Summary
Qui, presentiamo un protocollo di amputazione della falange terminale dei topi adulti per studiare la formazione di blastema mammifero e l'ossificazione intramembranosa, analizzata dall'immunohistochimica fluorescente e dalla tomografia microcalcolata in vivo sequenziale.
Abstract
Qui, presentiamo un protocollo di amputazione terminale distale distale adulto (P3), un modello di mammifero procedurale semplice e riproducibile di rigenerazione epimorfica, che coinvolge la formazione di blastema e l'ossificazione intramembrana analizzata da immunohistochimica a fluorescenza e tomografia microcalcolata in vivo sequenziale (CT). La rigenerazione dei mammiferi è limitata alle amputazioni che trasmettono la regione distale della falange terminale (P3); le cifre amputate a livelli più prossimali non riescono a rigenerare e a subire la guarigione fibrotica e la formazione di cicatrici. La risposta di rigenerazione è mediata dalla formazione di un blastema proliferante, seguita dalla rigenerazione ossea tramite ossificazione intramembranosa per ripristinare la lunghezza scheletrica amputata. L'amputazione P3 è un modello preclinico per studiare la rigenerazione epimorfica nei mammiferi ed è un potente strumento per la progettazione di strategie terapeutiche per sostituire la guarigione fibrotica con una risposta rigenerativa di successo. Il nostro protocollo utilizza l'immunohistochimica a fluorescenza a 1) identificare le popolazioni di cellule di blastema precoce e tardiva, 2) studiare la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione, e 3) studiare l'ossificazione intramembranosa senza la necessità di ossa complesse dispositivi di stabilizzazione. Dimostriamo anche l'uso di immagini sequenziali in vivo per creare immagini ad alta risoluzione per esaminare i cambiamenti morfologici dopo l'amputazione, nonché quantificare i cambiamenti di volume e lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. Crediamo che questo protocollo offra un'enorme utilità per studiare le risposte epimorfiche e rigenerative dei tessuti nei mammiferi.
Introduction
I mammiferi, compresi gli esseri umani e i topi, hanno la capacità di rigenerare le punte delle loro cifre dopo l'amputazione distale della falange terminale (P3)1,2,3. Nei topi, la risposta di rigenerazione è dipendente dal livello di amputazione; amputazioni a cifre sempre più prossimal mostrano una risposta rigenerativa progressivamente attenuata fino al completo fallimento rigenerativo alle amputazioni che trasmettono e proximal alla matrice di unghie P34,5,6 , 7 (in questo stato , 8. La rigenerazione P3 è mediata dalla formazione di un blastema, definito come una popolazione di cellule proliferanti che subiscono la morfogenesi per rigenerare le strutture amputate9. La formazione di un blastema per rigenerare le strutture perse dall'amputazione, un processo chiamato rigenerazione epimorfica, distingue la risposta di rigenerazione P3 multi-livello tissutale dalla riparazione tradizionale dei tessuti dopo la lesione6, 10.La rigenerazione P3 è un modello riproducibile e procedurale semplice per studiare complessi processi rigenerativi tra cui la guarigione delle ferite11,12, istolisi ossea11,12, vascellizzazione13, rigenerazione del nervo periferico14, e conversione blastemica in osso tramite ossificazione intramembranosa15.
Studi precedenti che utilizzano l'immunosintochimica hanno dimostrato che il blastema è eterogeneo, avascolare, ipossico e altamente proliferante11,13,15,16. A seguito dell'amputazione dissatsale del P3, il blastema primitivo è inizialmente associato al periosteo P3 e all'endosteo ed è caratterizzato da una robusta proliferazione e osteogenesi nascente adiacente alla superficie ossea15. Dopo la degradazione ossea e la chiusura della ferita, il blastema eterogeneo è formato dalla fusione di cellule associate al periosteal ed endosteal, seguito dalla differenziazione dei componenti blastemale, tra cui l'osso attraverso l'ossificazione intramembrana 15.
