Summary
Här presenterar vi ett protokoll för Adult Mouse Terminal phalanx amputation för att undersöka däggdjur embryon formation och intramembranös ossification, analyseras med fluorescerande immunohistokemi och sekventiell in-vivo mikrodatortomografi.
Abstract
Här presenterar vi ett protokoll för vuxna mus distala Terminal phalanx (P3) amputation, en processuellt enkel och reproducerbar däggdjurs modell av epimorfiska förnyelse, vilket innebär embryon bildning och intramembranös benbildning analyseras av fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo-mikrodatortomografi (μCT). Föryngring av däggdjur är begränsad till amputationer som transekera distala regionen av terminalen falangen (P3); siffror amputerade vid mer proximala nivåer misslyckas med att regenerera och genomgå fibrotisk läkning och ärrbildning. Regenereringsrespons förmedlas genom bildandet av en proliferativ BLASTEMA, följt av ben förnyelse via intramembranös ossifiering för att återställa amputerad skelett längd. P3 amputation är en preklinisk modell för att undersöka epimorfiska regenerering hos däggdjur, och är ett kraftfullt verktyg för utformningen av terapeutiska strategier för att ersätta fibrotisk läkning med en lyckad regenerativ respons. Vårt protokoll använder fluorescensimmunohistokemi till 1) identifiera tidiga och sena embryon cellpopulationer, 2) studie revaskularisering i samband med förnyelse, och 3) undersöka intramembranös ossifikation utan behov av komplexa ben stabiliseringsanordningar. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att skapa högupplösta bilder för att undersöka morfologiska förändringar efter amputation, samt kvantifiera volym och längdförändringar i samma siffra under loppet av förnyelse. Vi tror att detta protokoll erbjuder enorma verktyg för att undersöka både epimorfiska och vävnad regenerativ svar hos däggdjur.
Introduction
Däggdjur, inklusive människor och möss, har kapacitet att regenerera tips av sina siffror efter distala amputation av terminalen falangen (P3)1,2,3. I möss är regenereringssvaret amputation-nivå-beroende; alltmer proximala amputationer visar ett progressivt försvagat regenerativt svar tills fullständig regenerativ svikt vid amputationer transekera och proximalt till P3-Nagel matrisen4,5,6 , 7 , 8. P3 Regeneration medieras av bildandet av en BLASTEMA, definierad som en population av prolifererande celler som genomgår morfogenes för att återskapa de amputerade strukturerna9. Bildandet av en embryon att regenerera strukturer förlorade genom amputation, en process som kallas epimorfiska förnyelse, skiljer multi-vävnad-nivå P3 förnyelse svar från traditionell vävnad reparation efter skada6, 10. P3 regeneration är en reproducerbar och processuellt enkel modell för att undersöka komplexa regenerativa processer inklusive sårläkning11,12, ben histolys11,12, revaskularisering13, perifer nervregeneration14, och blastemal omvandling till ben via intramembranös ossifikation15.
Tidigare studier med immunohistokemi har visat att embryon är heterogena, avaskulära, hypoxiska, och mycket proliferativ11,13,15,16. Efter den distala P3-amputation associeras tidigt embryon initialt med P3 periostet och endosteum och kännetecknas av robust proliferation och begynnande osteogenes i anslutning till ben ytan15. Efter bennedbrytning och sår stängning bildas den heterogena embryon genom sammanslagning av periostal och endosteal-associerade celler, följt av differentiering av blastemal komponenter inklusive ben via intramembranös ossifikation 15.
Ben reparation som svar på skada uppstår vanligen genom endochondral benbildning, dvs via en initial brosk förhårdnader som bildar en mall för efterföljande benbildning17,18. Långa ben intramembranös ossifikation, dvs benbildning utan en brosk intermediär, är vanligen induceras med hjälp av komplexa distraktion enheter eller kirurgisk fixering19,20. Siffran regenereringsrespons är en preklinisk modell som erbjuder fördelar jämfört med konventionella intramembranösa benbildning modeller: 1) det kräver inte yttre eller inre fixering efter skada för att stimulera intramembranös benbildning, 2) det är utförs med 4 siffror från varje djur, vilket maximerar prover samtidigt minimera djuranvändning, och 3) sekventiell in vivo mikrodatortomografi (μCT) analys kan utföras med lätthet och hastighet.
