Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal adulta do falange do rato para investigar a formação mamífero do blastema e a ossificação intramembranosos, analisadas pelo immunohistochemistry fluorescente e pelo tomography microcomputado in-vivo seqüencial.
Abstract
Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal distal do falange (P3) do rato adulto, um modelo mamífero processualmente simples e reprodutível da regeneração epimórfica, que envolve a formação do blastema e a ossificação intramembranosos analisadas por Immunohistochemistry da fluorescência e tomography microcomputado in-vivo seqüencial (μCT). A regeneração dos mamíferos é restrita a amputações que transecting a região distal do terminal falange (P3); os dígitos amputados em uns níveis mais proximal não conseguem regenerar e submeter-se à cura fibrótica e à formação da cicatriz. A resposta de regeneração é mediada pela formação de um blastema proliferativo, seguido pela regeneração óssea via ossificação intramembranosa para restaurar o comprimento esquelético amputado. A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica em mamíferos, e é uma ferramenta poderosa para o projeto de estratégias terapêuticas substituir a cura fibrótica com uma resposta regenerativa bem sucedida. Nosso protocolo usa a imunohistoquímica de fluorescência para 1) identificar populações de células de blastema precoces, 2) revascularização do estudo no contexto da regeneração e 3) investigar a ossificação intramembranosa sem a necessidade de osso complexo dispositivos de estabilização. Também demonstramos o uso de μCT sequencial in vivo para criar imagens de alta resolução para examinar as alterações morfológicas após a amputação, bem como quantificar mudanças de volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. Nós acreditamos que este protocolo oferece a utilidade tremenda para investigar epimórfica e respostas regenerativa do tecido nos mamíferos.
Introduction
Os mamíferos, incluindo humanos e camundongos, têm a capacidade de regenerar as pontas de seus dígitos após a amputação distal da falange terminal (P3) 1,2,3. Em camundongos, a resposta de regeneração é dependente do nível de amputação; As amputações cada vez mais proximal do dígito exibem uma resposta regenerativa progressivamente atenuada até a falha regenerativa completa em amputações que transecting e proximal à matriz de prego P34,5,6 , 7 anos de , 8. a regeneração P3 é mediada pela formação de um blastema, definido como uma população de células proliferantes que passam por morfogênese para regenerar as estruturas amputadas9. A formação de um blastema para regenerar as estruturas perdidas pela amputação, um processo denominado regeneração epimórfica, distingue a resposta de regeneração P3 de nível multitecidual do reparo tecidual tradicional após a lesão6, 10. a regeneração P3 é um modelo reprodutível e proceduralmente simples para investigar processos regenerativos complexos, incluindo cicatrização de feridas11,12, histólise11,12, revascularização13, regeneração periférica14do nervo, e conversão de blastemal ao osso através da ossificação intramembranosos15.
Estudos prévios com imunohistoquímica demonstraram que o blastema é heterogêneo, avascular, hipóxico e altamente proliferativo11,13,15,16. Após a amputação distal do P3, o blastema precoce é inicialmente associado ao periósteo P3 e ao endoesteto e caracteriza-se por proliferação robusta e osteogênese nascente adjacente à superfície óssea15. Subseqüente à degradação do osso e ao fechamento da ferida, o blastema heterogêneo é dado forma pela fusão de pilhas periosteal e endoroubo-associadas, seguidas pela diferenciação de componentes blastemal que incluem o osso através da ossificação intramembranosos quinze anos.
O reparo ósseo em resposta à lesão ocorre tipicamente pela ossificação endocondral, ou seja, por meio de um calo cartilaginoso inicial que forma um modelo de formação óssea subseqüente17,18. A ossificação intramembranosos do osso longo, isto é, formação do osso sem um intermediário cartilaginoso, é induzida geralmente usando dispositivos complexos da distracção ou a fixação cirúrgica19,20. A resposta de regeneração de dígitos é um modelo pré-clínico que oferece vantagens sobre os modelos de ossificação intramembranosa convencional: 1) não requer lesão pós-fixação externa ou interna para estimular a ossificação intramembranosa, 2) é realizada com 4 dígitos de cada animal, maximizando as amostras e minimizando o uso de animais, e 3) a análise sequencial in vivo do tomography microcomputado (μCT) pode ser executada com facilidade e velocidade.