La riparazione ossea in risposta a lesioni avviene tipicamente per ossificazione endocondrale, cioè tramite un callo cartilagineo iniziale che forma un modello per la successiva formazione ossea17,18. L'ossificazione intramembranosa dell'osso lungo, cioè la formazione ossea senza un intermedio cartilagineo, è comunemente indotta utilizzando complessi dispositivi di distrazione o fissazione chirurgica19,20. La risposta alla rigenerazione numerica è un modello preclinico che offre vantaggi rispetto ai modelli convenzionali di osssificazione intramembranous: 1) non richiede lesioni post post di fissaggio esterne o interne per stimolare l'ossificazione intramembrana, 2) è l'analisi sequenziale in vivo della tomografia microcalcolata (CT) può essere eseguita con facilità e velocità utilizzando 4 cifre, massimizzando così i campioni riducendo al minimo l'uso di animali e l'analisi sequenziale della tomografia microcalcolata in vivo (CT) può essere eseguita con facilità e velocità.
Nel presente studio, mostriamo il piano standardizzato di amputazione P3 per ottenere una risposta di rigenerazione riproducibile e robusta. Inoltre, dimostriamo un protocollo di immunohistochimica a fluorescenza ottimizzato utilizzando sezioni di paraffina per visualizzare la formazione di blastema, la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione e la conversione blastemica in osso tramite intramembranous Ossificazione. Dimostriamo anche l'uso di una tasie-invivo sequenziale per identificare i cambiamenti nella morfologia ossea, nel volume e nella lunghezza nella stessa cifra nel corso della rigenerazione. L'obiettivo di questo protocollo è quello di studiare la formazione di blastema mammifero dopo l'amputazione e di dimostrare 2 tecniche, immunohistochimica a fluorescenza e in vivo in vivo sequenziale, per lo studio della rigenerazione ossea intramembrana.
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Protocol
Tutti gli animali e le tecniche erano conformi alle procedure operative standard dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Texas A&M University.
1. Amputazione P3 dell'artino posteriore del topo adulto
- Anestesizzare un topo CD-1 da 8 a12 settimane utilizzando il gas isoflurano in ossigeno; inizialmente anestesizzare al 3% in una camera, seguita dal 2% isoflurane fornito da un nosecone per tutta la durata dell'intervento. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
NOT: Gli studi di amputazione P3 per adulti standardizzati nel nostro laboratorio vengono eseguiti su topi da 8 a 12 settimane e la risposta alla rigenerazione viene conservata in tutti i ceppi testati. - Sotto un microscopio di dissezione 10x, sterilizzare le cifre dell'arto posteriore con Povidone-iodio chirurgico e 70% di etanolo. Tagliare i capelli dal sito chirurgico utilizzando micro forbici. Applicare 1 -L di Bupivacaina topica localmente per anetizzare il sito chirurgico.
- Amputare la punta distale della falange terminale (P3) sulle cifre 2 e 4 di ogni arto posteriore utilizzando un bisturi #10 sterile (Figura 1A). L'amputazione deve essere eseguita in condizioni assettiche, compresa la sterilizzazione degli strumenti chirurgici. Sotto il microscopio di dissezione, splay delicatamente la zampa posteriore per esporre la superficie della cifra mediale. Tenere il bisturi ad un angolo parallelo al fatpad per eseguire l'amputazione mostrata figura 1B. Applicare 1 -L di Bupivacaina topica al sito di amputazione.
NOT: L'amputazione transetta l'organo ungueale, il derma, l'osso P3, la vascolanza e i nervi, ma non transect la cavità del midollo o il cuscinetto di grasso cifra. Se si osserva il sanguinamento, applicare una pressione diretta utilizzando un applicatore sterile a punta di cotone. - Il piano standard di amputazione disal P3 rimuove circa il 15%-20% del volume osseo P321. La scansione MicroCT (vedi sotto) può essere eseguita per confermare la corretta durata dell'amputazione.
- Riportare il mouse in una gabbia pulita e lasciare che la ferita guarisca senza vestirsi della ferita. Monitorare il mouse per 3 giorni per assicurarsi che il mouse ritorni alla normale attività.
2. Raccolta di cifre e preparazione dei tessuti
- Eutanasia del topo usandoanidride carbonica (CO 2) in una camera chiusa, seguita da lussazione cervicale.
- Utilizzare un bisturi per recidere la cifra a metà strada attraverso il segmento osseo adiacente, l'osso falange centrale (P2), a circa il secondo rientro grasso ventrale. Trasferire le cifre in una fiala scintillale da 20 mL contenente 10 mL di una formalizzazione formalina di zinco fresco da 10 mL, una soluzione di formaldeide al 18% (vedere Tabella dei materiali). Il volume fissativo deve essere almeno 20 volte il volume del tessuto presente.