I den nuvarande studien visar vi det standardiserade P3-amputation-planet för att uppnå ett reproducerbart och robust regenereringssvar. Dessutom, vi visar en optimerad fluorescens immunohistokemi protokoll med paraffin sektioner för att visualisera embryon bildning, revaskularisering i samband med förnyelse, och blastemal omvandling till ben via Intramembranous Förbening. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att identifiera förändringar i ben morfologi, volym och längd i samma siffra under regenereringen. Målet med detta protokoll är att undersöka bildandet av embryon från däggdjur efter amputation och att demonstrera 2 tekniker, fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo μct, för studiet av intramembranös ben förnyelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djuranvändning och tekniker var i överensstämmelse med standardrutiner för den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Texas A & M University.
1. Adult mus bakbenen distala P3 amputation
- Anesthetize en 8 till 12 vecka gammal CD-1 mus (tabell över material) med isofluran gas i syre; initialt söva på 3% i en kammare, följt av 2% isofluran levereras av en noskon under varaktigheten av operationen. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
Anmärkning: De vuxna P3-amputation-studierna som standardiserats i vårt labb utförs på 8 till 12 veckor gamla möss, och regenereringssvaret bevaras i alla testade stammar. - Under en 10X dissektion Mikroskop, sterilisera siffrorna i bakbenen med kirurgisk povidon-jod och 70% etanol. Trimma håret bort från operationsområdet med hjälp av mikro-sax. Applicera 1 μl lokal bupivacaine lokalt för att söva operationsområdet.
- Amputera den distala spetsen på terminalen falangen (P3) på siffrorna 2 och 4 i varje bakben med en steril #10 skalpell (figur 1a). Amputation måste utföras under aseptiska förhållanden, inklusive sterilisering av kirurgiska instrument. Under dissektion Mikroskop, försiktigt splay den Hind Paw att exponera den mediala siffran ytan. Håll skalpell i en vinkel parallellt med Fettvaddera för att utföra amputation som visas i figur 1b. Applicera 1 μL topikal Bupivacaine på amputation webbplatsen.
Anmärkning: Amputation transekter Nagel orgeln, dermis, P3 benet, vasculature, och nerver, men inte transekt märg hålighet eller siffran fett pad. Om blödning observeras, Applicera direkt tryck med en steril applikator för bomulls spets. - Standard P3 distala amputation planet avlägsnar ca 15% – 20% av P3-benvolymen21. MicroCT scanning (se nedan) kan utföras för att bekräfta den korrekta amputation längd.
- Tillbaka musen till en ren bur och låta såret att läka utan sår dressing. Övervaka musen i 3 dagar för att säkerställa att musen återgår till normal aktivitet.
2. Digit insamling och vävnads beredning
- Euthanize musen med hjälp av koldioxid (CO2) i en sluten kammare, följt av cervikal dislokation.
- Använd en skalpell för att bryta siffran halvvägs genom angränsande ben segment, mitten falangen (P2) ben, vid ungefär den andra ventrala fett pad indrag. Överför siffrorna till en 20 mL scintillationsflaska innehållande 10 mL färsk buffrad zinkformalin fixativ, en 18% formaldehydlösning (se tabell över material). Fixativ volym bör vara minst 20x volymen av vävnaden närvarande.
Anmärkning: Siffrorna samlas in vid olika tidpunkter efter amputation för att undersöka det fullständiga regenereringssvaret. I allmänhet, för tidig embryon bildning, ben histolysis, och sår stängning samlingen tidpunkter är 4 – 8 dagar efter amputation (DPA). För att undersöka tidig osteogen embryon insamlingstiden är 9 och 10 DPA, och för att visualisera fortsatt ben förnyelse och mineralisering är insamlingstiden 14, 21 och 28 DPA. Även oamputerade siffror samlas in. - Fixera siffran för 24 – 48 h vid rumstemperatur med skonsam mixning i en shaker.
- Ta bort fixativ och tvätta siffran 2x i 5 min i 5 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur.
- Placera 10 mL färsk Decalcifier i (se tabell över material), en 10% myrsyra lösning, i scintillationsflaskan och blanda försiktigt på en shaker för 2 h vid rumstemperatur. Efter 2 h, Ersätt decalcifier jag med färsk lösning och avkalka siffra över natten vid rumstemperatur med mild blandning på shaker.
- Ta bort Decalcifier i och tvätta siffran 2x i 5 min i 5 mL 1x PBS i rumstemperatur.
