Summary
여기에서, 우리는 형광 성 면역 조직 화학 및 순차적인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 분석된 포유류 배반증 의 형성 및 intramembranous 골화를 조사하기 위하여 성숙한 마우스 말두 지골 절단의 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
여기에서, 우리는 성인 마우스 말단 말두 지골 (P3) 절단의 프로토콜을 제시, 상형 재생의 절차적으로 간단하고 재현 가능한 포유류 모델, 이는 배반 형성및 분석 된 비정형 골화를 포함 형광 면역 조직 화학 및 순차적 인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT). 포유류 재생은 말단 지골(P3)의 말단 영역을 경각시키는 절단으로 제한된다; 더 근위 수준에서 절단 된 숫자는 재생및 섬유 성 치유와 흉터 형성을 받아야하지 않습니다. 재생 반응은 증식 블라스트ema의 형성에 의해 매개되고, 절단 된 골격 길이를 복원하기 위해 intramembranous 골화를 통한 뼈 재생이 뒤따릅니다. P3 절단은 포유동물에서 의상 재생을 조사하는 전임상 모델이며, 성공적인 재생 반응으로 섬유성 치유를 대체하는 치료 전략의 설계를 위한 강력한 도구이다. 우리의 프로토콜은 1) 형광 면역 성 화학을 사용하여 1) 조기 및 후기 블라베ema 세포 집단을 식별하고, 2) 재생의 맥락에서 연구 revascularization, 3) 복잡한 뼈에 대한 필요없이 intramembranous 골화를 조사 안정화 장치. 우리는 또한 절단 후 형태 학적 변화를 검사할 뿐만 아니라 재생 과정에서 동일한 숫자의 볼륨과 길이 변화를 정량화하기 위해 고해상도 이미지를 만들기 위해 생체 내 μCT에서 순차적 사용을 입증합니다. 우리는 이 프로토콜이 포유류에서 에피소드및 조직 재생 반응을 조사하기 위해 엄청난 유용성을 제공한다고 믿습니다.
Introduction
포유동물은 인간 및 마우스를 포함하며, 말단 지골(P3)의 말단 절단 후 그들의 자릿수의 팁을 재생할 수 있는 능력을 가지며,2,3. 마우스에서, 재생 반응은 절단 수준 의존; 점점 근위 수 자릿수 절단P3 네일 매트릭스4,5,6에 절단 시절단에서 완전한 재생 실패까지 점진적으로 감쇠 재생 반응을 표시 , 7명 , 8.P3 재생은 절단된 구조물을 재생하기 위해 형태 형성을 겪는 증식 세포의 집단으로서 정의되는 블라스마의 형성에 의해 매개된다9. 절단에 의해 손실 된 구조를 재생하는 블라스테마의 형성, 프로세스 는 상형 재생이라고, 부상 후 기존의 조직 수리에서 다조직 수준의 P3 재생 반응을 구별6, 10. P3 재생은 상처 치유11,12,뼈 증11,12,및 12를 포함한 복잡한 재생 과정을 조사하는 재현 가능하고 절차적으로 간단한 모델입니다. 혈관신생13,말초신경재생14, 골수변환을 통한 골수변환(15).
면역성 화학을 이용한 이전 연구는 블라마가 이질성, 혈관, 저산소성 및 매우 증식성11,13,15,16임을입증했다. 말단 P3 절단 에 이어, 초기 블라스트마는 처음에 P3 골막 및 내분과 연관되며 뼈표면(15)에인접한 강력한 증식 및 초기 골형성을 특징으로 한다. 뼈 분해 및 상처 폐쇄 후, 이질적인 blastema는 후피오스텔스와 내분과 관련된 세포의 병합에 의해 형성되고, 그 다음에는 인트라엠브라우스 골화를 통해 뼈를 포함한 골반 성분의 분화가 뒤따릅니다. 15.
상해에 응하여 뼈 수리는 전형적으로 endochondral 골화에 의해, 즉 후속 뼈 형성을 위한 템플릿을 형성하는 초기 연골 굳은 살을 통해 발생합니다17,18. 긴 뼈 intramembranous 골화, 즉, 연골 중간체없이 뼈 형성, 일반적으로 복잡한 산만 장치 또는 수술 고정을 사용하여 유도19,20. 자리 재생 반응은 기존의 intramembranous ossification 모델에 비해 이점을 제공하는 전 임상 모델입니다: 1) intramembranous ossification을 자극하기 위하여 외부 또는 내부 고정 포스트 상해를 요구하지 않습니다, 2) 각 동물의 4자리 숫자를 사용하여 수행하여 동물 사용을 최소화하면서 샘플을 최대화하고 3) 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 분석을 쉽고 빠르게 수행 할 수 있습니다.