No presente estudo, mostramos o plano de amputação P3 padronizado para obter uma resposta de regeneração reprodutível e robusta. Adicionalmente, Nós demonstramos um protocolo aperfeiçoado da imunohistoquímica da fluorescência usando seções da parafina para visualizar a formação do blastema, o revascularização no contexto da regeneração, e a conversão blastemal ao osso através de intramembranosos Ossificação. Também demonstramos o uso de μCT in vivo sequencial para identificar alterações na morfologia óssea, volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. O objetivo deste protocolo é investigar a formação de blastema de mamíferos após a amputação e demonstrar 2 técnicas, imunohistoquímica de fluorescência e μCT in vivo sequencial, para o estudo da regeneração óssea intramembranosa.
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Protocol
Todo o uso e técnicas de animais estavam em conformidade com os procedimentos operacionais padrão do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Texas A & M.
1. amputação do distal P3 do membro adulto do mouse traseiro
- Anestesie um mouse CD-1 de 8 a 12 semanas (tabela de materiais) usando gás isoflurano em oxigênio; inicialmente anestesiados a 3% em uma câmara, seguido de 2% de isoflurano fornecido por uma nosecona durante o período cirúrgico. Aplique a pomada oftálmica nos olhos para impedir o secura quando a anestesia.
Nota: Os estudos adultos da amputação P3 estandardizados em nosso laboratório são executados em 8 a 12 ratos week-old, e a resposta da regeneração é conservada em todas as tensões testadas. - um microscópio da dissecção 10x, esterilizar os dígitos do membro traseiro com o Povidone-Iodo cirúrgico e o etanol 70%. Aparar o cabelo longe do local cirúrgico usando Microtesouras. Aplique 1 μL de bupivacaína tópica localmente para anestesiizar o sítio cirúrgico.
- Amputar a ponta distal da falange terminal (P3) nos dígitos 2 e 4 de cada membro posterior usando um bisturi #10 estéril (Figura 1a). A amputação deve ser realizada condições assépticas, incluindo a esterilização de instrumentos cirúrgicos. o microscópio da dissecção, splay delicadamente a pata Hind para expor a superfície medial do dígito. Segure o bisturi em um ângulo paralelo ao fatpad para realizar a amputação mostrada na Figura 1b. Aplique 1 μL de bupivacaína tópica no local da amputação.
Nota: A amputação transecera o órgão ungueal, a derme, o osso P3, a vasculatura e os nervos, mas não transecto a cavidade da medula ou a almofada gorda do dígito. Se for observado sangramento, aplique pressão direta usando um aplicador de ponta de algodão estéril. - O plano de amputação distal P3 padrão remove aproximadamente 15% – 20% do volume ósseo P321. A varredura de MicroCT (veja abaixo) pode ser executada para confirmar o comprimento correto da amputação.
- Retorne o mouse para uma gaiola limpa e permitir que a ferida para curar sem curativo. Monitore o mouse por 3 dias para garantir que o mouse retorne à atividade normal.
2. coleção de dígitos e preparação de tecidos
- Eutanizar o rato usando dióxido de carbono (CO2) em uma câmara fechada, seguido por luxação cervical.
- Use um bisturi para separar o dígito mid-Way através do segmento ósseo adjacente, o osso da Falange média (P2), em aproximadamente o segundo recuo ventral da almofada gorda. Transfira os dígitos para um frasco para injetáveis de cintilação de 20 mL contendo 10 mL de fixador de formol de zinco fresco tamponado, uma solução de formaldeído a 18% (ver tabela de materiais). O volume de fixative deve ser pelo menos 20x o volume do presente do tecido.