-
Bearbeta siffran genom en graderad etanol serie. Denna process kan utföras manuellt i en 20 mL scintillationskampull, med 10 mL av varje vätska om mindre än 40 totala siffror.
- Börja med 2 immersioner i färsk 70% etanol vid rumstemperatur med mild blandning på en shaker, 1 h vardera, följt av 2 immersioner i färsk 95% etanol vid rumstemperatur med mild blandning på en shaker, 1 h vardera.
- Fyll siffran dehydrering med 2 tvättar av färska 100% etanol vid rumstemperatur med mild blandning på en shaker, 1 h vardera. Den slutliga 100% etanol tvätt kan lämnas över natten.
- I samma scintillationinjektionsflaska, Byt ut 100% etanol med 10 mL färska xylener, och placera injektionsflaskan i en kemisk draghuv för 1,5 h vid rumstemperatur. Upprepa med en fräsch tvätt av xylener i en kemisk draghuv för 1,5 h vid rumstemperatur för totalt 2 tvättar.
- Byt ut xylenerna med flytande paraffinvax smält till 68 ° c, och placera injektionsflaskan i en inkubator vid 68 ° c för 2 h, 2 gånger. Efter 4 totalt h nedsänkning i paraffinvax, bädda in siffran för paraffin snittning.
Anmärkning: Digit bearbetning för histologi kan utföras i en automatiserad processor, enligt samma riktlinjer. - Sektions siffrorna vid 4 – 5 μm tjocklek med hjälp av en mikrotom. Placera sektionerade prover på självhäftande diabilder med hjälp av ett 38 – 41 ° c vattenbad kompletterat med en histologisk adhesiv lösning för att säkerställa att proverna följer bilden. Placera diabilder på en 37 ° c Skjut varmare för att torka.
3. immunohistokemisk färgning av vuxna mus siffror för att undersöka BLASTEMA-bildning och Intramembranös ossifiering
- Värme sektionerad diabilder vid 65 ° c för 45 min, följt av upphettning vid 37 ° c i inte mindre än 15 min för att se prover följa bilden.
- Deparaffinize och rehydrera glider 2x med 5 min tvättar av xylener, en graderad etanol serie, och nedsänkning i vatten. Placera diabilder i en 50 – 100 mL kapacitets färgning burk och Håll nedsänkt i 1x Tris buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST).
Anmärkning: Låt inte proverna torka under hela infärgningsprocessen. Vid varje TBST steg, kan diabilder inkuberas upp till 2 h. - Förbered en fuktande kammare. En 1-tums djup täckt plast Slide box med fuktad silkespapper vid basen är tillräcklig.
- Förbered värmeåtervinnings lösningen för Runx2, Osterix (OSX) och proliferating Cell Nuclear antigen (PCNA). För antigen hämtning av den tidiga osteoprogenitor markören, Runx2, Bered en 1x lösning av Tris-EDTA, pH 8. För den osteoblast markören, OSX, förbereda en 1x lösning av citratbuffert, pH 6. PCNA immunofärgning kan utföras i endera lösningen.
- Bered proteinase k antigen hämtnings lösning för embryon-markören CXCR422 och endotelcellernas markör von Willebrands faktor 8 (VWF) genom att placera 100 μl proteaslösning per bild i ett microcentrifugerör och upphettas till 37 ° c (ungefär 5 min).
Anmärkning: Antigen hämtning för Runx2, OSX och PCna utförs med hjälp av värmeåtervinning, och CXCR4 och VWF antigen hämtning utförs via proteinas K behandling. - För antikropps återvinning som kräver värme, sänk ned diabilderna i en Färgnings burk i lämplig antigen hämtnings lösning. Värmeglas till 95 ° c i 25 min, vilket garanterar kokning inte uppstår. Ta bort Färgnings burken från värmekällan och låt svalna i rumstemperatur för 35 min.
- För proteinas K-antigen hämtning, lägga glider platt i befuktning kammaren, och placera 100 μL av förvärmda Proteinase K på bilden. Täck över bilderna med en liten remsa av parafilm för att se till att bilderna inte blir torra. Inkubera diabilder i 12 min vid 37 ° c.
- Tvätta bilder 3 gånger för 5 min i 1x TBST i färgning burk efter antigen hämtning.