본 연구에서, 우리는 재현 가능하고 강력한 재생 반응을 달성하기 위해 표준화 된 P3 절단 평면을 보여줍니다. 또한, 파라핀 섹션을 사용하여 파라핀 섹션을 사용하여 파라페증 형성, 재생의 맥락에서의 재혈관화, 인트라엠브러스를 통한 뼈로의 배반 변환을 시각화하는 최적화된 형광 면역조직 화학 프로토콜을 시연합니다. 고성화. 우리는 또한 재생 과정에서 동일한 숫자의 뼈 형태, 부피 및 길이의 변화를 식별하기 위해 순차적 인 생체 내 μCT의 사용을 보여줍니다. 이 프로토콜의 목적은 절단 후 포유류 배증마 형성을 조사하고 2 가지 기술, 형광 면역 조직 화학 및 생체 내 순차적 μCT를 입증하는 것입니다.
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Protocol
모든 동물 사용 및 기술은 텍사스 A&M 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 표준 운영 절차를 준수했습니다.
1. 성인 마우스 뒷다리 말단 P3 절단
- 산소에 이소플루란 가스를 사용하여 8~ 12주령 CD-1마우스(물자표)를 마취; 처음에는 챔버에서 3 %에서 마취되고 수술 기간 동안 2 %의 이소플루란이 코콘에 의해 공급됩니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
참고: 우리의 실험실에서 표준화된 성인 P3 절단 연구는 8 에서 12 주 된 마우스에 수행되고, 재생 반응은 모든 시험된 긴장에서 보존됩니다. - 10 x 해부 현미경으로 수술용 포비도 요오드와 70 % 에탄올로 뒷다리의 숫자를 살균하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 다듬습니다. 국소 부피바카인 1 μL을 국소로 바르고 수술 부위를 마취시다.
- 멸균 #10 메스를 사용하여 각 뒷다리의 자리 2 및 4에 말단 지골(P3)의 말단 끝을 절단한다(도1A). 절단은 수술 기구의 살균을 포함하여 무균 조건하에서 수행되어야합니다. 해부 현미경 아래에서 뒷발을 부드럽게 재생하여 내측 숫자 표면을 노출시십시오. 도 1B에나타낸 절단을 수행하기 위해 지방패드와 평행한 각도로 메스를 잡습니다. 절단 부위에 국소 부피바카인 1 μL을 적용하십시오.
참고: 절단은 못 기관, 진피, P3 뼈, 혈관 및 신경을 transects, 그러나 골수 구멍 또는 자리 지방 패드를 transect하지 않습니다. 출혈이 관찰되면 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 직접 압력을 가하십시오. - 표준 P3 절단 평면은 P3 뼈 부피21의약 15%-20%를 제거합니다. MicroCT 스캐닝(아래 참조)을 수행하여 정확한 절단 길이를 확인할 수 있습니다.
- 깨끗한 케이지에 마우스를 반환하고 상처 드레싱없이 상처가 치유 될 수 있도록. 3일 동안 마우스를 모니터링하여 마우스가 정상 활동으로 돌아오도록 합니다.
2. 숫자 수집 및 조직 준비
- 폐쇄된 챔버에서 이산화탄소(CO2)를 사용하여 마우스를 안락사시키고, 이어서 자궁 경부 탈구를 실시한다.
- 메스를 사용하여 인접한 뼈 세그먼트인 중간 지골(P2) 골격을 약 제2 복부 지방 패드 들여쓰기에서 중간 방향으로 분할합니다. 10 mL 신선한 완충 아연 포름민 고정제를 함유한 20 mL 의 scintillation 바이알로 숫자를 옮기고, 18% 포름알데히드 용액(재료 표참조). 고정 부피는 존재하는 조직의 부피의 20 배 이상이어야합니다.