Nota: Os dígitos são coletados em vários temporais após a amputação para investigar a resposta completa da regeneração. Geralmente, para a formação precoce de blastema, histólise óssea e fechamento da ferida, os temporais da coleta são de 4 a 8 dias após a amputação (DPA). Para investigar o blastema osteogénico adiantado os temporais da coleção são 9 e 10 DPA, e para visualizar a regeneração e a mineralização continuadas do osso, os temporais da coleção são 14, 21, e 28 DPA. Os dígitos não amputados são recolhidos também. - Fixe o dígito durante 24 – 48 h à temperatura ambiente com uma mistura suave numa coqueteleira.
- Retire o fixador e lave o dígito 2x durante 5 min em 5 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato 1x (PBS) à temperatura ambiente.
- Coloque 10 mL de descalcificador I fresco (ver tabela de materiais), uma solução de ácido fórmico a 10%, no frasco de cintilação e misture suavemente numa coqueteleira durante 2 h à temperatura ambiente. Após 2 h, substitua o descalcificador I por uma solução fresca e um dígito descalcificante durante a noite à temperatura ambiente com uma mistura suave na coqueteleira.
- Retire o descalcificador I e lave o dígito 2x durante 5 min em 5 mL de 1X PBS à temperatura ambiente.
-
Processe o dígito através de uma série de etanol graduada. Este processo pode ser feito manualmente em um frasco de 20 mL de cintilação, usando 10 mL de cada líquido se menos de 40 dígitos totais.
- Comece com 2 imersões em etanol fresco 70% à temperatura ambiente com mistura suave em um Shaker, 1 h cada, seguido por 2 imersões em etanol fresco 95% à temperatura ambiente com mistura suave em um Shaker, 1 h cada.
- Complete a desidratação de dígitos com 2 lavagens de etanol fresco de 100% à temperatura ambiente com mistura suave em uma coqueteleira, 1 h cada. A lavagem de etanol 100% final pode ser deixada durante a noite.
- No mesmo frasco de cintilação, substitua o etanol a 100% com 10 mL de xilenos frescos e coloque o frasco para injetáveis numa capa de fumos químicas durante 1,5 h à temperatura ambiente. Repita com uma lavagem fresca dos xilenos em uma capa química das emanações para 1,5 h na temperatura ambiente para um total de 2 lavagens.
- Substitua os xilenos por cera líquida de parafina derretida a 68 ° c, e coloque o frasco em uma incubadora a 68 ° c por 2 h, 2 vezes. Após 4 h total da imersão na cera de parafina, incorpore o dígito para o corte da parafina.
Nota: O processamento de dígitos para a histologia pode ser realizado em um processador automatizado, seguindo estas mesmas diretrizes. - Dígitos da seção com espessura de 4 – 5 μm usando um micrótomo. Coloc amostras seccionadas em corrediças adesivas, usando um banho de água de 38 – 41 ° c suplementado com uma solução adesiva histológica para assegurar que as amostras aderem à corrediça. Coloque os slides em um aquecedor de slides de 37 ° c para secar.
3. coloração imuno-histoquímica de dígitos adultos do mouse para investigar a formação de blastema e ossificação intramembranosa
- O calor seccionado desliza em 65 ° c por 45 minuto, seguido pelo aquecimento em 37 ° c para não menos de 15 minutos para assegurar que as amostras aderem à corrediça.
- Desparaffinize e rehidrate slides 2x com 5 min de lavagem de xilenos, uma série de etanol graduada, e submersão em água. Coloque os slides em um frasco de 50 – 100 mL de coloração de capacidade e mantenha-o imerso em 1x Tris Buffered Saline com Tween 20 (TBST).
Nota: Não permita que as amostras SECem durante todo o processo de coloração. Em qualquer etapa do TBST, os slides podem ser incubados até 2 h. - Prepare uma câmara de umidificação. Uma caixa de corrediça plástica coberta profundamente de 1 polegada com papel de tecido umedecido na base é suficiente.
