Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 3Department of Neurosurgery, University of Mississippi Medical Center

Summary

هنا، نقدم بروتوكول اعادة الاستئصال الطرفية للفأر الكبار للتحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات وتحجر داخل الهستيرين، وتحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتتابع في الجسم الحي التصوير المقطعي المجهري.

Abstract

هنا، نقدم بروتوكول من الكبار الماوس البعيدة محطة phalanx (P3) بتر، نموذج الثدييات بسيطة إجرائيا واستنساخها من التجدد epimorphic، والذي ينطوي على تشكيل blastema والتحجر داخل التحجر تحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتصوير المقطعي المجهري المتسلسل في الجسم الحي (μCT). ويقتصر تجديد الثدييات على عمليات بتر الأطراف التي تنقل المنطقة البعيدة من الفالانكس الطرفي (P3)؛ الأرقام المبتورة في مستويات أكثر شبه ية تفشل في تجديد والخضوع للشفاء الليفي وتشكيل ندبة. يتم التوسط في استجابة التجديد عن طريق تشكيل انفجار التكاثري، تليها تجديد العظام عن طريق التحجر داخل العظام لاستعادة طول الهيكل العظمي المبتور. P3 بتر هو نموذج ما قبل السريرية للتحقيق في التجدد الشكلي في الثدييات، وهو أداة قوية لتصميم الاستراتيجيات العلاجية لاستبدال الشفاء الليفي مع استجابة تجديدية ناجحة. يستخدم بروتوكولنا الكيمياء المناعية الفلورية إلى 1) تحديد مجموعات الخلايا البلاسالتيما في وقت مبكر ومتأخر، 2) إعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، و 3) التحقيق في التحجر داخل العظام دون الحاجة إلى العظام المعقدة أجهزة التثبيت. كما نبرهن على استخدام التسلسلة في الجسم الحي μCT لإنشاء صور عالية الدقة لدراسة التغيرات المورفولوجية بعد البتر، فضلا عن قياس حجم وطول التغيرات في نفس الرقم على مدى التجديد. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر فائدة هائلة للتحقيق في كل من الاستجابات النضوجية والأنسجة التجديدية في الثدييات.

Introduction

الثدييات، بما في ذلك البشر والفئران، لديها القدرة على تجديد نصائح من أرقامها بعدبتر القاصي للphalanx الطرفية (P3) 1،2،3. في الفئران، استجابة التجديد تعتمد على مستوى البتر; عمليات بتر الأرقام القريبة بشكل متزايد تظهر استجابة تجديدية مخففة تدريجيًا حتى فشل تجديدي كامل عند بتر الأطراف وتنتقل والقريبة إلى مصفوفة الأظافر P34و5و6 , 7 , 8.يتم التوسط تجديد P3 عن طريق تشكيل blastema، ويعرف بأنه مجموعة من الخلايا المتكاثرة التي تخضع لمورفوجينيسيس لتجديد الهياكل المبتورة9. تشكيل blastema لتجديد الهياكل المفقودة عن طريق بتر، وهي عملية تسمى تجديد شكلي، يميز استجابة تجديد P3 متعددة الأنسجة المستوى من إصلاح الأنسجة التقليدية بعد الإصابة6، 10.P3 التجديد هو نموذج قابل للاستنساخ وبسيطة إجرائيا للتحقيق في العمليات التجديدية المعقدة بما في ذلك التئام الجروح11،12، الانحلال العظام11،12، إعادة الأوعية الدموية13، تجديد العصب المحيطي14، والتحويل الكيسي إلى العظام عن طريق التحجر داخل الأوعية15.

وقد أظهرت الدراسات السابقة باستخدام الكيمياء المناعية أن الانفجار غير متجانسة، والأوعية الدموية، نقص الأكسجة، والانتشار الشديد11،13،15،16. بعد بتر P3 القاصي، ويرتبط في البداية blastema في وقت مبكر مع periosteum P3 وendosteum ويتميز انتشار قوي وosteogenesis الوليدة المتاخمة لسطح العظام15. بعد تدهور العظام وإغلاق الجرح، يتم تشكيل الانفجار غير المتجانس من خلال دمج الخلايا المرتبطة بسرقة البيريوسرقة وendosteal، تليها التمايز بين المكونات الفجائية بما في ذلك العظام عن طريق التحجر داخل التحجر 15.

إصلاح العظام استجابة للإصابة يحدث عادة عن طريق التحجر endochondral، أي عن طريق الكالس الغضروفي الأولي الذي يشكل نموذجا لتشكيل العظام اللاحقة17،18. التحجر العظام طويلة intramembranous، أي تشكيل العظام دون وسيط ة غضروفية، ويحدث عادة باستخدام أجهزة الهاء معقدة أو التثبيت الجراحي19،20. استجابة تجديد الأرقام هو نموذج ما قبل السريرية التي تقدم مزايا على نماذج التحجر داخل memembranous التقليدية: 1) أنها لا تتطلب الخارجية أو الداخلية إصابة ما بعد التثبيت لتحفيز التحجر داخل، 2) فمن يتم تنفيذها باستخدام 4 أرقام من كل الحيوان، وبالتالي تعظيم العينات مع التقليل من استخدام الحيوانات، و 3) متسلسلة في التصوير المقطعي المجهري الجسم (μCT) يمكن أن يتم تحليل بسهولة وسرعة.