NOT: Le cifre vengono raccolte in vari momenti dopo l'amputazione per analizzare la risposta completa alla rigenerazione. Generalmente, per la formazione di blastema precoce, l'istalisi ossea, e la chiusura delle ferite i tempi di raccolta sono 4-8 giorni dopo l'amputazione (DPA). Per studiare il primo blastema osteogenico i tempi di raccolta sono 9 e 10 DPA, e per visualizzare la rigenerazione e la mineralizzazione ossea continua, i tempi di raccolta sono 14, 21 e 28 DPA. Vengono raccolte anche le cifre non messe in esputate. - Fissare la cifra per 24-48 h a temperatura ambiente con miscelazione delicata su uno shaker.
- Rimuovere il fissativo e lavare la cifra 2x per 5 min in 5 mL di 1x fosfato buffered salina (PBS) a temperatura ambiente.
- Mettere 10 mL di Decalcifier I fresco (vedi Tabella deiMateriali), una soluzione di acido formico al 10%, nella fiala scintillante e mescolare delicatamente su uno shaker per 2 h a temperatura ambiente. Dopo 2 h, sostituire Decalcifier I con soluzione fresca e decalcificare la cifra durante la notte a temperatura ambiente con una leggera miscelazione sullo shaker.
- Rimuovere il Decalcifier I e lavare la cifra 2x per 5 min in 5 mL di 1x PBS a temperatura ambiente.
-
Elaborare la cifra attraverso una serie di etanolo graduata. Questo processo può essere eseguito manualmente in una fiala scintillante da 20 mL, utilizzando 10 mL di ogni liquido se meno di 40 cifre totali.
- Iniziare con 2 immersioni in fresco 70% etanolo a temperatura ambiente con miscelazione delicata su uno shaker, 1 h ciascuno, seguita da 2 immersioni in fresco 95% etanolo a temperatura ambiente con miscelazione delicata su uno shaker, 1 h ciascuno.
- Completare la disidratazione delle cifre con 2 lavamenti freschi 100% di etanolo a temperatura ambiente con una leggera miscelazione su uno shaker, 1 h ciascuno. L'ultimo lavaggio all'etanolo al 100% può essere lasciato durante la notte.
- Nella stessa fiala scintillante, sostituire l'etanolo al 100% con 10 mL di xileni freschi e posizionare la fiala in una cappa di fumi chimici per 1,5 h a temperatura ambiente. Ripetere con un lavaggio fresco di xileni in una cappa di fumi chimici per 1,5 h a temperatura ambiente per un totale di 2 lavaggi.
- Sostituire gli xylenes con cera di paraffina liquida fusa a 68 gradi centigradi, e posizionare la fiala in un'incubatrice a 68 gradi centigradi per 2 h, 2 volte. Dopo 4 h totale di immersione in cera di paraffina, incorporare la cifra per la sezionamento paraffina.
NOT: L'elaborazione delle cifre per l'istologia può essere eseguita in un processore automatizzato, seguendo queste stesse linee guida. - Cifre di sezione con spessore di 4-5 m utilizzando un microtoma. Posizionare campioni sezionati su vetrini adesivi, utilizzando un bagno d'acqua di 38-41 gradi con contratto con una soluzione adesiva istologica per garantire che i campioni aderiscano al vetrino. Posizionare i vetrini su uno scaldascivoli a 37 gradi centigradi per asciugare.
3. Colorazione immunostochimica delle cifre dei topi adulti per indagare sulla formazione del Blastema e sull'ossificazione intramembranosa
- Riscaldare i vetrini sezionati a 65 gradi centigradi per 45 min, seguiti dal riscaldamento a 37 gradi centigradi per non meno di 15 minuti per garantire che i campioni aderiscano al vetrino.
- Deparaffinare e reidratare gli scivoli 2x con 5 min di xileni, una serie di etanolo graduato e l'inmersione nell'acqua. Mettete i vetrini in un barattolo di colorazione della capacità da 50 a 100 mL e tenetevi immersi in 1x Tris Buffered Saline con Tween 20 (TBST).