- Prepare a solução de recuperação de calor para Runx2, Osterix (OSX), e proliferating Cell nuclear Antigen (PCNA). Para a recuperação do antígeno do marcador osteoprogenitoras precoce, Runx2, prepare uma solução de 1x de tris-EDTA, pH 8. Para o marcador de osteoblastos, OSX, prepare uma solução 1x de tampão citrato, pH 6. A imunomarcação PCNA pode ser realizada em qualquer uma das soluções.
- Prepare a solução de recuperação do antígeno de proteinase K para o marcador de blastema CXCR422 e o marcador de células endoteliais von Willebrand factor 8 (fvw) colocando 100 μl de solução de proteinase k por slide em um tubo de microcentrífuga e aquecimento a 37 ° c (aproximadamente 5 min).
Nota: A recuperação do antígeno para Runx2, OSX, e PCNA é executada usando a recuperação de calor, e a recuperação do antígeno de CXCR4 e de vWF é executada através do tratamento do proteinase K. - Para a recuperação do anticorpo que exige o calor, mergulhe corrediças em um frasco de coloração na solução apropriada da recuperação do antígeno. As corrediças de calor a 95 ° c por 25 minutos, assegurando a ebulição não ocorrem. Remova o frasco de coloração da fonte de calor e deixe esfriar à temperatura ambiente por 35 min.
- Para a recuperação do antígeno do proteinase k, as corrediças da configuração lisas na câmara de umidificação, e colocam 100 μl de proteinase k pre-aquecido no slide. Cubra os slides com uma pequena faixa de parafilm para garantir que as lâminas não fiquem secas. Incubar lâminas por 12 min a 37 ° c.
- Lave as lâminas 3 vezes por 5 min em 1x TBST no frasco de coloração após a recuperação do antígeno.
- Retire as lâminas do frasco de coloração e coloque-a na câmara de umidificação. Coloque 6 – 7 gotas de solução de bloqueio (tabela de materiais) no slide, e cubra o slide com película de parafina fresca para garantir que o slide não se torne seco. Incubar lâminas para 1 h à temperatura ambiente.
- Prepare os anticorpos primários diluindo os anticorpos no solvente de anticorpo (tabela de materiais). Vortex cada solução de anticorpo primário para 3 s. os anticorpos primários derivados de diferentes espécies hospedeiras podem ser combinados.
Nota: Imunoistoquímica para Runx2 (coelho anti-Runx2 anticorpo, 1:250 diluição, numa concentração final de 4 μg/mL) combinada com PCNA (anticorpo monoclonal anti-PCNA, 1:2000 diluição, numa concentração final de 0,5 μg/mL), e OSX (coelho anti-OSX anticorpo, 1:400 diluição, na concentração final de 0,125 μg/mL) combinada com PCNA é mostrada na Figura 2. O anticorpo anti-PCNA do rato utilizado neste estudo é altamente específico e não requer passos adicionais de bloqueio para além dos descritos neste protocolo. A coloração imuno-histoquímica usando CXCR4 (anticorpo anti-CXCR4 de rato, 1:500 diluição em uma concentração final de 2 μg/mL) e fvw (anticorpo anti-humano de coelho vWF VIII, diluição de 1:800, em uma concentração final de 41,25 μg/mL) é mostrada na Figura 2. Os anticorpos primários foram otimizados e testados pelo nosso laboratório as condições deste protocolo e estão listados na tabela de materiais. - Retire cuidadosamente a película de parafina e escorra suavemente a corrediça sobre papel tissue para remover a solução de bloqueio em excesso. Coloque 100 – 200 μL de solução de anticorpos primários no slide, substitua a tampa parafilm e retorne à câmara de umidificação. Incubar as lâminas na câmara de umidificação fechada durante a noite a 4 ° c.
Nota: Não deixe os slides ficarem secos enquanto drenam a solução de bloqueio. Esta etapa é executada rapidamente. - Retire cuidadosamente o parafilm e escorra suavemente a solução de anticorpos primários do slide. Coloque o slide em um frasco de coloração contendo 1X TBST fresco. Lave com 1x TBST fresco por 5 min 3 vezes.