في هذه الدراسة، نبين طائرة البتر P3 الموحدة لتحقيق استجابة تجديد قابلة للاستنساخ وقوية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بإظهار بروتوكول الكيمياء المناعية الفلورية الأمثل باستخدام أقسام البارافين لتصور تشكيل blastema، وإعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، وتحويل blastemal إلى العظام عن طريق داخل الباالتخزينان التحجر. كما نبرهن على استخدام التغيرات المتسلسلة في الجسم الحي لتحديد التغيرات في مورفولوجيا العظام وحجمها وطولها في نفس الرقم على مدى التجدد. والهدف من هذا البروتوكول هو التحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات بعد بتر الأطراف وإظهار 2 تقنيات، الفلورة الكيمياء المناعية ومتسلسلة في الجسم الحي μCT، لدراسة تجديد العظام intramembranous.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وكانت جميع عمليات استخدام الحيوانات وتقنياتها متوافقة مع إجراءات التشغيل الموحدة للجنة المؤسسات لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة تكساس A&M.

1. الكبار ماوس هند أطرافه القاصي P3 بتر

  1. تخدير ماوس CD-1 من 8 إلى 12 أسبوعًا (جدولالمواد)باستخدام غاز الإيسوفيلوران في الأكسجين؛ في البداية التخدير في 3٪ في غرفة، تليها 2٪ isoflurane المقدمة من قبل أنفcone على مدى مدة الجراحة. تطبيق مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    ملاحظة: يتم إجراء دراسات بتر P3 للبالغين الموحدة في مختبرنا على الفئران التي تعمر من 8 إلى 12 أسبوعًا، ويتم الحفاظ على استجابة التجديد في جميع السلالات المختبرة.
  2. تحت مجهر تشريح 10X، تعقيم أرقام الطرف الخلفي مع اليود بوفيدون الجراحية والإيثانول 70٪. تقليم الشعر بعيدا عن الموقع الجراحي باستخدام مقص صغير. تطبيق 1 μL من Bupivacaine الموضعية محليا لالتخدير في الموقع الجراحي.
  3. بتر الطرف القاصي للفالانس الطرفي (P3) على الرقمين 2 و4 من كل طرف خلفي باستخدام مشرط #10 معقمة (الشكل1A). ويجب أن يتم البتر في ظروف معقمة، بما في ذلك تعقيم الأدوات الجراحية. تحت المجهر تشريح، تلعب بلطف مخلب الخلفية لفضح سطح الرقم الوسيط. عقد مشرط في زاوية موازية للدهون لأداء بتر المبينة في الشكل 1B. تطبيق 1 ميكرولتر من Bupivacaine الموضعية إلى موقع بتر.
    ملاحظة: يؤدي البتر إلى قطع عضو الأظافر، والأدمة، وعظم P3، والأوعية الدموية، والأعصاب، ولكن لا يقطع تجويف النخاع أو لوحة الدهون الرقمية. إذا لوحظ نزيف، وتطبيق الضغط المباشر باستخدام قضيب طرف القطن المعقمة.
  4. مستوى البتر القاصي P3 القياسي يزيل ما يقرب من 15٪-20٪ من حجم العظام P321. يمكن إجراء المسح الضوئي MicroCT (انظر أدناه) لتأكيد طول البتر الصحيح.
  5. إعادة الماوس إلى قفص نظيف والسماح للجرح للشفاء دون خلع الملابس الجرح. مراقبة الماوس لمدة 3 أيام لضمان عودة الماوس إلى النشاط العادي.

