31204TH 12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera Basler acA2000-165uc 2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas Praxair
Cotton tipped applicators CDMV 108703
Delicate bone trimmers Fine Science Tools 16109-14
Dissecting knife Fine Science Tools 10055-12
Dumont fine forceps (#5) Fine Science Tools 11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H) CDMV 111689
Feedback-controlled heating pad Harvard Apparatus 55-7020
Female Long-Evans rats Charles River Laboratories Strain code: 006 225-250g
Gelfoam CDMV 102348
Curved hemostat forceps Fine Science Tools 13003-10
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Hydrogel 70-01-5022 Clear H20
Isofluorane CDMV 118740
Lactated Ringer's solution CDMV 116373
Lidocaine (2%) CDMV 123684
Needle 30 ga CDMV 4799
Open-field area Custom Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment CDMV 110704
Personal computer  With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline CDMV 1399
Proviodine CDMV 4568
Rodent Liquid Diet Bioserv F1268
Scalpal blade #11 CDMV 6671
Self-retaining retractor World Precision Instruments 14240
Vannas iridectomy spring scissors Fine Science Tools 15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer Dispomed 975-0510-000
VLC media player VideoLAN videolan.org/vlc

References

  1. Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: a systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
  2. Sedy, J., Urdzikova, L., Jendelova, P., Sykova, E. Methods for behavioral testing of spinal cord injured rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 32 (3), 550-580 (2008).
  3. Butler, A. B., Hodos, W. . Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , 139-152 (2005).
  4. Nudo, R. J., Masterton, R. B. Descending pathways to the spinal cord: a comparative study of 22 mammals. Journal of Comparative Neurology. 277 (1), 53-79 (1988).
  5. Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
  6. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), 302ra134 (2015).
  7. Talac, R., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25 (9), 1505-1510 (2004).
  8. Kwon, B. K., Oxland, T. R., Tetzlaff, W. Animal models used in spinal cord regeneration research. Spine. 27 (14), 1504-1510 (2002).
  9. Brown, A. R., Martinez, M. Ipsilesional motor cortex plasticity participates in spontaneous hindlimb recovery after lateral hemisection of the thoracic spinal cord in the rat. Journal of Neuroscience. 38 (46), 9977-9988 (2018).
  10. Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
  11. Martinez, M., Brezun, J. M., Zennou-Azogui, Y., Baril, N., Xerri, C. Sensorimotor training promotes functional recovery and somatosensory cortical map reactivation following cervical spinal cord injury. European Journal of Neuroscience. 30 (12), 2356-2367 (2009).
  12. Martinez, M., et al. Differential tactile and motor recovery and cortical map alteration after C4-C5 spinal hemisection. Experimental Neurology. 221 (1), 186-197 (2010).
  13. Leszczynska, A. N., Majczynski, H., Wilczynski, G. M., Slawinska, U., Cabaj, A. M. Thoracic hemisection in rats results in initial recovery followed by a late decrement in locomotor movements, with changes in coordination correlated with serotonergic innervation of the ventral horn. PLoS One. 10 (11), e0143602 (2015).
  14. Ballermann, M., Fouad, K. Spontaneous locomotor recovery in spinal cord injured rats is accompanied by anatomical plasticity of reticulospinal fibers. European Journal of Neuroscience. 23 (8), 1988-1996 (2006).
  15. Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
  16. Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
  17. Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional ‘detour’ in the hemisected spinal cord. The European journal of neuroscience. 34 (8), 1256-1267 (2011).
  18. Shah, P. K., et al. Use of quadrupedal step training to re-engage spinal interneuronal networks and improve locomotor function after spinal cord injury. Brain. 136, 3362-3377 (2013).
  19. Schucht, P., Raineteau, O., Schwab, M. E., Fouad, K. Anatomical correlates of locomotor recovery following dorsal and ventral lesions of the rat spinal cord. Experimental Neurology. 176 (1), 143-153 (2002).
  20. Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
  21. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  22. Barros Filho, T. E. P. d., Molina, A. E. I. S. Analysis of the sensitivity and reproducibility of the Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) scale in Wistar rats. Clinics (Sao Paulo, Brazil). 63 (1), 103-108 (2008).
  23. Inoue, T., et al. Combined SCI and TBI: recovery of forelimb function after unilateral cervical spinal cord injury (SCI) is retarded by contralateral traumatic brain injury (TBI), and ipsilateral TBI balances the effects of SCI on paw placement. Experimental Neurology. 248, 136-147 (2013).
  24. Vichaya, E. G., Baumbauer, K. M., Carcoba, L. M., Grau, J. W., Meagher, M. W. Spinal glia modulate both adaptive and pathological processes. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (7), 969-976 (2009).
  25. Ahmed, R. U., Alam, M., Zheng, Y. -. P. Experimental spinal cord injury and behavioral tests in laboratory rats. Heliyon. 5 (3), e01324 (2019).
  26. Ham, T. R., et al. Automated gait analysis detects improvements after intracellular sigma peptide administration in a rat hemisection model of spinal cord injury. annals of biomedical engineering. 47 (3), 744-753 (2019).
  27. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  28. Neckel, N. D., Dai, H. N., Burns, M. P. A novel multidimensional analysis of rodent gait reveals the compensation strategies employed during spontaneous recovery from spinal cord and traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. , (2018).
  29. Fouad, K., Metz, G. A. S., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E. Treadmill training in incomplete spinal cord injured rats. Behavioural Brain Research. 115 (1), 107-113 (2000).
  30. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  31. Alluin, O., et al. Kinematic study of locomotor recovery after spinal cord clip compression injury in rats. Journal of Neurotrauma. 28 (9), 1963-1981 (2011).
  32. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Effect of locomotor training in completely spinalized cats previously submitted to a spinal hemisection. Journal of Neuroscience. 32 (32), 10961-10970 (2012).
  33. Behrmann, D. L., Bresnahan, J. C., Beattie, M. S., Shah, B. R. Spinal cord injury produced by consistent mechanical displacement of the cord in rats: behavioral and histologic analysis. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 197-217 (1992).
  34. Soblosky, J. S., Colgin, L. L., Chorney-Lane, D., Davidson, J. F., Carey, M. E. Ladder beam and camera video recording system for evaluating forelimb and hindlimb deficits after sensorimotor cortex injury in rats. Journal of Neuroscience Methods. 78 (1-2), 75-83 (1997).
  35. Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nature Neuroscience. 7 (3), 269-277 (2004).
  36. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  37. van den Brand, R., et al. Restoring voluntary control of locomotion after paralyzing spinal cord injury. Science. 336 (6085), 1182-1185 (2012).
  38. Lukovic, D., et al. Complete rat spinal cord transection as a faithful model of spinal cord injury for translational cell transplantation. Scientific Reports. 5, 9640-9640 (2015).
  39. Wilson, S., et al. The hemisection approach in large animal models of spinal cord injury: overview of methods and applications. Journal of Investigative Surgery. 10, 1-12 (2018).
  40. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Incomplete spinal cord injury promotes durable functional changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 124-134 (2012).
  41. Martinez, M., Delivet-Mongrain, H., Leblond, H., Rossignol, S. Recovery of hindlimb locomotion after incomplete spinal cord injury in the cat involves spontaneous compensatory changes within the spinal locomotor circuitry. Journal of Neurophysiology. 106 (4), 1969-1984 (2011).
  42. Capogrosso, M., et al. A brain–spine interface alleviating gait deficits after spinal cord injury in primates. Nature. 539, 284-288 (2016).

Play Video

Cite This Article
Brown, A. R., Martinez, M. Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat. J. Vis. Exp. (148), e59738, doi:10.3791/59738 (2019).

View Video