- Prepare os anticorpos secundários combinando com o diluente do anticorpo (tabela dos materiais). Vortex a solução secundária do anticorpo para 3 s. anticorpos secundários conjugados a diferentes fluoróforos derivados de diferentes espécies podem ser combinados.
Nota: Os anticorpos secundários fluorescentes são sensíveis à luz. Alexa fluor 488-conjugated cabra IgG anti-coelho (H + L) para Runx2, OSX, e vWF, Alexa fluor 568-conjugado de cabra anti-Rat IgG (H + L) para CXCR4, e Alexa fluor 647-conjugado de cabra anti-rato IgG (H + L) para PCNA, diluído em 1:500 com uma concentração final de 4 μg/mL , foram utilizados na Figura 2. - Coloque 200 μL de solução de anticorpos secundários no slide, deslize a tampa com película de parafina fresca e retorne à câmara de umidificação. Incubar as lâminas na câmara de umidificação fechada durante 45 min à temperatura ambiente. Assegure-se de que a câmara de humidificação esteja fechada para evitar a luz.
- Retire cuidadosamente a película de parafina e escorra suavemente a solução de anticorpos secundários do slide. Coloque o slide em um frasco de coloração contendo 1x TBST fresco. Lave com 1x TBST fresco por 5 min 3x. Evite a luz.
- Prepare a mancha nuclear. Adicionar 20 μL de DAPI (a solução de DAPI de estoque é 5 mg/mL em H2o) para 200 ml de 1X PBS e agitar vigorosamente para garantir a homogeneidade. Mergulhe os slides por 5 min na solução DAPI-PBS. Evite a luz.
- Lave as lâminas em dH2o durante 3 min. decantar a água e permitir que as lâminas para secar ao ar ou aspirar suavemente a água do slide, assegurando que as amostras não são perturbadas durante a aspiração. Evite a luz.
- Deslize cuidadosamente as lâminas secas usando 100 μL de meio de montagem antirdesvanecimento (tabela de materiais); Evite a formação de bolhas de ar na corrediça durante a etapa de montagem. Armazene as corrediças lisas e permita que o meio de montagem seque durante a noite na temperatura ambiente em um recipiente à prova de luz. Depois que o meio de montagem está seco, armazene corrediças horizontalmente em um recipiente à prova de luz em 4 ° c até pronto para ver.
Nota: Se os níveis inaceitáveis de bolhas de ar estão presentes após a montagem, a corrediça montada pode delicadamente ser coloc em 1X PBS, o lamela pode ser removido, e uma vez que a corrediça é enxaguada outra vez na água e re-dried, pode ser re-mounted.
4. microscopia e análise de imagem
Nota: A imagem latente e a análise usando um microscópio da desvolução da fluorescência e um software associado, equipados com os 3 filtros fluorescentes (para visualizar os sinais de Alexa fluor 488, 568, e 647 nanômetro), mais DAPI (419 nanômetro) são usados neste experimento.
- Imagem do slide em 10x ampliação para capturar toda a região blastema.
Nota: A detecção de anticorpos primários de osteoblastos proliferating utiliza anticorpos secundários (Alexa fluor 488 e 647) com espectros de emissão não sobrepostos para minimizar a identificação incorreta de células comarcadas. A subtração de fundo do sinal autofluorescente pode ser realizada usando o filtro 568 nm para garantir a integridade dos sinais 488 ou 647. A detecção de anticorpos primários blastema utiliza anticorpos secundários (Alexa fluor 488 ou 568). A subtração do fundo do sinal autofluorescent pode ser executada com o filtro 568 se usando o anticorpo 488-conjugated, e o filtro 488 está usando o anticorpo 568-conjugado. O sinal autofluorescente é tipicamente associado com a placa ungueal e eritrócitos ao longo do dígito, e é observado nos filtros 488, 568 e 647.
5. tomography Microcomputado in vivo sequencial (μCT)
- Os dígitos regenerantes do mesmo animal digitalizados em 1 dia antes da amputação (não amputada), 1 DPA, e em vários pontos do tempo até a regeneração completa em 28 DPA usando o vivaCT 40 (tabela de materiais) são executados neste experimento e mostrados em Figura 3A.