2. جمع الأرقام وإعداد الأنسجة

  1. قتل الفأر باستخدام ثاني أكسيدالكربون (CO 2) في غرفة مغلقة، تليها خلع عنق الرحم.
  2. استخدام مشرط لقطع الرقم في منتصف الطريق من خلال الجزء العظام المجاورة، والعظام phalanx الأوسط (P2)، في ما يقرب من المسافة البادئة وسادة الدهون البطني الثاني. نقل الأرقام (الأرقام) إلى قارورة التلألؤ ية 20 مل تحتوي على 10 مل من الزنك الطازج المخزنة رسميان المثبت، وهو حل الفورمالديهايد 18٪ (انظر جدولالمواد). يجب أن يكون حجم المثبتة 20X على الأقل حجم الأنسجة الموجودة.
    ملاحظة: يتم جمع الأرقام في نقاط زمنية مختلفة بعد البتر للتحقيق في استجابة التجديد الكامل. عموما، لتشكيل الانفجار في وقت مبكر، والانهاس العظام، وإغلاق الجرح النقاط الزمنية جمع 4-8 أيام بعد بتر (DPA). للتحقيق في الانفجار العظمي المبكر النقاط الزمنية جمع هي 9 و 10 DPA، وتصور استمرار تجديد العظام وتمعدن، والوقت جمع هي 14، 21، و 28 DPA. كما يتم جمع الأرقام غير المبتورة.
  3. إصلاح الرقم لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على شاكر.
  4. إزالة المثبت وغسل الرقم 2X لمدة 5 دقائق في 5 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
  5. ضع 10 مل من Decalcifier الطازجة 1 (انظر جدولالمواد)، حل حمض الفورميك 10٪، في قارورة التلألؤ ومزيج بلطف على شاكر لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد 2 ح، استبدال Decalcifier الأول مع حل جديد وأرقام الشارات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على شاكر.
  6. إزالة Decalcifier الأول وغسل الرقم 2X لمدة 5 دقائق في 5 مل من 1X PBS في درجة حرارة الغرفة.
  7. معالجة الرقم من خلال سلسلة الإيثانول متدرجة. ويمكن تنفيذ هذه العملية يدويا في قارورة التلألؤ 20 مل، وذلك باستخدام 10 مل من كل سائل إذا كان أقل من 40 أرقام المجموع.
    1. تبدأ مع 2 الغمر في الإيثانول 70٪ الطازجة في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على شاكر، 1 ساعة لكل منهما، تليها 2 الغمر في الإيثانول 95٪ الطازجة في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على شاكر، 1 ساعة لكل منهما.
    2. أكمل يُكمل الجفاف مع غسيلين من الإيثانول الطازج 100% في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على الهزاز، 1 ساعة لكل منهما. يمكن ترك غسل الإيثانول النهائي 100٪ بين عشية وضحاها.
  8. في نفس قارورة التلألؤ، استبدال الإيثانول 100٪ مع 10 مل من الزيلين الطازجة، ووضع القارورة في غطاء الدخان الكيميائي لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كرر مع غسل جديد من الزيلين في غطاء الدخان الكيميائي لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة لما مجموعه 2 يغسل.
  9. استبدال الزيلين مع شمع البارافين السائل ذاب إلى 68 درجة مئوية، ووضع القارورة في حاضنة في 68 درجة مئوية لمدة 2 ساعة، 2 مرات. بعد 4 ساعة من الغمر في شمع البارافين، قم بتضمين الرقم لقسم البارافين.
    ملاحظة: يمكن إجراء معالجة الأرقام لعلم الأنسجة في معالج تلقائي، باتباع نفس الإرشادات.
  10. أرقام المقطع بسمك 4-5 م باستخدام ميكروتومي. ضع عينات مقطعة على شرائح لاصقة، وذلك باستخدام حمام مائي 38-41 درجة مئوية مع حل لاصق النسيجي لضمان التزام العينات بالشريحة. ضع الشرائح على تدفئة شرائح 37 درجة مئوية لتجف.

3. تلطيخ الهيستوكيميائية من أرقام الماوس الكبار للتحقيق في تشكيل Blastema والتحجر داخل