NOT: Non lasciare asciugare i campioni durante tutto il processo di colorazione. In qualsiasi fase TBST, i vetrini possono essere incubati fino a 2 h. - Preparate una camera umida. È sufficiente una scatola di diapositive in plastica coperta profonda 1 pollice con carta velina inumidita alla base.
- Preparare la soluzione di recupero del calore per Runx2, Osterix (OSX) e Antigen nucleare a cellule proliferanti (PCNA). Per il recupero dell'antigene del marcatore osteoprogenitor precoce, Runx2, preparare una soluzione 1x di Tris-EDTA, pH 8. Per il marcatore osteoblasto, OSX, preparare una soluzione 1x di tampone di citrate, pH 6. L'immunostaining PCNA può essere eseguita in entrambe le soluzioni.
- Preparare la soluzione di recupero dell'antigene Proteinase K per il marcatore blastema CXCR422 e il marcatore di cellule endoteliali von Willebrand Factor 8 (vWF) mettendo 100 L di soluzione Proteinase K per diapositiva in un tubo di microcentrismo e riscaldamento a 37 5 min).
NOT: Il recupero dell'antigene per Runx2, OSX e PCNA viene eseguito utilizzando il recupero del calore e il recupero dell'antigene CXCR4 e vWF viene eseguito tramite il trattamento della proteina K. - Per il recupero degli anticorpi che richiedono calore, immergere i vetrini in un barattolo di colorazione nella soluzione di recupero dell'antigene appropriata. Riscaldare i vetrini a 95 gradi centigradi per 25 minuti, assicurando che l'ebollizione non si verifichi. Rimuovere il barattolo di colorazione dalla fonte di calore e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 35 min.
- Per il recupero dell'antigene Proteinase K, posa i vetrini nella camera umidificante e metti 100 l di Proteinase K preriscaldate sul vetrino. Coprire i vetrini con una piccola striscia di parafilm per assicurarsi che i vetrini non diventino asciutti. Incubare scivoli per 12 min a 37 .
- Lavare le diapositive 3 volte per 5 min in 1x TBST in barattolo di colorazione dopo il recupero dell'antigene.
- Rimuovere i vetrini dal barattolo di colorazione e metterli in camera umidificante. Posizionare 6-7 gocce di soluzione di blocco (Tabella dei materiali) sul vetrino e coprire il vetrino con pellicola di paraffina fresca per assicurarsi che la diapositiva non diventi asciutta. Incubare scivoli per 1 h a temperatura ambiente.
- Preparare gli anticorpi primari diluindo gli anticorpi in diluenti anticorpi (Tabella dei materiali). Vortice ogni soluzione anticorpale primaria per 3 s. Gli anticorpi primari derivati da diverse specie ospiti possono essere combinati.
NOT: Colorazione immunocontochimica per Runx2 (anticorpo coniglio anti-Runx2, diluizione 1:250, ad una concentrazione finale di 4 g/mL) combinata con PCNA (anticorpo anti-PCNA del topo monoclonale, 1:2.000 diluizione, ad una concentrazione finale di 0,5 g/mL) e OSX (anti-coniglio-OSX) anticorpo, diluizione 1:400, ad una concentrazione finale di 0,125 g/mL) combinato con PCNA è mostrato nella Figura 2. L'anticorpo anti-PCNA del topo utilizzato in questo studio è altamente specifico e non richiede ulteriori passaggi di blocco oltre a quelli delineati in questo protocollo. La colorazione immunoistochimica con colorazione immunoconica mediante CXCR4 (anticorpo ratto anti-CXCR4, diluizione 1:500 ad una concentrazione finale di 2 g/mL) e vWF (anticorpo del coniglio contro l'uomo vWF VIII, 1:800 di lui, con una concentrazione finale di 41,25 g/mL) è illustrata nella Figura 2. Gli anticorpi primari sono stati ottimizzati e testati dal nostro laboratorio nelle condizioni di questo protocollo e sono elencati nella Tabella dei Materiali. - Rimuovere con attenzione la pellicola di paraffina e svuotare delicatamente il vetrino sulla carta velina per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso. Posizionare 100-200 l di soluzione anticorpale primaria sullo scivolo, sostituire la copertura parafilm e tornare alla camera umidizzante. Incubare i vetrini nella camera umidificante chiusa durante la notte a 4 gradi centigradi.