- Ta bort diabilder från infärgnings burken och placera den i fuktande kammare. Placera 6 – 7 droppar blockerande lösning (tabell över material) på bilden, och täck bilden med färsk paraffin film för att se till att bilden inte blir torr. Inkubera diabilder i 1 h vid rumstemperatur.
- Bered de primära antikropparna genom att späda antikropparna till antikropps spädningsmedel (tabell över material). Vortex varje primär antikropps lösning för 3 s. primär antikroppar som härrör från olika värdarter kan kombineras.
Anmärkning: Immunohistokemisk färgning för Runx2 (kanin anti-Runx2 antikropp, 1:250 utspädning, vid en slutkoncentration av 4 μg/mL) kombinerat med PCNA (monoklonal mus anti-PCNA antikropp, 1:2000 utspädning, vid en slutlig koncentration av 0,5 μg/mL), och OSX (kanin anti-OSX antikropp, 1:400 spädning, vid en slutkoncentration på 0,125 μg/mL) i kombination med PCNA visas i figur 2. Den mus anti-PCNA antikropp som används i denna studie är mycket specifik och kräver inga ytterligare blockerande steg utöver de som beskrivs i detta protokoll. Immunohistokemisk färgning med CXCR4 (råtta anti-CXCR4 antikropp, 1:500 utspädning vid en slutlig koncentration av 2 μg/mL) och vWF (kanin anti-human vWF VIII antikropp, 1:800 spädning, vid en slutkoncentration av 41,25 μg/mL) visas i figur 2. Primära antikroppar optimerades och testades av vårt labb under villkoren i detta protokoll och listas i material tabellen. - Ta försiktigt bort paraffin filmen och dränera försiktigt bilden på silkespapper för att avlägsna överflödig blockerande lösning. Placera 100 – 200 μL primär antikropps lösning på bilden, Byt ut parafilmskyddet och återvänd till den fuktande kammaren. Inkubera glasen i den stängda fuktande kammaren över natten vid 4 ° c.
Anmärkning: Låt inte bilderna bli torra medan du tömmer blockeringslösningen. Det här steget utförs snabbt. - Ta försiktigt bort parafilmen och dränera försiktigt den primära antikroppslösningen från bilden. Placera bilden i en färgburk som innehåller färska 1X TBST. Tvätta med färskt 1x TBST i 5 min 3 gånger.
- Förbered de sekundära antikropparna genom att kombinera med antikropps spädningsvätska (tabell över material). Vortex den sekundära antikroppslösningen för 3 s. sekundära antikroppar som konjugeras till olika fluoroforer som härrör från olika arter kan kombineras.
Anmärkning: Fluorescerande sekundära antikroppar är ljuskänsliga. Alexa fluor 488-konjugerad get anti-kanin IgG (H + L) för Runx2, OSX och vWF, Alexa fluor 568-konjugerad get anti-råtta IgG (H + L) för CXCR4, och Alexa fluor 647-konjugerat get anti-Mouse IgG (H + L) för PCNA, utspädd vid 1:500 med en slutlig koncentration av 4 μg/mL , användes i diagram 2. - Placera 200 μL sekundär antikropps lösning på bilden, täck bilden med färsk paraffin film och återgå till fuktande kammare. Inkubera glasen i den stängda fuktande kammaren för 45 min vid rumstemperatur. Se till att befuktning kammaren är stängd för att undvika ljus.
- Ta försiktigt bort paraffin filmen och dränera försiktigt den sekundära antikroppslösningen från bilden. Placera bilden i en färgburk som innehåller färska 1x TBST. Tvätta med färskt 1x TBST i 5 min 3x. Undvik ljus.
- Förbered nukleär fläck. Tillsätt 20 μL DAPI (lager-DAPI-lösning är 5 mg/mL i H2O) till 200 ml 1x PBS och skaka kraftigt för att säkerställa homogenitet. Doppa diabilder i 5 min i DAPI-PBS lösning. Undvik ljus.
- Tvätta glas i dH2O under 3 min. dekanera vattnet och låt bilderna lufttorka eller försiktigt aspirera vattnet från bilden, se till att proverna inte störs medan dammsugning. Undvik ljus.
- Noggrant täckglas torra diabilder med 100 μL av anti-Fade monteringsmedel (tabell över material); Undvik bildandet av luftbubblor på bilden under monterings steget. Förvara bilderna plant och låt monterings mediet torka över natten vid rumstemperatur i en ljus tålig behållare. När monterings mediet är torrt, förvara glider platt i en ljus-bevis behållare i 4 ° c tills klar att visa.