  1. الشرائح تقسيم الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، تليها التدفئة في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة لضمان العينات التمسك الشريحة.
  2. إزالة البارافينيز وإعادة ترطيب الشرائح 2X مع 5 دقائق من الشهي من الزيلين، سلسلة الإيثانول متدرج، وغمر في الماء. ضع الشرائح في جرة تلطيخ سعة 50-100 مل وحافظ على غمره في 1x تريس المزيلة للتخزين مع توين 20 (TBST).
    ملاحظة: لا تسمح للعينات أن تجف طوال عملية تلطيخ. في أي خطوة TBST، يمكن احتضان الشرائح تصل إلى 2 ساعة.
  3. إعداد غرفة ترطيب. ويكفي مربع الشريحة البلاستيكية المغطاة بعمق 1 بوصة مع ورق الأنسجة المبلل في القاعدة.
  4. إعداد حل استرداد الحرارة Runx2، Osterix (OSX)، وتكاثر الخلية المستضد النووي (PCNA). لاسترجاع مستضد علامة osteoprogenitor في وقت مبكر، Runx2، وإعداد حل 1X من Tris-EDTA، درجة الحموضة 8. لعلامة osteoblast، OSX، إعداد حل 1X من المخزن المؤقت سيترات، درجة الحموضة 6. يمكن إجراء تلطيخ مناعة النفثالينات المتعددة الكلور في أي من الحلين.
  5. إعداد Proteinase K مستضد حل لعلامة blastema CXCR422 وعلامة الخلية البطانية فون ويلبراند عامل 8 (vWF) عن طريق وضع 100 ميكرولتر من Proteinase K الحل لكل شريحة في أنبوب الطرد المركزي الصغير والتدفئة إلى 37 درجة مئوية (تقريبا 5 دقائق).
    ملاحظة: يتم إجراء استرداد مستضد Runx2 و OSX و PCNA باستخدام استرداد الحرارة، ويتم إجراء استرداد مستضد CXCR4 و vWF عن طريق العلاج Proteinase K.
  6. لاسترجاع الأجسام المضادة التي تتطلب الحرارة، تزج الشرائح في جرة تلطيخ في حل استرداد مستضد المناسبة. الشرائح الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، وضمان الغليان لا يحدث. إزالة جرة تلطيخ من مصدر الحرارة والسماح لتبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 35 دقيقة.
  7. لاسترجاع مستضد Proteinase K، ضع الشرائح المسطحة في غرفة الترطيب، ووضع 100 ميكرولتر من Proteinase K المستحم مسبقا على الشريحة. تغطية الشرائح مع شريط صغير من parafilm لضمان الشرائح لا تصبح جافة. حضانة الشرائح لمدة 12 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. غسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في 1X TBST في جرة تلطيخ بعد استرداد مستضد.
  9. إزالة الشرائح من جرة تلطيخ ووضعها في غرفة الترطيب. ضع 6-7 قطرات منمحلول الحظر (جدول المواد) على الشريحة، وغطي الشريحة بفيلم البارافين الطازج لضمان عدم جفاف الشريحة. الشرائح الحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  10. إعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة فيتخفيف الأجسام المضادة (جدول المواد). دوامة كل حل الأجسام المضادة الأولية ل3 ق. يمكن الجمع بين الأجسام المضادة الأولية المستمدة من الأنواع المضيفة المختلفة.
    ملاحظة: تلطيخ الهيستوكيميائية مناعية لRunx2 (الأجسام المضادة للرونك2 الأرنب، 1:250 تخفيف، في تركيز نهائي من 4 ميكروغرام / مل) جنبا إلى جنب مع PCNA (أحادية النسيلة الماوس المضادة للنفثالينات المتعددة الكلور، 1:2000 تخفيف، في التركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل)، وOSX (أرنب المضادة OSX الأجسام المضادة، 1:400 تخفيف، في تركيز نهائي من 0.125 ميكروغرام / مل) جنبا إلى جنب مع PCNA يظهر في الشكل 2. الأجسام المضادة للنفثالينات المتعددة الكلور المستخدمة في هذه الدراسة محددة للغاية ولا تتطلب أي خطوات حظر إضافية تتجاوز تلك الموضحة في هذا البروتوكول. تلطيخ الهيزيتوكيميائية باستخدام CXCR4 (الفئران المضادة CXCR4 الأجسام المضادة، 1:500 تخفيف في تركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل) وvWF (أرنب المضادة للإنسان VWF الثامن الأجسام المضادة، 1:800 تخفيف، في تركيز نهائي من 41.25 ميكروغرام / مل) هو مبين في الشكل 2. تم تحسين الأجسام المضادة الأولية واختبارها من قبل مختبرنا في ظل الظروف الواردة في هذا البروتوكول وهي مدرجة في جدولالمواد.
  11. إزالة بعناية فيلم البارافين، واستنزاف بلطف الشريحة على ورقة الأنسجة لإزالة محلول حجب الزائدة. ضع 100-200 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الأساسي على الشريحة، واستبدال غطاء parafilm، والعودة إلى غرفة الترطيب. احتضان الشرائح في غرفة ترطيب مغلقة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: لا تدع الشرائح تصبح جافة في حين استنزاف الحل حظر. يتم تنفيذ هذه الخطوة بسرعة.
  12. قم بإزالة parafilm بعناية، واستنزاف بلطف الحل الأساسي للجسم المضاد من الشريحة. ضع الشريحة في جرة تلطيخ تحتوي على TBST 1X الطازجة. يغسل مع 1X TBST الطازجة لمدة 5 دقائق 3 مرات.
  13. إعداد الأجسام المضادة الثانوية عن طريق الجمع معمادة مخففة الأجسام المضادة (جدول المواد). دوامة الحل الأجسام المضادة الثانوية ل3 ق. يمكن الجمع بين الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع مختلف الفلوروفورات المستمدة من أنواع مختلفة.
    ملاحظة: الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت حساسة للضوء. Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit IgG (H+L) for Runx2, OSX, and vWF, Alexa Fluor 568-conjugated goat anti rat IgG (H+L) for CXCR4, and Alexa Fluor 647-conjud goat anti-mouse Ig (H+L) for PCNA, المخففة في 1:500 مع التركيز النهائي لـ CXCR4, وAlexa Fluor 647-المترافقالماعز المضادة للفأرة IgG (H+L) لـ PCNA, المخففة في 1:500 مع تركيز نهائي قدره 4 ميكروغرام/مل ، تم استخدامها في الشكل 2.
  14. ضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على الشريحة، وغطاء الشريحة مع فيلم البارافين الطازج، والعودة إلى غرفة الترطيب. احتضان الشرائح في غرفة ترطيب مغلقة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من إغلاق غرفة الترطيب لتجنب الضوء.
  15. قم بإزالة فيلم البارافين بعناية واستنزاف بلطف محلول الأجسام المضادة الثانوي من الشريحة. ضع الشريحة في جرة تلطيخ تحتوي على 1X TBST الطازجة. يغسل مع 1X TBST الطازجة لمدة 5 دقائق 3X. تجنب الضوء.
  16. جهزوا وصمة عار نووية إضافة 20 درجة مئوية من DAPI (الأوراق المالية DAPI الحل هو 5 ملغ / مل في H2O) إلى 200 مل من 1X PBS ويهز بقوة لضمان التجانس. تزج الشرائح لمدة 5 دقائق في DAPI-PBS الحل. تجنب الضوء.
  17. غسل الشرائح في dH2O لمدة 3 دقائق Decant الماء والسماح للشرائح لتجفيف الهواء أو يستنشق بلطف الماء من الشريحة، وضمان أن العينات لا تكون منزعجة أثناء المكنسة الكهربائية. تجنب الضوء.
  18. الشرائح الجافة غطاء بعناية باستخدام 100 درجةمئوية من المضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة (جدول المواد)؛ تجنب تشكيل فقاعات الهواء على الشريحة خلال خطوة تصاعد. تخزين الشرائح شقة والسماح للتركيب المتوسطة لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في حاوية واقية من الضوء. بعد أن تجف وسيلة التركيب، قم بتخزين الشرائح المسطحة في حاوية مقاومة للضوء في 4 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للعرض.
    ملاحظة: إذا كانت مستويات غير مقبولة من فقاعات الهواء موجودة بعد التركيب، يمكن وضع الشريحة المثبتة بلطف في 1X PBS، يمكن إزالة غطاء، وبمجرد شطف الشريحة مرة أخرى في الماء وإعادة تجفيفها، يمكن إعادة تركيبها.