참고: 숫자는 전체 재생 반응을 조사하기 위해 절단 후 다양한 시점에서 수집됩니다. 일반적으로, 초기 블라스터마 형성의 경우, 뼈 조직 용해 및 상처 폐쇄 수집 시간은 절단 후 4-8 일 (DPA)입니다. 초기 골성 블라페마를 조사하기 위해 수집 시간은 9 및 10 DPA이고, 지속적인 골 재생 및 광물화를 시각화하기 위해, 수집 시간은 14, 21 및 28 DPA이다. 절단되지 않은 자릿수도 수집됩니다. - 셰이커에 부드럽게 혼합하여 실온에서 24-48 시간 동안 숫자를 고정하십시오.
- 고정제를 제거하고 실온에서 1x 인산완충식염수린(PBS)의 5 mL에서 5분 동안 2x의 숫자를 세척한다.
- 신선한 데칼시피어 I(재료 표참조)의 10mL를 신틸레이션 바이알에 10% 포름산 용액을 놓고 실온에서 2시간 동안 셰이커에 부드럽게 섞습니다. 2시간 후, 데칼시피어 I를 신선한 용액으로 바꾸고 실온에서 하룻밤 사이에 셰이커에 부드러운 혼합으로 디칼시피(decalcify) 숫자를 바꿉시됩니다.
- 데칼시피어 I을 제거하고 실온에서 1x PBS의 5 mL에서 5분 동안 2x의 자릿수를 세척한다.
-
등급이 매겨진 에탄올 계열을 통해 숫자를 처리합니다. 이 공정은 총 40자리 미만인 경우 각 액체의 10 mL를 사용하여 20 mL 의 송신 바이알에서 수동으로 수행 될 수 있습니다.
- 실온에서 신선한 70% 에탄올에 2개의 침지와 함께 셰이커에 1h, 실온에서 신선한 95% 에탄올에 2개의 침지와 셰이커에 1시간씩 부드럽게 섞어 줍니다.
- 실온에서 신선한 100% 에탄올 2번의 세척으로 숫자 탈수를 완료하고 셰이커에 부드럽게 섞어 각 1시간씩 섞습니다. 최종 100% 에탄올 세척은 하룻밤 동안 방치할 수 있다.
- 동일한 번화가 유리병에서 100% 에탄올을 10 mL의 신선한 자일렌으로 교체하고 실온에서 1.5 시간 동안 화학 연기 후드에 바이알을 놓습니다. 화학 연기 후드에 자일렌을 신선히 씻어실 때 실온에서 1.5시간 동안 총 2번의 세척을 반복합니다.
- 자일렌을 68°C로 용융된 액체 파라핀 왁스로 교체하고, 바이알을 68°C에서 2시간, 2회 동안 인큐베이터에 놓는다. 파라핀 왁스에 4 회 침지 한 후, 파라핀 절편을 위한 숫자를 임베드한다.
참고: 이와 같은 지침에 따라 자동 프로세서에서 자골을 처리하기 위해 수행할 수 있습니다. - 마이크로토메를 사용하여 4-5 μm 두께의 단면 자릿수. 38-41°C 의 수조를 사용하여 단면 샘플을 조직학적 접착제 용액으로 보충하여 샘플이 슬라이드에 부착되도록 합니다. 슬라이드를 37°C 슬라이드 워온에 놓고 건조시십시오.
3. 성인 마우스 자릿수의 면역 조직화학적 염색으로 블라스터마 형성 및 무분비 성 오스화 조사
- 65°C에서 45분 동안 가열한 다음 37°C에서 15분 이상 가열하여 시료가 슬라이드에 부착되도록 합니다.
- 자일렌 5분, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈, 물에 잠기면 슬라이드를 2x 분리하고 재수화합니다. 50-100 mL 용량 염색 항아리에 슬라이드를 놓고 트웬 20 (TBST)와 1 x 트리스 버퍼링 식염수에 침지 유지.
참고: 염색 공정 전반에 걸쳐 시료가 건조되지 않도록 하십시오. 모든 TBST 단계에서 슬라이드는 최대 2시간까지 배양할 수 있습니다. - 가습 챔버를 준비합니다. 베이스에 축축한 티슈 페이퍼가 있는 1인치 깊이의 플라스틱 슬라이드 박스만으로도 충분합니다.
- Runx2, Osterix (OSX) 및 증식 세포 핵 항원 (PCNA)에 대한 열 검색 솔루션을 준비합니다. 초기 골전균 마커인 Runx2의 항원 회수를 위해, Tris-EDTA, pH 8의 1x 용액을 준비한다. 조골 마커, OSX의 경우, 섭산염 완충액, pH 6의 1x 용액을 준비한다. PCNA 면역 염색은 어느 용액에서든 수행될 수 있다.