NOT: Non lasciare che i vetrini si asciughino mentre prosciugano la soluzione di blocco. Questo passaggio viene eseguito rapidamente. - Rimuovere con attenzione il parafilm e svuotare delicatamente la soluzione anticorpale primaria dal vetrino. Collocare il vetrino in un barattolo di colorazione contenente 1X TBST fresco. Lavare con 1x TBST fresco per 5 min 3 volte.
- Preparare gli anticorpi secondari combinandosi con il diluente anticorpo (Tabella dei materiali). Vortice la soluzione anticorpale secondaria per 3 s. Possono essere combinati con fluorofori diversi derivati da specie diverse.
NOT: Gli anticorpi secondari fluorescenti sono sensibili alla luce. Alexa Fluor 488-coniugato capra anti-coniglio IgG (H-L) per Runx2, OSX, e vWF, Alexa Fluor 568-coniugata capra anti-ratto IgG (H-L) per CXCR4, e Alexa Fluor 647-coniugato capra anti-topo IgG (H-L) per PCNA, diluito a 1:500 con una concentrazione finale di 4 , sono stati utilizzati nella Figura 2. - Posizionare 200 l di soluzione anticorpale secondaria sul vetrino, coprire il vetrino con pellicola di paraffina fresca e tornare alla camera di umidificazione. Incubare i vetrini nella camera umidante chiusa per 45 min a temperatura ambiente. Assicurarsi che la camera di umidificazione sia chiusa per evitare la luce.
- Rimuovere con attenzione la pellicola di paraffina e svuotare delicatamente la soluzione anticorpale secondaria dal vetrino. Collocare il vetrino in un barattolo di colorazione contenente 1x TBST fresco. Lavare con 1x TBST fresco per 5 min 3x. Evitare la luce.
- Preparare la macchia nucleare. Aggiungere 20 l di DAPI (la soluzione DAPI di stock è 5 mg/mL in H2O) a 200 mL di 1x PBS e agitare vigorosamente per garantire l'omogeneità. Immergere le diapositive per 5 min nella soluzione DAPI-PBS. Evitare la luce.
- Lavare i vetrini in dH2O per 3 min. Decant l'acqua e lasciare che i vetrini asciughino all'aria o aspirare delicatamente l'acqua dal vetrino, assicurando che i campioni non siano disturbati durante l'aspirapolvere. Evitare la luce.
- Vetrine asciutte con attenzione utilizzando 100 l di supporto di montaggio anti-dissolvenza (Tabella dei materiali); evitare la formazione di bolle d'aria sullo scivolo durante la fase di montaggio. Conservare i vetrini piatti e lasciare asciugare il supporto di montaggio durante la notte a temperatura ambiente in un contenitore a prova di luce. Dopo che il supporto di montaggio è asciutto, conservare i vetrini piatti in un contenitore a prova di luce in 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la visualizzazione.
NOT: Se dopo il montaggio sono presenti livelli inaccettabili di bolle d'aria, lo scivolo montato può essere posizionato delicatamente in 1x PBS, il coperchio può essere rimosso e, una volta che lo scivolo viene risciacquato nuovamente in acqua e ri-essiccato, può essere rimontato.
4. Microscopia e analisi delle immagini
NOT: Imaging e analisi utilizzando un microscopio di deconvoluzione a fluorescenza e software associato, dotato di 3 filtri fluorescenti (per visualizzare Alexa Fluor 488, 568 e 647 nm segnali), più DAPI (419 nm) viene utilizzato in questo esperimento.
- Immagine della diapositiva all'ingrandimento di 10 volte per catturare l'intera regione blastema.
NOT: Il rilevamento di anticorpi primari osteoblasti che proliferano utilizza anticorpi secondari (Alexa Fluor 488 e 647) con spettri di emissione non sovrapposti per ridurre al minimo l'identificazione errata delle cellule co-etichettate. La sottrazione in background del segnale autofluorescente può essere eseguita utilizzando il filtro da 568 nm per garantire l'integrità dei segnali 488 o 647. Blastema rilevamento anticorpi primari utilizza anticorpi secondari (Alexa Fluor 488 o 568). La sottrazione in background del segnale autofluorescente può essere eseguita con il filtro 568 se si utilizza l'anticorpo coniugato 488 e il filtro 488 utilizza l'anticorpo 568 coniugato. Il segnale autofluorescente è tipicamente associato alla lamina ungueale e agli eritrociti in tutta la cifra, ed è osservato nei filtri 488, 568 e 647.