4. الفحص المجهري وتحليل الصور

ملاحظة: التصوير والتحليل باستخدام مجهر deconvolution الفلورة والبرامج المرتبطة بها، ومجهزة 3 مرشحات الفلورسنت (لتصور اليكسا فلور 488، 568، و 647 إشارات نانومتر)، بالإضافة إلى DAPI (419 نانومتر) يستخدم في هذه التجربة.

  1. صورة الشريحة في التكبير 10X لالتقاط منطقة blastema بأكملها.
    ملاحظة: يستخدم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية المنتشرة في العظام الأجسام المضادة الثانوية (Alexa Fluor 488 و647) مع أطياف الانبعاثات غير المتداخلة لتقليل التعريف غير الصحيح للخلايا ذات العلامات المشتركة. يمكن إجراء الطرح الخلفية للإشارة الفلورسنت التلقائي باستخدام مرشح 568 نانومتر لضمان سلامة الإشارات 488 أو 647. يستخدم الكشف عن الأجسام المضادة الأولية Blastema الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 488 أو 568). يمكن إجراء الطرح الخلفي للإشارة الفلورسنت التلقائي مع مرشح 568 إذا كان استخدام الجسم المضاد 488 المترافق، ويستخدم مرشح 488 الجسم المضاد 568-متقارن. عادة ما ترتبط إشارة الفلورسنت التلقائي مع لوحة الأظافر وكريات الدم الحمراء في جميع أنحاء الرقم، ويلاحظ في 488، 568، و 647 مرشحات.

5. التسلسل في التصوير المقطعي المجهري في فيفو (μCT)