Anmärkning: Om oacceptabla nivåer av luftbubblor finns efter monteringen, kan den monterade bilden försiktigt placeras i 1x PBS, täckglas kan avlägsnas, och när bilden sköljs igen i vatten och återtorkas, kan återmonteras.
4. mikroskopi och bildanalys
Anmärkning: Avbildning och analys med hjälp av en fluorescens deconvolution Mikroskop och tillhörande programvara, utrustad med 3 fluorescerande filter (för att visualisera Alexa fluor 488, 568, och 647 nm signaler), plus DAPI (419 nm) används i detta experiment.
- Avbilda bilden vid 10X förstoring för att fånga hela embryon-regionen.
Anmärkning: Prolifererande osteoblast primär antikropps detektering använder sekundära antikroppar (Alexa fluor 488 och 647) med icke-överlappande emissions spektra för att minimera felaktig identifiering av co-märkta celler. Bakgrunds subtraktion av autofluorescent signal kan utföras med hjälp av 568 nm-filtret för att säkerställa integriteten för signalerna 488 eller 647. BLASTEMA primär antikropps detektering använder sekundära antikroppar (Alexa fluor 488 eller 568). Bakgrunds subtraktion av autofluorescent signal kan utföras med 568-filtret om du använder 488-konjugerad antikropp, och 488-filtret använder den 568-konjugerade antikroppen. Autofluorescent signal associeras vanligtvis med nagelplattan och erytrocyter under hela siffran, och observeras i filtren 488, 568 och 647.
5. sekventiell in vivo Mikrodatortomografi (μCT)
- Regenererande siffror av samma djur skannas på 1 dag före amputation (unamputated), 1 DPA, och vid olika tidpunkter tills fullständig förnyelse vid 28 DPA med hjälp av vivaCT 40 (tabell över material) utförs i detta experiment och visas i Figur 3A.
- Utrusta μCT med slangar så att syre rinner in och ut ur μCT-djurkammaren, vilket säkerställer att det utströmmande syret är utrustat med ett aktivt kolfilter för att fälla isofluran.
Anmärkning: Se till att den μCT djur kammaren är tättsluten; på detta sätt krävs inte ett djur näsa-kon för att förse isofluran med musen under genomsökningen. - Förbered de μCT skannings parametrarna. Siffrorna skannas med en Voxel storlek på 10,5 μm, vid 55 kVp, 145 uA med 1000 projektioner per 180 ° med kontinuerlig rotation, och med en integrations tid på 200 MSEK, vilket resulterar i högst 213 skivor per skanning. Skanningar som utförs i detta experiment är ungefär 9 min långa. En minskad elektrisk ström kan kompenseras med proportionellt ökad integrations tid men kommer att resultera i längre skannings tider.
- Anesthetize den vuxna musen med isofluran; initialt söva på 3% i en kammare, följt av 1,5% isofluran levereras till μct djur kammaren under hela genomsökningen. Försiktigt placera musen i μct djur kammaren med bakbenet siffrorna arrangerade i nära anslutning, platt, ventrala sida upp med vänster tass på vänster sida och höger tass på höger sida på scanning plattform, följt av försiktigt säkra siffrorna på plats med hjälp av kirurgiska Band. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Returnera musen till en ren bur och övervaka musen tills vaken. Fortsätt Skanna samma mus på varannan vecka till veckovisa tidpunkter för att visualisera hela ben förnyelse svar.
- Efter skanning, låt upp till flera timmar för μCT bild rekonstruktion inträffa. Med hjälp av programvaran som medföljer μCT, konvertera filerna till en serie DICOM-filer; varje DICOM fil kommer att motsvara en bit av skanningen, därför, om 213 skivor har skannats, 213 DICOM filer kommer att genereras och laddas upp till företagets server.
- Ladda ner DICOM-serien i en enda mapp med hjälp av en batchfil Downloader i en webbläsare.
- Data överför den BoneJ plugg23 och hinder arkivera in i imagej plugg broschyren. I ImageJ, öppna DICOM-filserien som en stapel genom att dra och släppa mappen till ImageJ bar. En 16-bitars bildstapel som visar alla gråa värden kommer att öppnas. För att endast Visa ben, utför bild tröskel (Image > Justera > tröskel).
Anmärkning: När du visar ImageJ-filer kommer ImageJ-utdata att motsvara en inverterad bild av siffrorna. dvs siffror ordnade i skannings plattformen ventrala sida upp, med vänster tass på vänster sida av plattform och höger tass på höger sida av plattformen, visas som rygg sida upp, höger tass på vänster sida och vänster tass på höger sida av ImageJ bildstapeln. - När dialogrutan tröskelvärde öppnas skjuter du det nedre fältet, som motsvarar det övre tröskelvärdet, längst till höger och justerar det övre fältet, vilket motsvarar det undre tröskelvärdet, tills endast benet är markerat rött. Det lägre tröskelvärdet kommer att vara cirka 10000 – 13000 vid en maximal signalintensitet på 32 767. Klicka på Verkställoch i dialogrutan Ny klickar du på svart bakgrund. Klicka på OK.
- En 8-bitars bild som visar svarta och vita värden kommer att genereras, med vit som motsvarar ben. Markera P3-benet genom att rita en rektangel runt den och duplicera stacken. Skapa en 3D-bild (insticks program ≫ 3D-visning). Om du vill beskära onödiga ben från bilden klickar du på verktyget Frihandsmarkering och cirklar det ben som ska tas bort. Högerklicka och välj Fyll markering för att ta bort ben.
Anmärkning: Stegen som beskrivs ovan gäller ImageJ 1.52 h, Java 8 och kan skilja sig något när du använder en annan version av ImageJ. För Thresholding rekommenderar vi bestämning av ett optimalt värde och använder det värdet konsekvent. - Kvantifiera ben volym från 3D-rendering med hjälp av BoneJ Volume fraktion plugin (Plugins ≫ Bonej > volymfraktion). Ett resultatfönster visas och ben volym (BV) visas i mm3.
- Kvantifiera benlängden från 3D-rendering med hjälp av verktyget ImageJ Multipoint.
Anmärkning: Benlängden är dynamisk under loppet av P3 förnyelse; längden minskar mellan 7-10 DPA i samband med osteoklast-medierad bennedbrytning11, och följs av en period av distala benåterväxt mellan 14-28 DPA (figur 3b). Längden mäts från den centrala basen av P2/P3-leden till den yttersta punkten av mineraliseringen vid den distala ben spetsen, men inkluderar inte degraderad ben som har varit helt frånkopplad (figur 3b). BoneJ möjliggör fullständig 3D-bedömning av ben arkitektur; Sålunda, vinkeln där benet skannas kommer inte att förändra förmågan att mäta längd. - Fånga en bild av 3D-renderingen genom att klicka på Visaoch ta ögonblicksbild. Spara bilden som en TIF-eller JPEG-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vuxna mus regenerering P3 siffror på 6/7 DPA (figur 2A-D), 9 DPA (figur 2e-H) och 10 DPA (figur 2i-L) var immunostained med antikroppar mot Runx2, OSX, och PCna att visualisera intramembranösa ben och immunfärgade med antikroppar mot CXCR4 och VWF för att visualisera embryon-bildningen. Representativa μCT-tolkningar av siffror som skannats före amputation och vid olika tidpunkter under regenereringen (figur 3a, B) och identifiering av de landmärken som används för att identifiera längdmätningar (figur 3b) är visas också.