- Equipar o μCT com tubulação para permitir o fluxo de oxigênio dentro e fora da câmara animal do μCT, assegurando-se de que o oxigênio out-flowing esteja equipado com um filtro de carvão ativado para prender o Isoflurane.
Nota: Assegure-se de que a câmara animal do μCT seja fechada firmemente; desta maneira, um nariz-cone animal não é exigido para fornecer o isoflurano ao rato durante a varredura. - Prepare os parâmetros de digitalização μCT. Os dígitos são digitalizados em um tamanho de VOXEL de 10,5 μm, em 55 kVp, 145 uA com 1000 projeções por 180 ° usando a rotação contínua, e com um tempo de integração de 200 msec, resultando em um máximo de 213 fatias por varredura. As varreduras executadas neste experimento são aproximadamente 9 min de comprimento. Uma corrente elétrica diminuída pode ser compensada com o tempo de integração proporcionalmente aumentado, mas resultará em tempos de digitalização mais longos.
- Anestesie o rato adulto utilizando isoflurano; inicialmente anestesiados em 3% em uma câmara, seguido por 1,5% de isoflurano fornecido à câmara animal do μCT durante a duração da varredura. Coloc delicadamente o rato na câmara animal do μCT com os dígitos do hindmembro arranjados na associação próxima, horizontalmente, lado-acima ventral com pata esquerda no lado esquerdo e na pata direita no lado direito na plataforma da exploração, seguidos delicadamente fixando os dígitos no lugar usando cirúrgico Fita. Aplique a pomada oftálmica nos olhos para impedir o secura quando a anestesia.
- Retorne o mouse para uma gaiola limpa e monitore o mouse até acordar. Continue escaneando o mesmo mouse em pontos de tempo quinzenal a semanal para visualizar toda a resposta de regeneração óssea.
- Após a digitalização, aguarde até várias horas para que a reconstrução da imagem μCT ocorra. Usando o software fornecido com o μCT, converta os arquivos em uma série de arquivos DICOM; cada arquivo DICOM corresponderá a uma fatia da varredura, portanto, se 213 fatias foram verificadas, 213 arquivos DICOM serão gerados e carregados para o servidor da empresa.
- Faça o download da série DICOM em uma única pasta usando um downloader de arquivos em lote em um navegador da Web.
- Baixe o plugin BoneJ23 e arraste o arquivo para a pasta plugin ImageJ. No ImageJ, abra a série de arquivos DICOM como uma pilha arrastando e soltando a pasta na barra do ImageJ. Uma pilha de imagens de 16 bits exibindo todos os valores de cinza será aberta. Para exibir apenas o osso, execute a imagem limiarização (IMage > ajustar > limiar).
Nota: Ao visualizar arquivos ImageJ, a saída ImageJ corresponderá a uma imagem invertida dos dígitos; ou seja, dígitos dispostos na plataforma de digitalização lado ventral-up, com a pata esquerda no lado esquerdo da plataforma e pata direita no lado direito da plataforma, aparecerá como lado dorsal-up, pata direita no lado esquerdo e pata esquerda no lado direito da pilha ImageJ imagem. - Quando a caixa de diálogo de limite for aberta, deslize a barra inferior, correspondendo ao limite superior, à extrema direita, e ajuste a barra superior, correspondendo ao limite inferior, até que apenas o osso seja realçado em vermelho. O valor limiar mais baixo será de aproximadamente 10000 – 13000 a uma intensidade máxima de sinal de 32.767. Clique em aplicare, na nova caixa de diálogo, clique em fundo preto. Clique em OK.
- Uma imagem de 8 bits exibindo valores em preto e branco será gerada, com o branco correspondente ao osso. Selecione o osso P3 desenhando um retângulo ao redor dele e duplique a pilha. Gere uma imagem 3D (Plugins ≫ visualizador 3D). Para recortar qualquer osso desnecessário da imagem, clique na ferramenta de seleção à mão livre e circule o osso a ser excluído. Clique com o botão direito do mouse e selecione Preencher seleção para excluir osso.