  1. يتم إجراء تجديد الأرقام من نفس الحيوان الممسوحة ضوئيا في 1 يوم قبل بتر (غير مبتورة)، 1 DPA،وفي نقاط زمنية مختلفة حتى تجديد كامل في 28 DPA باستخدام vivaCT 40 (جدول المواد) في هذه التجربة وتظهر في الشكل 3 ألف
  2. قم بتجهيز الـ μCT بالأنابيب لتمكين تدفق الأكسجين من وإلى غرفة الحيوانات، مما يضمن تجهيز الأكسجين المتدفق للخارج بفلتر فحم نشط لاعتراض الأيسوفلوران.
    ملاحظة: تأكد من أن غرفة الحيوانات μCT مغلقة بإحكام؛ وبهذه الطريقة ، لا يلزم مخروط أنف حيواني لتزويد الأيسوفلوران بالماوس أثناء الفحص.
  3. قم بإعداد معلمات المسح الضوئي للCT. يتم مسح الأرقام بحجم voxel من 10.5 ميكرومتر، عند 55 كيلو في بي في، 145 uA مع 1000 توقعات لكل 180 درجة باستخدام الدوران المستمر، ووقت التكامل 200 msec، مما أدى إلى حد أقصى من 213 شريحة لكل مسح. المسح الضوئي الذي أجري في هذه التجربة هو ما يقرب من 9 دقائق طويلة. يمكن تعويض انخفاض التيار الكهربائي مع زيادة نسبية وقت التكامل ولكن سوف يؤدي إلى أوقات أطول المسح الضوئي.
  4. تخدير الماوس الكبار باستخدام isoflurane. في البداية التخدير في 3٪ في غرفة، تليها 1.5٪ isoflurane الموردة إلى غرفة الحيوان μCT على مدى مدة المسح الضوئي. وضع الماوس بلطف في غرفة الحيوان μCT مع أرقام الخلفية مرتبة في ارتباط وثيق، شقة، الجانب البطني المتابعة مع مخلب الأيسر على الجانب الأيسر ومخلب اليمين على الجانب الأيمن على منصة المسح الضوئي، تليها تأمين بلطف الأرقام في مكان باستخدام الجراحية الشريط. تطبيق مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
  5. عودة الماوس إلى قفص نظيف ومراقبة الماوس حتى مستيقظا. استمر في مسح نفس الماوس في كل أسبوعين إلى نقاط زمنية أسبوعية لتصور استجابة تجديد العظام بأكملها.
  6. بعد المسح الضوئي، اسمح لما يصل إلى عدة ساعات لإعادة إنشاء الصورة μCT تحدث. باستخدام البرنامج المتوفر مع μCT، تحويل الملفات إلى سلسلة من ملفات dicom. كل ملف dicom سوف تتوافق مع شريحة واحدة من المسح الضوئي، وبالتالي، إذا تم مسح 213 شرائح، سيتم إنشاء 213 ملفات dicom وتحميلها على خادم الشركة.
  7. قم بتنزيل سلسلة dicom في مجلد واحد باستخدام تنزيل ملف دفعي في مستعرض ويب.
  8. تحميل البرنامج المساعد BoneJ23 واسحب الملف إلى مجلد البرنامج المساعد ImageJ. في ImageJ، افتح سلسلة ملفات dicom كمكدس عن طريق سحب المجلد وإفلاته إلى شريط ImageJ. سيتم فتح مكدس صور 16-بت يعرض كافة القيم الرمادية. لعرض العظام فقط، قمبإجراء عتبة الصورة (Image > ضبط > عتبة).
    ملاحظة: عند عرض ملفات ImageJ، يتوافق إخراج ImageJ مع صورة مقلوبة للأرقام; أي، الأرقام مرتبة في منصة المسح الجانبي البطني المتابعة، مع مخلب الأيسر على الجانب الأيسر من المنصة ومخلب اليمين على الجانب الأيمن من المنصة، وسوف تظهر كما الظهرية الجانب المتابعة، مخلب اليمين على الجانب الأيسر ومخلب اليسار على الجانب الأيمن من كومة صورة ImageJ.
  9. بمجرد فتح مربع الحوار عتبة، حرك الشريط السفلي، المقابلة للعتبة العليا، إلى أقصى اليمين، وضبط الشريط العلوي، المقابلة للعتبة السفلى، حتى يتم تمييز العظام فقط باللون الأحمر. وستكون قيمة العتبة الدنيا حوالي 000 10-000 13 عند حد أقصى لشدة الإشارة قدره 767 32. انقر فوق تطبيق، وفي مربع الحوار الجديد انقر فوق الخلفية السوداء. انقر فوق موافق.
  10. سيتم إنشاء صورة 8 بت تعرض قيم بالأبيض والأسود، مع اللون الأبيض المقابل للعظم. حدد عظم P3 عن طريق رسم مستطيل حوله، وتكرار المكدس. إنشاء صورة ثلاثيةالأبعاد (الإضافات > عارض ثلاثيالأبعاد). لاقتصاص أي عظم غير ضروري من الصورة، انقر فوق أداة التحديد الحر، والدوران حول العظم ليتم حذفه. انقر بزر الماوس الأيمن، وحدد تحديد التعبئة لحذف العظام.
    ملاحظة: تنطبق الخطوات الموضحة أعلاه على ImageJ 1.52h و Java 8 وقد تختلف قليلاً عند استخدام إصدار مختلف من ImageJ. بالنسبة للعتبات، نوصي بتحديد القيمة المثلى واستخدام تلك القيمة باستمرار.
  11. قياس حجم العظام من تقديم 3D باستخدام BoneJ حجم الكسر المساعد(الإضافات > BoneJ > حجم الكسر). ستظهر نافذة نتيجة، وسيتم عرض حجم العظام (BV) في مم3.
  12. قم بتحديد طول العظام من العرض ثلاثي الأبعاد باستخدام أداة ImageJ متعددة النقاط.
    ملاحظة: طول العظام دينامية على مدى تجديد P3; انخفاض طول بين 7-10 DPA المرتبطة تدهور العظام أوستيوكلست بوساطة11، ويلي هامدة من إعادة نمو العظام البعيدة بين 14-28 DPA (الشكل3B). يتم قياس الطول من القاعدة المركزية للمفصل P2/P3 إلى أبعد نقطة من التمعدن في قمة العظام البعيدة، ولكن لا يشمل العظام المتدهورة التي تم فصلها تماما (الشكل3B). BoneJ يسمح لتقييم 3D كاملة من العمارة العظام; وبالتالي، فإن الزاوية التي يتم مسح العظام لا يغير من القدرة على قياس الطول.
  13. التقط صورة للتقديم ثلاثي الأبعاد بالنقر فوق عرض، والتقط لقطة. حفظ الصورة كملف tif أو jpeg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الماوس الكبار تجديد أرقام P3 في 6/7 DPA (الشكل 2A-D)،9 DPA (الشكل2E-H)،و 10 DPA (الشكل2I-L)كانت ملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة لRunx2، OSX، و PCNA لتصور العظام داخل العظام تجديد، والمناعية مع الأجسام المضادة لCXCR4 وvWF لتصور تشكيل blastema. الرسومات التمثيلية للأرقام الممسوحة ضوئيًا قبل البتر وفي نقاط زمنية مختلفة على مدار فترة التجديد (الشكل3A،B) وتحديد المعالم المستخدمة لتحديد قياسات الطول (الشكل3B)هي كما هو مبين.