5. Tomografia microcalcolata in vivo sequenziale (CT)
- Le cifre rigeneranti dello stesso animale scansionate a 1 giorno prima dell'amputazione (senza preavviso), 1 DPA e in vari momenti fino alla completa rigenerazione a 28 DPA utilizzando il vivaCT 40 (Tabella dei materiali) viene eseguita in questo esperimento e mostrata in Figura 3A.
- Vestire il CT con tubi per consentire il flusso di ossigeno dentro e fuori la camera degli animali CT, assicurando che l'ossigeno che scorre in uscita sia dotato di un filtro a carbone attivato per intrappolare l'isoflurane.
NOT: Assicurarsi che la camera per animali CT sia strettamente chiusa; in questo modo, un animale naso-cono non è necessario per la fornitura di isoflurane al topo durante la scansione. - Preparare i parametri di scansione CT. Le cifre vengono scansionate a una dimensione voxel di 10,5 m, a 55 kVp, 145 uA con 1000 proiezioni per 180 utilizzando la rotazione continua e con un tempo di integrazione di 200 msec, con un massimo di 213 fette per scansione. Le scansioni eseguite in questo esperimento sono lunghe circa 9 min. Una corrente elettrica ridotta può essere compensata con tempi di integrazione proporzionalmente aumentati, ma si tradurrà in tempi di scansione più lunghi.
- Anestesizzare il topo adulto utilizzando isoflurane; inizialmente anestesizzare al 3% in una camera, seguita dall'1,5% dell'isofurane fornito alla camera degli animali CT per tutta la durata della scansione. Posizionare delicatamente il topo nella camera degli animali con le cifre dell'arto posteriore disposte in stretta associazione, piatte, ventrali laterali con zampa sinistra sul lato sinistro e zampa destra sul lato destro sulla piattaforma di scansione, seguito da fissare delicatamente le cifre in posizione con la torconferenza chirurgica registrare. Applicare unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Riportare il mouse in una gabbia pulita e monitorare il mouse fino a quando non si sveglia. Continuare a eseguire la scansione dello stesso mouse in punti temporali bisettimanali a settimanali per visualizzare l'intera risposta di rigenerazione ossea.
- Dopo la scansione, attendere la ricostruzione dell'immagine CT. Utilizzando il software fornito con il CT, convertire i file in una serie di file dicom; ogni file dicom corrisponderà a una fetta della scansione, quindi, se sono state scansionate 213 fette, 213 file dicom verranno generati e caricati sul server aziendale.
- Scaricare la serie dicom in una singola cartella utilizzando un downloader di file batch in un browser Web.
- Scaricare il plugin BoneJ23 e trascinare il file nella cartella del plugin ImageJ. In ImageJ, aprire la serie di file dicom come pila trascinando e rilasciando la cartella nella barra ImmagineJ. Verrà aperto uno stack di immagini a 16 bit che mostra tutti i valori di grigio. Per visualizzare solo l'osso,eseguire la soglia dell'immagine (Mago > Regola > Soglia).
NOT: Quando si visualizzano i file ImageJ, l'output DiJ corrisponderà a un'immagine invertita delle cifre; cioè, le cifre disposte nella piattaforma di scansione lato ventrale, con la zampa sinistra sul lato sinistro della piattaforma e la zampa destra sul lato destro della piattaforma, appariranno come lato dorsale verso l'alto, zampa destra sul lato sinistro e zampa sinistra sul lato destro della pila di immagini ImageJ. - Una volta aperta la finestra di dialogo della soglia, far scorrere la barra inferiore, corrispondente alla soglia superiore, verso l'estrema destra e regolare la barra superiore, corrispondente alla soglia inferiore, fino a quando solo l'osso non viene evidenziato in rosso. Il valore di soglia inferiore sarà di circa 10.000–13.000 ad un'intensità massima del segnale di 32.767. Fare clic su Applicae nella nuova finestra di dialogo fare clic su Sfondo nero. Fare clic su OK.
- Verrà generata un'immagine a 8 bit con valori in bianco e nero, con il bianco corrispondente all'osso. Selezionare l'osso P3 disegnando un rettangolo intorno ad esso e duplicare la pila. Generare un'immagine 3D (Plugin > Visualizzatore 3D). Per ritagliare dall'immagine qualsiasi osso non necessario, fate clic sullo strumento di selezione a mano libera e cerchiate l'osso da eliminare. Fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Riempi selezione per eliminare l'osso.