- 블라스마 마커 CXCR422 및 내피 세포 마커 폰 윌레브란트 팩터 8(vWF)에 대한 프로틴라제 K 항원 회수 용액을 마이크로원심분리튜브에 슬라이드당 100 μL의 단백질라제 K 용액을 배치하고 37°C로 가열하여 준비한다(대략 약 100°F) 5분).
참고: Runx2, OSX 및 PCNA에 대한 항원 회수는 열 회수를 사용하여 수행되며, CXCR4 및 vWF 항원 회수는 단백질타아제 K 처리를 통해 수행된다. - 열이 필요한 항체 검색의 경우, 적절한 항원 검색 용액에 염색 용기에 슬라이드를 담그십시오. 95°C에서 25분간 가열하여 끓는 일이 발생하지 않도록 합니다. 열원에서 얼룩진 항아리를 제거하고 실온에서 35 분 동안 식힙니다.
- Proteinaase K 항원 회수의 경우, 가습 챔버에 평평하게 슬라이드를 놓고, 미리 데운 단백질라제 K 100 μL을 슬라이드 에 놓습니다. 슬라이드가 건조해지지 않도록 작은 파라필름 스트립으로 슬라이드를 덮습니다. 37 °C에서 12 분 동안 배양 슬라이드.
- 항원 회수 후 염색 항아리에 1 x TBST에서 5 분 동안 3 회 슬라이드를 씻으십시오.
- 염색 용기에서 슬라이드를 제거하고 가습 챔버에 놓습니다. 슬라이드에 블로킹 용액(재료 표)을 6-7방울 떨어뜨리고 슬라이드가 건조되지 않도록 신선한 파라핀 필름으로 슬라이드를 덮습니다. 실온에서 1 시간 동안 슬라이드를 인큐베이팅하십시오.
- 항체를 희석항체로 희석시킴으로써 1차 항체를 준비한다(물질표). 상이한 숙주 종으로부터 유래된 3s. 원발성 항체에 대한 각 원발성 항체 용액을 와류로 결합할 수 있다.
참고: Runx2 (토끼 안티 Runx2 항체, 1 : 250 희석, PCNA (단일 클론 마우스 안티 PCNA 항체, 1 : 2,000 희석, 0.5 μg / mL)의 최종 농도에서 및 OSX (토끼 안티 OSX)와 결합된 면역 조직 화학 적 염색 PCNA와 결합된 0.125 μg/mL의 최종 농도에서 1:400 희석은 그림2에 나타내고 있다. 본 연구에서 사용된 마우스 항-PCNA 항체는 매우 특이적이고 이 프로토콜에 설명된 것 이상의 추가 차단 단계가 필요하지 않습니다. CXCR4(래트 항-CXCR4 항체, 2 μg/mL의 최종 농도에서 1:500 희석) 및 vWF(토끼 항인간 vWF VIII 항체, 1:800 희석, 41.25 μg/mL)를 이용한 면역성 화학 염색은 도2에 도시되어 있다. 1 차 항체는 이 프로토콜의 조건하에서 우리의 실험실에 의해 최적화되고 시험되고 물자의표에 열거됩니다. - 조심스럽게 파라핀 필름을 제거하고, 과도한 차단 용액을 제거하기 위해 티슈 페이퍼에 슬라이드를 부드럽게 배출합니다. 슬라이드에 1차 항체 용액 100-200 μL을 놓고 파라필름 커버를 교체한 다음 가습 챔버로 되돌아갑니다. 4°C에서 밤새 밀폐된 가습 챔버에서 슬라이드를 인큐베이션합니다.
참고: 차단 용액을 배출하는 동안 슬라이드가 건조해지지 않도록 하십시오. 이 단계는 빠르게 수행됩니다. - 조심스럽게 파라필름을 제거하고 슬라이드에서 1차 항체 용액을 부드럽게 배출합니다. 슬라이드를 신선한 1X TBST가 들어 있는 염색 용기에 놓습니다. 신선한 1x TBST로 5분 3회 세척합니다.
- 항체 희석제(표 물질)와 결합하여 이차항체를준비한다. 상이한 종으로부터 유래된 상이한 형광단에 공액화된 3s. 이차 항체에 대한 이차 항체 용액이 결합될 수 있다.
참고: 형광 이차 항체는 빛에 민감하다. Runx2용 알렉사 플루어 488-컨쥬게이징 염소 안티 토끼 IgG (H+L), OSX, 및 vWF, 알렉사 플루어 568-컨쥬게이트 염소 안티 쥐 IgG (H +L) CXCR4에 대 한, 그리고 알렉사 플루어 647-컨쥬게이트 염소 안티 마우스 IgG (H+L) PCNA에 대 한, 희석 1:500 4 μg/mL의 최종 농도 그림 2에서 사용되었습니다. - 슬라이드에 200 μL의 이차 항체 용액을 놓고 신선한 파라핀 필름으로 슬라이드를 덮고 가습 챔버로 돌아갑니다. 실온에서 45 분 동안 닫힌 가습 챔버에서 슬라이드를 인큐베이션합니다. 빛을 피하기 위해 가습 챔버가 닫혀 있는지 확인하십시오.
- 조심스럽게 파라핀 필름을 제거하고 슬라이드에서 이차 항체 용액을 부드럽게 배출합니다. 슬라이드를 신선한 1x TBST가 들어 있는 염색 용기에 놓습니다. 신선한 1x TBST로 5분 3x로 씻으소서. 빛을 피하십시오.
- 핵 얼룩을 준비합니다. DAPI 20 μL(재고 DAPI 용액은 H2O에서 5 mg/mL)을 1x PBS의 200 mL에 추가하고 균질성을 보장하기 위해 힘차게 흔들어 줍니다. DAPI-PBS 솔루션에서 5분 동안 슬라이드를 담그십시오. 빛을 피하십시오.
- dH 2O로3분간 세척하고 슬라이드가 공기 건조시키거나 슬라이드에서 물을 부드럽게 흡인할 수 있도록 하여 진공 청소기 로 시료가 방해받지 않도록 합니다. 빛을 피하십시오.
- 100 μL의 페이드 방지 장착 매체(재료표)를 사용하여 조심스럽게 커버 슬립 건식 슬라이드; 장착 단계 동안 슬라이드에 기포가 형성되는 것을 피하십시오. 슬라이드를 평평하게 보관하고 장착 매체가 방광 용기에 실온에서 하룻밤 동안 건조되도록 하십시오. 마운팅 매체가 건조된 후, 볼 준비가 될 때까지 4°C의 내광 용기에 평평하게 밀어 보관하십시오.
참고: 장착 후 허용되지 않는 수준의 기포가 존재하는 경우 장착 된 슬라이드를 1x PBS에 부드럽게 배치 할 수 있으며 커버 슬립을 제거 할 수 있으며 슬라이드를 다시 물로 헹구고 다시 건조하면 다시 장착 할 수 있습니다.
4. 현미경 검사법 및 심상 분석
참고: 형광 감소 현미경 및 관련 소프트웨어를 이용한 이미징 및 분석, 3개의 형광 필터(Alexa Fluor 488, 568 및 647 nm 신호를 시각화하기 위해)와 DAPI(419 nm)가 이 실험에 사용된다.
- 전체 블라스테마 영역을 캡처하기 위해 10배 배율로 슬라이드를 이미지화합니다.
참고: 증식 하는 조골 1 차 항체 검출은 공동 표지된 세포의 잘못된 식별을 최소화하기 위해 비 중첩 방출 스펙트럼과 이차 항체(Alexa Fluor 488 및 647)를 이용합니다. 자동 형광 신호의 배경 빼기는 488 또는 647 신호의 무결성을 보장하기 위해 568 nm 필터를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 블래스터마 1차 항체 검출은 이차 항체(Alexa Fluor 488 또는 568)를 이용한다. 488-컨쥬게이트 항체를 사용하는 경우 568 필터로 자동형광 신호의 배경 감산이 수행될 수 있으며, 488 필터는 568-컨쥬게이트 항체를 사용한다. 자동형광 신호는 전형적으로 네일 플레이트 및 적혈구와 연관되어 있으며, 488, 568 및 647 필터에서 관찰된다.
5. 순차적 인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT)
- 절단 1일 전에 스캔한 동일한 동물의 재생 자릿수(미암절단), 1 DPA, 및 vivaCT 40(물자 표)를 이용하여 28DPA에서완전한 재생이 완료될 때까지 다양한 시점에서 이 실험에서 수행및 도시 그림 3A.
- μCT를 튜브로 코디하여 μCT 동물 챔버로 산소가 유입될 수 있도록 하여 이소플루란을 포획하는 활성탄 필터가 장착되어 있습니다.
참고: μCT 동물 챔버가 단단히 밀폐되어 있는지 확인하십시오. 이러한 방식으로, 동물 코 콘은 스캔 하는 동안 마우스에 이소플루란을 공급 하기 위해 필요 하지 않습니다. - μCT 스캐닝 매개변수를 준비합니다. 숫자는 10.5 μm의 복셀 크기, 55kVp, 연속 회전을 사용하여 180°당 1000개의 프로젝션이 있는 145uA, 200msec의 통합 시간으로 스캔당 최대 213개의 조각으로 스캔됩니다. 이 실험에서 수행된 스캔의 길이는 약 9분입니다. 감소된 전류는 비례적으로 증가된 통합 시간으로 보상할 수 있지만 스캔 시간이 길어집니다.
- 이소플루란을 사용하여 성인 마우스를 마취; 처음에는 챔버에서 3 %에서 마취한 다음 스캔 기간 동안 μCT 동물 챔버에 공급 된 1.5 % 이소플루란이 뒤따릅니다. 마우스를 림스 플랫폼의 왼쪽 발과 오른쪽 발의 왼쪽 발과 오른쪽 발에 가까운 연관로 배치된 평평한 복부 측면에 배치한 후 외과 수술을 사용하여 제자리에 숫자를 부드럽게 고정한 후, μCT 동물 챔버에 마우스를 부드럽게 놓습니다. 테이프. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하십시오.
- 깨끗한 케이지에 마우스를 반환하고 깨어날 때까지 마우스를 모니터링합니다. 매주 에서 매주 시간 포인트까지 동일한 마우스를 계속 스캔하여 전체 뼈 재생 반응을 시각화합니다.
- 스캔 후 μCT 이미지 재구성이 발생할 수 있도록 최대 몇 시간 동안 허용하십시오. μCT와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 파일을 일련의 디콤 파일로 변환합니다. 각 dicom 파일은 스캔의 한 조각에 해당하므로 213 개의 슬라이스를 스캔하면 213 개의 dicom 파일이 생성되어 회사의 서버에 업로드됩니다.
- 웹 브라우저에서 일괄 처리 파일 다운로더를 사용하여 단일 폴더에 dicom 시리즈를 다운로드합니다.
- BoneJ 플러그인23을 다운로드하고 ImageJ 플러그인 폴더로 파일을 드래그합니다. ImageJ에서 폴더를 드래그하여 ImageJ 막대로 삭제하여 디콤 파일 시리즈를 스택으로 엽니다. 모든 회색 값을 표시하는 16비트 이미지 스택이 열립니다. 골격만 표시하려면 이미지 임계값을 수행합니다(Image > adjust > 임계값).
참고: ImageJ 파일을 볼 때 ImageJ 출력은 숫자의 반전된 이미지에 해당합니다. 즉, 스캐닝 플랫폼 복부 측면에 배치된 숫자는 플랫폼의 왼쪽에 왼쪽 발, 플랫폼 의 오른쪽에 오른쪽 발은 등쪽 사이드 업, 왼쪽의 오른쪽 발, ImageJ 이미지 스택의 오른쪽에 있는 왼쪽 발로 나타납니다. - 임계값 대화 상자가 열리면 상위 임계값에 해당하는 아래쪽 막대를 맨 오른쪽으로 밀어 내고 아래쪽 임계값에 해당하는 위쪽 막대를 조정하여 골격만 빨간색으로 강조 표시될 때까지 아래쪽 임계값에 맞춥습니다. 더 낮은 임계값은 최대 신호 강도 32,767에서 약 10,000-13,000입니다. 을적용하고 새 대화 상자에서 검은 색 배경을클릭합니다. 확인을클릭합니다.
- 흑백 값을 표시하는 8비트 이미지가 생성되고 골격에 해당하는 흰색이 생성됩니다. 주위에 사각형을 그려 P3 골격을 선택하고 스택을 복제합니다. 3D 이미지(플러그인 > 3D 뷰어)를생성합니다. 이미지에서 불필요한 골격을 자르려면 자유형 선택 도구를 클릭하고 삭제할 골격에 동그라미를 친다. 오른쪽 단추를 클릭하고 선택 채우기를 선택하여 골격을 삭제합니다.
참고: 위에서 설명한 단계는 ImageJ 1.52h, Java 8에 적용되며 다른 버전의 ImageJ를 사용할 때 약간 다를 수 있습니다. 임계값을 설정하기 위해 최적의 값을 결정하고 해당 값을 일관되게 사용하는 것이 좋습니다. - BoneJ 볼륨 분수 플러그인 (플러그인 > BoneJ > 볼륨 분수)를 사용하여 3D 렌더링에서 골격 볼륨을 정량화합니다. 결과 창이 나타나고 골격 볼륨(BV)이 mm3로 표시됩니다.
- ImageJ 다중 지점 도구를 사용하여 3D 렌더링에서 골격 길이를 정량화합니다.
참고: 뼈 길이는 P3 재생의 과정을 통해 동적; 길이는 파골세포 매개 뼈 분해(11)와 관련된 7-10DPA 사이에서 감소하며, 14-28 DPA(그림3B)사이의 말단 뼈 재성장 기간이 뒤따른다. 길이는 P2/P3 조인트의 중앙 기저부로부터 말단 뼈 정점에서 광물화의 가장 먼 지점까지 측정되지만 완전히 분리된분해된 뼈는 포함되지 않습니다(그림 3B). BoneJ는 뼈 아키텍처의 완전한 3D 평가를 허용합니다. 따라서 뼈를 스캔하는 각도는 길이를 측정하는 기능을 변경하지 않습니다. - 보기를클릭하여 3D 렌더링 이미지를 캡처하고 스냅샷을 생성합니다. 이미지를 tif 또는 jpeg 파일로 저장합니다.
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Representative Results
6/7 DPA(그림 2A-D), 9DPA(그림 2E-H) 및 10DPA(그림2I-L)에서P3 자릿수를 재생성 마우스를 렌x2, OSX 및 PCNA에 대한 항체로 면역으로 염색하여 인화골을 시각화하였다. 재생, 및 VWF에 대한 항체로 면역을 염색하여 blastema 형성을 시각화합니다. 절단 전 및 재생 과정에 걸쳐 다양한 시점에서 스캔된 자릿수의 대표적인 μCT 렌더링(그림3A,B) 및 길이 측정을 식별하는 데 사용되는 랜드마크식별(그림3B)은 또한 도시됩니다.
그림 1: 숫자 및 성인 마우스 말단 P3 절단 평면의 식별. 성인용 마우스 오른쪽 뒷발은 숫자 1-5로 표시됩니다. 이 연구에서 수행 된 절단은 숫자 2 및4 (A)에서 수행됩니다. 말단 P3 절단 평면은 숫자 2와 4 (B)에 (파선)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 재생성 성체 마우스 P3 자리에서 초기 의 골화 및 블라스터마 형성. Runx2 (녹색) 및 PCNA (마젠타) 이중 면역 형광은 증식하는 골전광자가 처음에 6/7 DPA에서 골후생 및 내도 스텔스 뼈 표면에 국한되고, 9 및 10 DPA(A, E,I)에서 원위 블래스트 마제로 확장된다는 것을 보여준다. OSX(녹색) 및 PCNA(마젠타) 이중 면역형광은 6/7(B)에서 OSX 양성 조골세포 및 광범위한 증식을 나타내고, 강화된 OSX 면역염색은 9 및 10 DPA(F, J)에서 증식세포에 의해 경계가 강화되었다. CXCR4 (적색) 면역 형광은 6/7 DPA (C)에서 초기 배증마 형성을 식별하고 9 및 10 DPA 재생 숫자 (G,K)에서강력한 CXCR4 면역 염색을 수행합니다. vWF (녹색) 면역 염색은 절단 된 숫자의 골수에서 손상되지 않은 혈관을 식별하고, 혈관 블라스트 마증과 관련된 몇 가지 긍정적 인 세포(D, H,L). DAPI로 얼룩진 샘플. 등쪽은 상단에, 말단은 오른쪽에 있습니다. Bl = 블라스터마, m = 골수. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 순차적으로 생체 내 μCT 스캐닝에 의해 시각화된 P3 골 재생. 절단(unamp) 전에 스캔한 한 자리의 대표적인 μCT 렌더링, 및 1, 7, 10, 14, 21 및 28 DPA에서. μCT 스캐닝은 P3 재생이 초기 뼈 조직 해 반응을 특징으로 하며, 그 다음에 14 DPA에서 뼈 섬 형성과21 및 28 DPA (A)에서 강력한 뼈 재생이 특징입니다. 