Figure 1
الشكل 1: رقم الرقم وتحديد طائرة بتر P3 البعيدة للفأر البالغ. يظهر مخلب هند الماوس الكبار مع أرقام مرقمة 1-5; يتم إجراء عمليات بتر الأطراف التي أجريت فيهذه الدراسة على الرقمين 2 و 4 (A). يتم عرض مستوى بتر P3 القاصي (خطمتقطع) على الرقمين 2 و4 (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحجر الداخلي المبكر وتشكيل الانفجار في التحريك الكبار الماوس P3 أرقام. Runx2 (الأخضر) و PCNA (أرجواني) مزدوجة الفلورة المناعية تظهر أن انتشار osteoprogenitorors يتم في البداية المترجمة إلى الأسطح العظمية periosteal وendosteal في 6/7 DPA، والتوسع إلى blastema القاصي في 9 و 10 DPA(A، E، I). OSX (الأخضر) و PCNA (أرجواني) ضعف الفلورة المناعية تظهر عدد قليل من الأوستوبلاست إيجابية OSX وانتشار واسع في 6/7 (B)، وتعزيز OSX مناعة تلطيخ غير محدد من قبل الخلايا المتكاثرة في 9 و 10 DPA (F،J). CXCR4 (الأحمر) المناعية يحدد تشكيل الانفجار في وقت مبكرفي 6/7 DPA (C)، تليها CXCR4 قوية تلطيخ المناعة في 9 و 10 DPA تجديد الأرقام (G،K). vWF (الأخضر) تلطيخ المناعة يحدد الأوعية الدموية سليمة في نخاع الأرقام المبتورة، وعدد قليل من الخلايا الإيجابية المرتبطة بالانفجار الأوعية الدموية(D، H،L). عينات ملطخة بـ DAPI. دورسال هو إلى الأعلى، والمسافة هو إلى اليمين. بل = بلاسيما، م = نخاع. قضبان مقياس = 100 درجة.

Figure 3
الشكل 3: تجديد العظام P3 تصور من قبل المسح المتسلسل في الجسم الحي μCT. التقديمات التمثيلية لرقم واحد ممسوحة ضوئيًا قبل البتر (unamp)، وفي 1 و7 و10 و14 و21 و28 DPA. μCT المسح يدل على تجديد P3 يتميز استجابة الانلل الانهيب العظام الأولية، تليها تشكيل جزيرة العظام في 14 DPA وتجديد العظام قوية في 21 و 28 DPA (A). التقديمات التمثيلية لرقم واحد تم مسحها ضوئيًا قبل البتر وفي 1 و7 و10 و14 و21 و28 DPA توضح المناطق التي يتم فيها قياس طول الأرقام في كل نقطة زمنية. (B) تشير النقاط الخضراء إلى الطول الإجمالي المقاس، في حين أن X الأحمر يشير إلى منطقة العظام المطرودة المستبعدة من قياس الطول. يمكن اقتصاص الصور الفردية التي تم إنشاؤها بواسطة ImageJ لتوحيد حجم الأرقام لتمكين إنشاء الصور التي يتم رؤيتها في هذا الشكل. القاصية إلى اليمين، الظهرية هي إلى الأعلى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراءً موحداً لبتر P3 القاصي للماوس البالغين، وتلطيخ الفلورسنت المناعي الكيميائي لتصور وتحرّي تشكيل البلازيما والتحجر داخل الجسم، والمسح المتسلسل داخل الجسم والأشعة المقطعية إلى تحديد العظام المورفولوجية، وحجم، وطول التغييرات بعد البتر. P3 بتر هو نموذج فريد من نوعه، بسيطة إجرائيا، واستنساخ لتحليل بيئة الجرح المؤيدة للتجدد الذي يؤدي إلى تشكيل blastema. وعلاوة على ذلك، فإن نموذج أرقام P3 يقدم العديد من المزايا على نماذج إصابات العظام التقليدية للتحقيق في التحجر داخل العظام.