NOT: I passaggi descritti in precedenza si applicano a ImageJ 1.52h, Java 8 e possono differire leggermente quando si utilizza una versione diversa di ImageJ. Per la soglia, si consiglia la determinazione di un valore ottimale e l'utilizzo coerente di tale valore. - Quantifica il volume osseo dal rendering 3D utilizzando il plug-in BoneJ Volume Fraction (Plugin > BoneJ > Volume Fraction). Apparirà una finestra dei risultati e il volume osseo (BV) verrà visualizzato in mm3.
- Quantifica la lunghezza dell'osso dal rendering 3D utilizzando lo strumento multipunto ImageJ.
NOT: La lunghezza dell'osso è dinamica nel corso della rigenerazione P3; la lunghezza diminuisce tra 7-10 DPA associati alla degradazioneossea mediata da osteoclast1 ed è seguita da un periodo di ricrescita ossea distale tra 14-28 DPA (Figura3B). La lunghezza è misurata dalla base centrale dell'articolazione P2/P3 al punto più lontano della mineralizzazione nell'apice osseo distale, ma non include l'osso degradato che è stato completamente staccato (Figura 3B). BoneJ consente la valutazione 3D completa dell'architettura ossea; pertanto, l'angolo in cui l'osso viene scansionato non altererà la capacità di misurare la lunghezza. - Acquisire un'immagine del rendering 3D facendo clic su Visualizzae scattare un'istantanea. Salvare l'immagine come file tif o jpeg.
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Representative Results
I topo adulti che rigenerano le cifre P3 a 6/7 DPA (Figura 2A-D),9 DPA (Figura 2E-H)e 10 DPA (Figura 2I-L) sono stati immunostainse con anticorpi a Runx2, OSX e PCNA per visualizzare l'osso intramembranoso rigenerazione e immunostaincato con anticorpi a CXCR4 e vWF per visualizzare la formazione di blastema. I rendering di cFR rappresentativi delle cifre scansionate prima dell'amputazione e in vari momenti nel corso della rigenerazione (Figura 3A, B) e l'identificazione dei punti di riferimento utilizzati per identificare le misurazioni della lunghezza ( Figura3B) sono anche mostrato.
Figura 1: numero di cifre e identificazione del piano di amputazione P3 composto da topo adulto. La zampa posteriore del topo adulto viene visualizzata con cifre numerate da 1 a 5; le amputazioni effettuate in questo studio vengono eseguite con le cifre 2 e 4 (A). Il piano di amputazione P3 dislocato viene visualizzato (linea tratteggiata) sulle cifre 2 e 4 (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ossificazione intramembranous precoce e formazione di blastema nella cifra P3 del topo adulto rigenerante. L'immunoororescenza doppia Runx2 (verde) e PCNA (magenta) mostrano che gli osteoprogenitori proliferanti sono inizialmente localizzati alle superfici ossee del periosteal e dell'endosteal a 6/7 DPA, ed espandono al blastema distale a 9 e 10 DPA (A, E, I). OSX (verde) e PCNA (magenta) doppia immunofluorescenza mostrano pochi osteoblasti positivi OSX e un'ampia proliferazione a 6/7 (B), e una distacciata immunostainsa OSX potenziata delimitata da cellule proliferanti a 9 e 10 DPA (F, J). L'immunofluorescenza CXCR4 (rossa) identifica la formazione precoce di blastema a 6/7 DPA (C), seguita da robusta immunostaining CXCR4 nelle cifre rigeneranti di 9 e 10 DPA (G, K). L'immunostaining vWF (verde) identifica la vascolatura intatta nel midollo di cifre amputate e poche cellule positive associate al blastema avascolare (D, H, L). Campioni contrappostati con DAPI. Dorsale è in cima, disl è a destra. Bl : blastema, m - midollo. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rigenerazione ossea P3 visualizzata mediante scansione sequenziale in vivo CT. Rappresentativi dei rendering CT di una cifra scansionati prima dell'amputazione (non ampliabile) e di 1, 7, 10, 14, 21 e 28 DPA. La scansione a CT dimostra che la rigenerazione di P3 è caratterizzata da una risposta iniziale all'istolisi ossea, seguita dalla formazione di un'isola ossea a 14 DPA e da una robusta rigenerazione ossea a 21 e 28 DPA (A). Rappresentazione rappresentativa del d-CT di una cifra scansionata prima dell'amputazione e a 1, 7, 10, 14, 21 e 28 DPA che illustrano le regioni in cui la lunghezza delle cifre viene misurata in ogni momento. (B) I punti verdi indicano la lunghezza totale misurata, mentre la X rossa indica la regione dell'osso espulso esclusa dalla misurazione della lunghezza. Le singole immagini a cifra create da ImageJ possono essere ritagliate per standardizzare le dimensioni delle cifre per consentire la creazione di immagini viste in questa figura. Disl è a destra, dorsale è in cima. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive una procedura standardizzata di amputazione P3 del topo adulto, colorazione immunohistochimica fluorescente per visualizzare e analizzare la formazione di blastema e l'ossificazione intramembranosa, e la scansione sequenziale in-vivo identificare i cambiamenti morfologici ossei, di volume e di lunghezza dopo l'amputazione. L'amputazione P3 è un modello unico, proceduralmente semplice e riproducibile per analizzare un ambiente di ferite pro-rigenerativo che innesca la formazione di blastema. Inoltre, il modello a cifra P3 offre numerosi vantaggi rispetto ai modelli tradizionali di lesioni ossee per studiare l'ossificazione intramembrana.
Per garantire la riuscita di questo protocollo, è necessario eseguire la decalcificazione completa delle cifre. Nel caso in cui la cifra non sia completamente decalcificata, si sbriciolerà e si sbriciolerà durante il processo di sezionamento. Inoltre, l'immunosofia di recupero del calore può essere problematica in quanto i tessuti possono staccarsi leggermente o diventare completamente slogati dal vetrino. Per alleviare questo problema, i campioni dovrebbero essere montati su vetrini adesivi utilizzando un bagno d'acqua integrato con un agente adesivo istologico, oltre a cuocere i vetrini secchi a 65 gradi centigradi prima dell'uso. Infine, le cifre del mouse sono relativamente piccole; pertanto, al fine di visualizzare con precisione la morfologia e quantificare le variazioni del volume e della lunghezza dell'osso, la CT deve essere di soluzione sufficiente per funzionare ai parametri di scansione appropriati.
Una limitazione di questo metodo è che non tutti gli anticorpi primari sono compatibili con la fissazione dei tessuti e l'elaborazione della paraffina. In questo caso, è possibile eseguire la criosezione standard del tessuto congelato per garantire l'integrità dell'anticorpo primario11. La criosezione elimina anche la necessità della fase di decalcificazione, tuttavia abbiamo scoperto che la criosezione delle cifre è tecnicamente più impegnativa del sezionamento paraffina.
L'intero blastema può essere visualizzato all'ingrandimento di 10 volte mediante microscopia di deconvoluzione e, utilizzando il software di quantificazione dell'immagine appropriato, i risultati dell'immunostaining possono essere facilmente quantificati. La sonda fluorescente immunohistochimica per i marcatori osteogenici della cifra rigenerante fornisce una visione unica della differenziazione blastemica attraverso l'ossificazione intramembrana. La colorazione immunoistochimica rivela che la risposta di rigenerazione ossea P3 è polarizzata e si traduce in una formazione organizzata di osso prossimale a disinstallazione (Figura 2). Nelle fasi successive della rigenerazione, gli osteoblasti non proliferativi derivati dal blastema sono localizzati adiacenti al ceppo osseo e sono distarsichi legati da osteoblasti proliferanti. Gli osteoblasti proliferanti, a loro volta, sono distarsiche legate dalla proliferazione di cellule blastemale indifferenziate. La sonda fluorescente dell'immunohistochimica per il marcatore blastema CXCR4 identifica le cellule del blastema precoce associate alla superficie ossea ferita seguite da un'immunostaining avanzata nelle fasi di rigenerazione successive (Figura 2). Il blastema è avasc13 e l'immunofluorescenza per il marcatore di cellule endoteliali vWF identifica poche cellule positive all'interno della regione blastema (Figura 2).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri del Muneoka Lab e del Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Questo lavoro è stato supportato dalla Texas A&M University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
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