Nota: As etapas descritas acima se aplicam a ImageJ 1.52 h, Java 8 e podem diferir ligeiramente ao usar uma versão diferente do ImageJ. Para Thresholding, recomendamos a determinação de um valor ideal e usando esse valor consistentemente. - Quantifique o volume ósseo da renderização 3D usando o plug-in de fração de volume BoneJ (Plugins ≫ Bonej > fração de volume). Aparecerá uma janela de resultado e o volume ósseo (BV) será exibido em mm3.
- Quantifique o comprimento do osso da renderização 3D usando a ferramenta multiponto ImageJ.
Nota: O comprimento ósseo é dinâmico no decorrer da regeneração P3; o comprimento diminui entre 7-10 DPA associada à degradação óssea mediada pelo osteoclast11e é seguido por um período de regeneração óssea distal entre 14-28 DPA (Figura 3B). O comprimento é medido a partir da base central da articulação P2/P3 até o ponto mais distante da mineralização no ápice ósseo distal, mas não inclui osso degradado que foi completamente destacado (Figura 3B). BoneJ permite a avaliação 3D completa da arquitetura óssea; assim, o ângulo em que o osso é verificado não alterará a capacidade de medir o comprimento. - Capture uma imagem da renderização 3D clicando em Exibire tirar instantâneo. Salve a imagem como um arquivo tif ou JPEG.
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Representative Results
O rato adulto que regenera os dígitos P3 em 6/7 DPA (Figura 2a-D), 9 DPA (Figura 2e-H), e 10 DPA (Figura 2i-L) foi immunomanchado com os anticorpos a Runx2, a OSX, e a PCNA para visualizar o osso intramembranosos regeneração, e immunomanchado com os anticorpos a CXCR4 e a fvw para visualizar a formação do blastema. Representações de μCT representativas de dígitos verificados antes da amputação e em vários pontos temporais ao longo da regeneração (Figura 3a, B) e identificação dos pontos de referência utilizados para identificar medições de comprimento (Figura 3B) são também são mostrados.
Figura 1: número de dígitos e identificação do plano de amputação P3 distal do camundongo adulto. A pata traseira direita do rato adulto é mostrada com dígitos numerados 1-5; As amputações executadas neste estudo são realizadas nos dígitos 2 e 4 (a). O plano distal de amputação P3 é mostrado (linha tracejada) nos dígitos 2 e 4 (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ossificação intramembranosa precoce e formação de blastema no dígito adulto de regeneração do rato P3. A imunofluorescência dupla de Runx2 (verde) e de PCNA (magenta) mostra que os osteoprogenitors proliferating são localizados inicialmente às superfícies periosteal e endoroubam do osso em 6/7 DPA, e expandem ao blastema longe do ponto de origem em 9 e 10 DPA (a, e, I). A imunofluorescência dupla de OSX (verde) e de PCNA (magenta) mostra poucos osteoblastos OSX-positivos e a proliferação larga em 6/7 (B), e a imunomarcação melhorada dos OSX delimitada distalmente por pilhas proliferating em 9 e em 10 DPA (F, J). A imunofluorescência do CXCR4 (vermelho) identifica a formação adiantada do blastema em 6/7 DPA (C), seguida pela IMUNOMARCAÇÃO CXCR4 robusta nos 9 e 10 dígitos de regeneração do DPA (G, K). a imunocoloração de vWF (verde) identifica a vasculatura intacta na medula de dígitos amputados, e poucas células positivas associadas ao blastema avascular (D, H, L). Amostras contramarcadas com DAPI. Dorsal é para o topo, distal é para a direita. BL = blastema, m = medula. Barras de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: regeneração óssea P3 visualizada por varredura sequencial in-vivo μCT. Representações de μCT representativas de um dígito digitalizados antes da amputação (unamp) e em 1, 7, 10, 14, 21 e 28 DPA. a varredura do μCT demonstra que a regeneração P3 é caracterizada por uma resposta inicial da histólise do osso, seguida pela formação do console do osso em 14 DPA e pela regeneração robusta do osso em 21 e em 28 DPA (A). Representações de μCT representativas de um dígito digitalizados antes da amputação e em 1, 7, 10, 14, 21 e 28 DPA ilustrando as regiões