ولضمان نجاح هذا البروتوكول، يجب إجراء لصائق كاملة. في حال لم يتم تحديد الرقم تماما، فإنه سوف تنهار ومزقت خلال عملية القسم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون الكيمياء المناعية استرجاع الحرارة إشكالية في أن الأنسجة قد فصل قليلا أو تصبح خلعتماما من الشريحة. للتخفيف من هذه المشكلة، يجب تركيب عينات على شرائح لاصقة باستخدام حمام مائي مكمّل بعامل لاصق نسيجي، وكذلك خبز الشرائح الجافة إلى 65 درجة مئوية قبل الاستخدام. وأخيراً، أرقام الماوس صغيرة نسبياً; لذلك، من أجل تصور دقيق مورفولوجيا وقياس التغيرات في حجم العظام وطولها، يجب أن يكون μCT من دقة كافية للعمل في معلمات المسح الضوئي المناسبة.

أحد قيود هذه الطريقة هو أن ليس كل الأجسام المضادة الأولية متوافقة مع تثبيت الأنسجة ومعالجة البارافين. في هذه الحالة، يمكن إجراء استئصال الأنسجة المجمدة القياسية لضمان سلامة مستضد الأجسام المضادة الأولية11. كما أن الاستئصال بالتبريد يلغي الحاجة إلى خطوة الشارات، غير أننا وجدنا أن تشريح الأرقام بالتبريد أكثر صعوبة من الناحية التقنية من قسم البارافين.

يمكن تصور blastema بأكمله في التكبير 10X عن طريق الفحص المجهري deconvolution، وذلك باستخدام برنامج تحديد حجم الصورة المناسبة، يمكن بسهولة تحديد كمية نتائج تلطيخ المناعة. توفر الكيمياء المناعية الفلورية التي تبحث عن علامات العظام للرقم المجدد رؤية فريدة من نوعها للتمايز البلازمي عن طريق التحجر داخل التحجر. تلطيخ الهيستوكيميائية المناعية يكشف عن استجابة تجديد العظام P3 مستقطبوووالنتائجفي تشكيل العظام القريبة من القاصي المنظم (الشكل 2). في مراحل التجدد في وقت لاحق، يتم تحديد الخلايا العظمية غير التكاثرية المستمدة من الانفجار بجوار جذع العظام، ويحدها من العظام المنتشرة. والخلايا العظمية المنتشرة، بدورها، لا تُقيَّد بتكاثر الخلايا الفجائية غير المتمايزة. الفلورسنت المناعية فحص لعلامة blastema CXCR4 يحدد الخلايا blastema في وقت مبكر المرتبطة سطح العظامالمصابة تليها تعزيز تلطيخ المناعة في مراحل التجديد في وقت لاحق (الشكل 2). الانفجار هو الأوعية الدموية13 والفلورة المناعية لعلامة الخلية البطانية vWF يحددعدد قليل من الخلايا الإيجابية داخل منطقة blastema (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر مونيوكا ومعهد تكساس للطب الجينومي (TIGM). وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تكساس A & M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein Block Serum Free DAKO X0909 Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody Abcam ab29 1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody R&D Systems MAB21651 1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody DAKO A0082 1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody Abcam ab22552 1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody Sigma-Aldrich Co. HPA022040 1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A21235 1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077 1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Ready to use
Surgipath Decalicifier 1 Leica Biosystems 3800400 Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative Anatech LTD 174 Ready to use
CD-1 Female Mouse Envigo ICR(CD-1) 8-12-weeks-old
vivaCT 40 SCANCO Medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
  2. Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
  3. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  4. Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
  5. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
  6. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  7. Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
  8. Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
  9. Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
  10. Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
  11. Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
  12. Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
  13. Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
  14. Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
  15. Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
  16. Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
  17. Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
  18. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
  19. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
  20. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
  21. Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
  22. Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
  23. Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموية، العدد 149، الرقم، البتر، التجديد الشكلي، التحجر داخل العظام، العظام، الباصيما، الشارات، الكيمياء المناعية الفلورية، التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, … More

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, K. N., Qureshi, O., Falck, A. R., Kim, P., Dolan, C. P., Yu, L., Lin, Y. L., Daniel, B., Yan, M., Muneoka, K. Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification. J. Vis. Exp. (149), e59749, doi:10.3791/59749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter