Cirurgia do Hemisection da medula espinal torácica e avaliação do locomotor do aberto-campo no rato

Summary

O hemisection espinal torácico do rato é um modelo valioso e reprodutível de ferimento unilateral da medula espinal para investigar os mecanismos neural da recuperação locomotora e da eficácia do tratamento. Este artigo inclui um guia detalhado passo a passo para realizar o procedimento de hemisection e avaliar o desempenho locomotor em uma arena de campo aberto.

Abstract

Ferimento da medula espinal (SCI) causa distúrbios na função motora, sensorial, e autonômica abaixo do nível da lesão. Modelos animais experimentais são ferramentas valiosas para compreender os mecanismos neurais envolvidos na recuperação locomotora após a SCI e para projetar terapias para populações clínicas. Existem vários modelos experimentais de SCI, incluindo contusão, compressão e ferimentos de transecção que são usados em uma grande variedade de espécies. Um hemisection envolve o transecção unilateral da medula espinal e interrompe todos os intervalos ascendentes e descendentes em um lado somente. O hemisection espinal produz um ferimento altamente seletivo e reprodutível em comparação às técnicas da contusão ou da compressão que é útil para investigar a plasticidade neural em caminhos poupados e danificados associados com a recuperação funcional. Nós apresentamos um protocolo detalhado passo a passo para executar um hemisection torácico no nível T8 vertebral no rato que conduz a uma paralisia inicial do hindmembro na lateral da lesão com recuperação espontânea graduada da função locomotora sobre diversos Semanas. Nós também fornecemos um protocolo de Pontuação locomotora para avaliar a recuperação funcional no campo aberto. A avaliação locomotora fornece um perfil linear da recuperação e pode ser executada cedo e repetidamente após ferimento a fim fazer exame exatamente dos animais para os pontos de tempo apropriados em que para conduzir um teste comportável mais especializado. A técnica de hemisection apresentada pode ser prontamente adaptada a outros modelos e espécies de transecção, e a avaliação locomotora pode ser utilizada em uma variedade de SCI e outros modelos de lesão para pontuar a função locomotora.

Introduction

Ferimento da medula espinal (SCI) é associado com os distúrbios severos na função motora, sensorial, e autonômica. Modelos experimentais de animais de SCI são ferramentas valiosas para compreender os acontecimentos anatômicos e fisiológicos envolvidos na patologia da SCI, para investigar os mecanismos neurais na reparação e recuperação, e para a tela para a eficácia e segurança do potencial terapêutico Intervenções. O rato é a espécie mais comumente utilizada na pesquisa SCI¹. Modelos de ratos são de baixo custo, fácil de reproduzir, e uma grande bateria de testes comportamentais estão disponíveis para avaliar os resultados funcionais². Apesar de algumas diferenças em locais do trato, a medula espinhal de ratos compartilha funções sensório-motoras globais semelhantes com mamíferos maiores, incluindo primatas^3,4. Os ratos também compartilham conseqüências fisiológicas e comportamentais análoga à SCI que se relacionam com os seres humanos⁵. Primatas não humanos e grandes modelos animais podem proporcionar uma aproximação mais estreita da SCI humana⁶ e são essenciais para comprovar a segurança e eficácia do tratamento antes da experimentação humana, mas são menos comumente usados devido ao bem-estar ético e animal considerações, despesas e requisitos regulamentares⁷.

Os modelos da ficção científica da transecção do rato são executados pela interrupção alvejada da medula espinal com uma lesão seletiva usando uma faca da dissecção ou uma tesoura Iridectomia após um laminectomy. Comparado a um transecção completo, o transecção parcial nos resultados do rato em um ferimento menos severo, em um cuidado animal postoperative mais fácil, em uma recuperação espontânea do locomotor, e em uns modelos mais pròxima Sci nos seres humanos que é predominante incompleto com poupar parcial de tecido que conecta a medula espinal e as estruturas do supraspinal⁸. Um hemisection unilateral interrompe todos os intervalos ascendentes e descendentes em um lado somente, e produz deficits quantificáveis e altamente reprodutíveis do locomotor, melhorando a exploração dos mecanismos biológicos subjacentes. A conseqüência funcional a mais proeminente do hemisection é uma paralisia inicial do membro no mesmo lado e abaixo do nível da lesão com recuperação espontânea graduada da função locomotora sobre diversas semanas^{9,10, 11} anos de ^{, 12}. o modelo de hemisection é particularmente útil para investigar a plasticidade neural de tratos e circuitos danificados e residuais associados à recuperação funcional^{9,11,12, 13,14,15,16,17,18}. Especificamente, a hemisection realizada no nível torácico, ou seja, acima dos circuitos espinhais que controlam a locomoção do membro posterior, é particularmente útil para investigar mudanças no controle locomotor. Como uma relação não-linear existe entre a severidade da lesão e a recuperação locomotora após SCI¹⁹, o teste comportamental adequado para avaliar os desfechos funcionais é primordial em modelos experimentais.

Uma bateria abrangente de testes comportamentais está disponível para avaliar aspectos específicos da recuperação funcional do locomotor no rato^2,20. Muitos testes locomotores não fornecem medidas confiáveis cedo após SCI como ratos são muito deficientes para apoiar o seu peso corporal. Uma medida do desempenho locomotor espontâneo que é sensível aos deficits cedo após ferimento, e não exige o treinamento pré-operativo ou o equipamento especializado, é benéfica a fim monitorar a recuperação locomotora para os pontos de tempo apropriados em que para suplemento de testes comportamentais especializados. O escore de avaliação de campo aberto de Martinez¹⁰, originalmente desenvolvido para avaliar o desempenho locomotor após Sci cervical no rato, é um escore ordinal de 20 pontos avaliando o desempenho locomotor global durante a locomoção espontânea do overground em um campo aberto. A pontuação é conduzida separadamente para cada membro usando uma rubrica que avalia parâmetros específicos de uma série de medidas locomotoras, incluindo movimento articular do membro, suporte de peso, posição dos dígitos, habilidades de piso, coordenação de membros posteriores, e cauda Posição. O escore de avaliação é derivado da escala de avaliação de campo aberto de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) projetada para avaliar o desempenho locomotor após a contusão torácica²¹. Ele é adaptado para avaliar de forma precisa e confiável tanto a função locomotora de membros posteriores quanto as do membro posterior, permite a avaliação independente dos diferentes parâmetros de pontuação que não são adaptáveis com a pontuação hierárquica do BBB, e fornece uma recuperação linear do perfil¹⁰. Adicionalmente, em comparação com o BBB, o escore de avaliação é sensível e confiável em modelos de lesão mais graves^10,11,20,22. O escore de avaliação tem sido utilizado para avaliar o comprometimento locomotor no rato após^10,12 cervicais e⁹ de Sci torácica isoladamente e em combinação com lesão cerebral traumática²³.

Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado passo a passo para executar um hemisection torácico SCI no nível T8 vertebral no rato longo-Evans fêmea, e para avaliar a recuperação do locomotor do hindmembro no aberto-campo.

Protocol

Os experimentos descritos neste artigo foram realizados em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense de cuidado animal e foram aprovados pelo Comitê de ética da Université de Montréal. 1. cirurgia de hemisection torácica Use o equipamento de proteção apropriado (luvas, máscara, e vestido) para manter um ambiente asséptico para a cirurgia. Limpe a área cirúrgica com toalhetes de álcool e coloque cortinas cirúrgicas estéreis sobre o campo cirúrgico. Esteriliza…

Representative Results

Lesões reprodutíveis com alto grau de consistência podem ser geradas com a técnica de hemisection. Para avaliar e comparar os tamanhos das lesões entre os grupos experimentais, a área máxima da lesão como uma porcentagem do cross-section total da medula espinal pode prontamente ser calculada com mancha histológica de seções da medula espinal. A Figura 1 mostra uma lesão representativa do hemicord esquerdo e uma sobreposição da proporção da área máxima da lesão compartilhad…

Discussion

A maior força da técnica de hemisection é a seletividade e reprodutibilidade da lesão que leva à redução da variabilidade nos fenótipos histológicos e comportamentais entre os animais²⁵. A fim assegurar uma lesão unilateral a nível espinal apropriado, a identificação exata do segmento vertebral apropriado e do midline da medula espinal é crítica. Como pode haver uma tendência para a medula espinhal girar na direção do corte durante o procedimento de hemisection, pode ser benéfic…

Materials

Baytril	CDMV	11242
Blunt dissection scissors	World Precision Instruments	503669
Buprenorphine hydrochoride	CDMV
Camera lens	Pentax	C31204TH	12.5-75mm, f1.8, 2/3" format, C-mount
CMOS video camera	Basler	acA2000-165uc	2/3" format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3
Compressed oxygen gas	Praxair
Cotton tipped applicators	CDMV	108703
Delicate bone trimmers	Fine Science Tools	16109-14
Dissecting knife	Fine Science Tools	10055-12
Dumont fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2  suture (J392H)	CDMV	111689
Feedback-controlled heating pad	Harvard Apparatus	55-7020
Female Long-Evans rats	Charles River Laboratories	Strain code: 006	225-250g
Gelfoam	CDMV	102348
Curved hemostat forceps	Fine Science Tools	13003-10
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Hydrogel	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
Lactated Ringer's solution	CDMV	116373
Lidocaine (2%)	CDMV	123684
Needle 30 ga	CDMV	4799
Open-field area	Custom		Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height
Opthalmic ointment	CDMV	110704
Personal computer			With USB3 connectivity to record video with the listed camera
Physiological saline	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
Rodent Liquid Diet	Bioserv	F1268
Scalpal blade #11	CDMV	6671
Self-retaining retractor	World Precision Instruments	14240
Vannas iridectomy spring scissors	Fine Science Tools	15002-08
Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer	Dispomed	975-0510-000
VLC media player	VideoLAN		videolan.org/vlc