em que o comprimento do dígito é medido em cada ponto de tempo. (B) pontos verdes indique o comprimento total medido, enquanto o X vermelho denota a região do osso expulso excluído da medida do comprimento. As imagens individuais do dígito criadas por ImageJ podem ser cortadas para padronizar o tamanho do dígito para permitir a criação das imagens vistas nesta figura. Distal é à direita, dorsal é para o topo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um procedimento padronizado da amputação P3 longe do ponto de origem do rato adulto, mancha immunohistochemical fluorescente para visualizar e investigar a formação do blastema e a ossificação intramembranosos, e a exploração sequencial in vivo do μct a identificar alterações morfológicas ósseas, volume e comprimento pós-amputação. A amputação P3 é um modelo único, proceduralmente simples e reprodutível para analisar um ambiente pró-regenerativo da ferida que desencadeia a formação de blastema. Além disso, o modelo do dígito P3 oferece vantagens numerosas sobre modelos tradicionais da lesão do osso para investigar a ossificação intramembranosos.
Para assegurar o sucesso deste protocolo, a descalcificação completa do dígito deve ser executada. No caso em que o dígito não é completamente descalcificado, ele vai desmoronar e estilhaçar durante o processo de corte. Adicionalmente, a recuperação de calor immunohistochemistry pode ser problemático que os tecidos podem desprender ligeiramente ou se tornar inteiramente desalojada da corrediça. Para aliviar esta edição, as amostras devem ser montadas em corrediças adesivas usando um banho de água suplementado com um agente adesivo histológico, assim como o cozimento das corrediças secas a 65 ° c antes do uso. Por fim, os dígitos do mouse são relativamente pequenos; Conseqüentemente, a fim Visualizar exatamente a morfologia e quantificar mudanças no volume e no comprimento do osso, o μCT deve ser da suficiente definição para funcionar nos parâmetros apropriados da exploração.
Uma limitação deste método é que nem todos os anticorpos primários são compatíveis com a fixação do tecido e o processamento de parafina. Neste caso, o criossecção congelado padrão do tecido pode ser executado para assegurar a integridade do antígeno preliminar11do anticorpo. Criossecção igualmente elimina a necessidade para a etapa da descalcificação, porém nós encontramos que criossecção dos dígitos é tecnicamente mais desafiante do que o corte da parafina.
O blastema inteiro pode ser visualizado na ampliação 10x pela microscopia do deconvolução, e, usando o software apropriado da quantificação da imagem, os resultados da imunomarcação podem facilmente ser quantificados. A sondagem imuno-histoquímica fluorescente para marcadores osteogênicos do dígito regenerador fornece uma visão única da diferenciação blastemal via ossificação intramembranosa. A coloração imuno-histoquímica revela que a resposta de regeneração óssea P3 é polarizada e resulta em formação óssea proximal-distal organizada (Figura 2). Em estágios mais atrasados da regeneração, os osteoblastos não-proliferative derivados do blastema são localizados adjacentes ao coto do osso e são limitados distalmente por osteoblastos proliferating. Os osteoblastos proliferating, por sua vez, são limitados distalmente proliferating pilhas blastemal indiferenciadas. A sondagem imuno-histoquímica fluorescente para o marcador de blastema CXCR4 identifica células de blastema precoces associadas à superfície óssea ferida, seguidas de imunocoloração aprimorada em estágios posteriores de regeneração (Figura 2). O blastema é avascular13 e a imunofluorescência para o marcador de células endoteliais VWF identifica poucas células positivas dentro da região da blastema (Figura 2).
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório Muneoka e do Instituto Texas de Medicina Genômica (TIGM). Este trabalho foi apoiado pelo Texas A & M University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
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