절단 전과 1, 7, 10, 14, 21 및 28 DPA에서 스캔한 한 자리의 대표적인 μCT 렌더링은 각 시점에서 숫자 길이가 측정되는 영역을 나타남을 나타남을 의미합니다. (B) 녹색 점은 측정된 총 길이를 나타내고 빨간색 X는 길이 측정에서 제외된 추방된 골격 영역을 나타냅니다. ImageJ에서 만든 개별 숫자 이미지를 잘라서 숫자 크기를 표준화하여 이 그림에서 볼 수 있는 이미지를 만들 수 있습니다. 말단은 오른쪽에, 등쪽은 상단에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 성인 마우스 말단 P3 절단, 형광 면역 조직 화학 염색의 표준화 된 절차를 설명하여 블라스트마 형성 및 비변형 골화를 시각화하고 조사하고, 순차적으로 생체 내 μCT 스캐닝을 절단 후 골형태, 부피 및 길이 변경을 식별합니다. P3 절단은 blastema 대형을 유발하는 재생 성 상처 환경을 분석하는 독특하고 절차적으로 간단하고 재현 가능한 모델입니다. 또한, P3 자리 모델은 기존의 뼈 부상 모델에 비해 많은 장점을 제공하여 intramembranous 골화를 조사합니다.
이 프로토콜의 성공을 보장하려면 완전한 숫자 디칼화를 수행해야 합니다. 숫자가 완전히 탈석되지 않은 경우, 단면화 과정에서 무너지고 파쇄됩니다. 추가적으로, 열 회수 면역 조직 화학은 조직이 약간 분리되거나 슬라이드에서 완전히 빠질 수 있다는 점에서 문제가 될 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해, 샘플은 조직 접착제로 보충 된 물 욕조를 사용하여 접착제 슬라이드에 장착해야뿐만 아니라 사용하기 전에 65 °C로 건조 슬라이드를 베이킹한다. 마지막으로 마우스 숫자는 상대적으로 작습니다. 따라서 형태학을 정확하게 시각화하고 뼈 볼륨및 길이의 변화를 정량화하려면 μCT가 적절한 스캐닝 매개 변수에서 작동하기에 충분한 해상도여야 합니다.
이 방법의 한 가지 제한은 모든 1 차 항체가 조직 고정 및 파라핀 처리와 호환되는 것은 아니라는 것입니다. 이 경우, 표준 냉동 조직 냉동 절편은 1차 항체 항원(11)의 무결성을 보장하기 위해 수행될 수 있다. 냉동 절제는 또한 decalcification 단계에 대한 필요성을 제거하지만, 우리는 자리의 저온 절편이 파라핀 절편보다 기술적으로 더 어렵다는 것을 발견했습니다.
전체 블라스트마는 데톤볼루션 현미경으로 10배 배율로 시각화할 수 있으며, 적절한 이미지 정량화 소프트웨어를 사용하여 면역 염색 결과를 쉽게 정량화할 수 있습니다. 재생 수의 골성 마커에 대한 형광 면역성 화학 프로빙은 intramembranous 골화를 통한 배반 분화의 독특한 뷰를 제공한다. 면역조직화학적 염색은 P3 골재생 반응이 편광되고 조직화된 근위-원위골 형성을 초래한다는 것을 보여준다(도 2). 나중에 재생 단계에서, 블라스트마에서 파생 된 비 증식 성 조세포는 뼈 그루터기에 인접한 지역화되고 증식 조세포에 의해 불골로 경계됩니다. 증식하는 조골 세포는 차례로 미분화 된 배반 세포를 증식시킴으로써 불순물경계가 됩니다. Blastema 마커 CXCR4에 대한 형광 면역 성 화학 프로빙은 손상된 뼈 표면과 관련된 초기 블라스타마 세포를 식별하고이후 재생 단계에서 향상된 면역 염색을 식별합니다 (그림 2). 블라스트마는 내피 세포 마커 vWF에 대한 혈관(13) 및 면역형광이 블라스마 영역 내의 몇 가지 양성 세포를 식별한다(도 2).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
무네오카 연구소와 텍사스 유전체 의학 연구소(TIGM)의 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A & M 대학에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
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