Figur 1: siffer nummer och identifiering av det vuxna mus distala P3-amputation-planet. Den vuxna musen höger baktass visas med siffror numrerade 1-5; amputationer utförda i denna studie utförs på siffrorna 2 och 4 (a). Det distala P3-amputation-planet visas (streckad linje) på siffrorna 2 och 4 (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tidig intramembranös ossifikation och embryon formation i regenererande vuxen mus P3 siffra. Runx2 (grön) och PCna (magenta) dubbel immunofluorescens visar att prolifererande osteoprogenitorer initialt lokaliserade till periost och Endostal ben ytor på 6/7 DPA, och expandera till distala embryon vid 9 och 10 DPA (a, E, I). OSX (grön) och PCNA (magenta) dubbel immunofluorescens Visa några OSX-positiva osteoblaster och bred spridning vid 6/7 (B), och förstärkt OSX immunofärgning distalt avgränsas av prolifererande celler vid 9 och 10 DPA (F, J). CXCR4 (röd) immunofluorescensbildning identifierar tidig embryon bildas vid 6/7 DPA (C), följt av robust CXCR4 immunofärgning i 9 och 10 DPA regenererande siffror (G, K). VWF (grön) immunofärgning identifierar intakt kärl i märgen av amputerade siffror, och några positiva celler i samband med avaskulära embryon (D, H, L). Proverna motfärgas med DAPI. Dorsal är till toppen, distalt är till höger. Bl = BLASTEMA, m = märg. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: P3 ben förnyelse visualiseras genom sekventiell in vivo μCT-skanning. Representativa μCT-tolkningar av en siffra som skannats före amputation (unamp), och vid 1, 7, 10, 14, 21 och 28 DPA. μCT scanning visar P3 förnyelse kännetecknas av en initial ben histolysis svar, följt av ben öformation vid 14 DPA och robust ben förnyelse vid 21 och 28 DPA (a). Representativa μCT-tolkningar av en siffra som skannas före amputation och vid 1, 7, 10, 14, 21 och 28 DPA som illustrerar de regioner där siffer längden mäts vid varje tidpunkt. B) gröna prickar anger den totala längden mätt, medan det röda krysset betecknar den region av utvisade ben som är utesluten från Längdmätningen. Enskilda siffer bilder som skapas av ImageJ kan beskäras för att standardisera sifferstorleken för att möjliggöra skapandet av bilder som ses i denna figur. Distalt är till höger, är dorsala till toppen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver ett standardiserat förfarande för vuxna mus distala P3 amputation, fluorescerande immunohistokemisk färgning för att visualisera och undersöka embryon bildning och intramembranös ossification, och sekventiell in vivo μct skanning till identifiera ben morfologiska, volym och längdförändringar efter amputation. P3 amputation är en unik, processuellt enkel och reproducerbar modell för att analysera en proregenerativ sårmiljö som utlöser embryon-bildning. Dessutom erbjuder den P3-siffriga modellen många fördelar jämfört med traditionella ben skade modeller för att undersöka intramembranös ossifiering.
För att detta protokoll ska bli framgångsrik måste fullständig Digit dealcification utföras. I händelse av att siffran inte är helt decalcified, kommer det att falla sönder och strimla under snittning processen. Dessutom kan värmeåtervinning immunohistokemi vara problematiskt i att vävnaderna kan lossna något eller bli helt lossnat från bilden. För att lindra detta problem bör proverna monteras på självhäftande glas med hjälp av ett vattenbad som kompletteras med ett histologiskt adhesivt medel, samt bakning av torr rutschbanorna till 65 ° c före användning. Slutligen är mus siffrorna relativt små. Därför, för att korrekt visualisera morfologi och kvantifiera förändringar i ben volym och längd, måste μCT vara av tillräcklig upplösning för att fungera vid lämpliga scanning parametrar.
En begränsning av denna metod är att inte alla primära antikroppar är förenliga med vävnadfixering och paraffin bearbetning. I detta fall kan standard frysande vävnads kryosnitt utföras för att säkerställa integriteten hos det primära antikropps antigen11. Kryosektionering eliminerar också behovet av dealcification steg, men vi har funnit att kryosektionering av siffror är tekniskt mer utmanande än paraffin snittning.
Hela embryon kan visualiseras vid 10X förstoring av deconvolution mikroskopi, och med hjälp av lämplig bild kvantifiering programvara, kan immunfärgnings resultat lätt kvantifieras. Fluorescerande immunohistokemi sondering för Osteogena markörer av regenererande siffran ger en unik bild av blastemal differentiering via intramembranös ossification. Immunohistokemisk färgning avslöjar P3-benregenereringssvaret är polariserat och resulterar i organiserad proximal-till-distala benbildning (figur 2). Vid senare regenereringsstadier är icke-proliferativa osteoblaster som härrör från embryon lokaliserade intill ben stubben och är distalt avgränsas av prolifererande osteoblaster. Den prolifererande osteoblaster, i sin tur, är distalt avgränsas av prolifererande odifferentierade blastemal celler. Fluorescerande immunohistokemi sondering för embryon markör CXCR4 identifierar tidiga embryon celler i samband med den skadade benytan följt av förbättrad immunofärgning vid senare regenereringsstadier (figur 2). Embryon är avaskulär13 och immunofluorescens för endotelcellernas markör VWF identifierar några positiva celler i embryon-regionen (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Muneoka Lab och Texas Institute for genomisk medicin (TIGM). Detta arbete stöddes av Texas A & M University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A.
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
