Summary
Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.
Abstract
Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen distale terminale falanx (P3) amputatie, een procedureel eenvoudig en reproduceerbaar zoogdier model van epimorfe regeneratie, dat blastema-vorming en intramembraneuze ossificatie omvat, geanalyseerd door fluorescentie immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie (μCT). De zoogdier regeneratie is beperkt tot amputaties die het distale gebied van de terminale falanx (P3) dwars doorkruisen; cijfers geampuleerd op meer proximale niveaus niet te regenereren en ondergaan fibrotische genezing en littekenvorming. De regeneratie respons wordt gemedieerd door de vorming van een proliferatieve blastema, gevolgd door botregeneratie via intramembraneuze ossificatie om de geampuleerde skelet lengte te herstellen. P3 amputatie is een preklinisch model om epimorfe regeneratie bij zoogdieren te onderzoeken, en is een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen van therapeutische strategieën om fibrotische genezing te vervangen door een succesvolle regeneratieve respons. Ons protocol maakt gebruik van fluorescentie immunohistochemie op 1) Identificeer vroege en late blastema celpopulaties, 2) Bestudeer revascularisatie in de context van regeneratie, en 3) onderzoek intramembraneuze ossificatie zonder de noodzaak van complexe botten stabilisatie apparaten. We demonstreren ook het gebruik van sequentiële in-vivo μCT om afbeeldingen met een hoge resolutie te maken om morfologische veranderingen na amputatie te onderzoeken, en om volume-en lengte veranderingen in hetzelfde cijfer te kwantificeren tijdens de regeneratie. Wij geloven dat dit protocol een enorm nut biedt om zowel epimorfe als weefsel regeneratieve reacties bij zoogdieren te onderzoeken.
Introduction
Zoogdieren, met inbegrip van mensen en muizen, hebben de capaciteit om de toppen van hun cijfers te regenereren na distale amputatie van de Terminal falanx (P3)1,2,3. Bij muizen is de regeneratie reactie amputatie-niveau afhankelijk; in toenemende mate van proximale cijfers wordt een geleidelijk verzwakte regeneratieve respons weergegeven totdat volledig regeneratief falen bij amputaties Romeinse en proximale naar de P3-nagel matrix4,5,6 , 7 , 8. P3-regeneratie wordt gemedieerd door de vorming van een blastema, gedefinieerd als een populatie van prolifererende cellen die morfogenese ondergaan om de geampuleerde structuren te regenereren9. De vorming van een blastema om de door amputatie verloren structuren te regenereren, een proces dat epimorfe regeneratie wordt genoemd, onderscheidt de P3-regeneratie respons op multi weefselniveau van de traditionele weefselherstel na blessure6, 10. P3-regeneratie is een reproduceerbaar en procedureel eenvoudig model om complexe regeneratieve processen te onderzoeken, waaronder wondgenezing11,12, bot histolysis11,12, revascularisatie13, perifere zenuw regeneratie14, en blastemal conversie naar bot via intramembraneuze ossificatie15.
Uit eerdere studies met immunohistochemie is gebleken dat de blastema heterogeen, avasculair, hypoxisch en zeer proliferatief is11,13,15,16. Na de distale P3-amputatie wordt de vroege blastema in eerste instantie geassocieerd met het P3-periosteum en endosteum en wordt gekenmerkt door een robuuste proliferatie en ontluikende osteogenese grenzend aan het botoppervlak15. Na botdegradatie en wondsluiting wordt de heterogene blastema gevormd door het samenvoegen van periostehoudende en endosteal geassocieerde cellen, gevolgd door de differentiatie van blastemale componenten, waaronder bot via intramembraneuze ossificatie 15.
Botreparatie in reactie op letsel treedt meestal op door endochondrale ossificatie, d.w.z. via een initiële kraakbeenachtige Callus die een sjabloon vormt voor daaropvolgende botvorming17,18. Lange botintramembraneuze ossificatie, d.w.z. botvorming zonder kraakbeen middel, wordt vaak geïnduceerd met behulp van complexe afleid inrichtingen of chirurgische fixatie19,20. De Digit-regeneratie respons is een preklinisch model dat voordelen biedt ten opzichte van conventionele intramembraneuze ossificatie modellen: 1) het vereist geen externe of interne fixatie post letsel om intramembraneuze ossificatie te stimuleren, 2) het is uitgevoerd met 4 cijfers van elk dier, waardoor monsters worden gemaximaliseerd terwijl het dier gebruik wordt geminimaliseerd, en 3) sequentiële in vivo microcomputer tomografie (μCT) analyse kan met gemak en snelheid worden uitgevoerd.
In de huidige studie tonen we het gestandaardiseerde P3-amputatie vlak om een reproduceerbare en robuuste regeneratie respons te bereiken. Daarnaast demonstreren we een geoptimaliseerd fluorescentie immunohistochemie protocol met behulp van paraffine secties om de vorming van blastema, revascularisatie in de context van regeneratie en de blastemal conversie naar het bot via intramembraneuze ossificatie. We demonstreren ook het gebruik van sequentieel in-vivo μCT om veranderingen in botmorfologie, volume en lengte in hetzelfde cijfer te identificeren in het verloop van de regeneratie. Het doel van dit protocol is om de vorming van zoogdieren blastema na amputatie te onderzoeken en om 2 technieken, fluorescentie immunohistochemie en sequentieel in vivo μCT te demonstreren, voor de studie van intramembraneuze botregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier gebruik en-technieken waren in overeenstemming met de standaardwerk procedures van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Texas A & M University.
1. volwassen muis Hind ledemaat distale P3 amputatie
- Anesthetiseer een 8 tot 12 week oude cd-1 muis (tabel met materialen) met behulp van Isofluraan gas in zuurstof; aanvankelijk anesthetiseren bij 3% in een kamer, gevolgd door 2% Isofluraan geleverd door een neuskegel over de duur van de operatie. Breng oftalmische zalf aan op de ogen om droogheid te voorkomen onder anesthesie.
Opmerking: De volwassen P3-amputatie studies gestandaardiseerd in ons lab worden uitgevoerd op 8 tot 12 weken oude muizen, en de regeneratie respons wordt bewaard in alle geteste stammen. - Onder een 10x dissectie Microscoop, steriliseren de cijfers van het achterste ledemaat met chirurgische Povidon-jodium en 70% ethanol. Trim haar weg van de operatieplaats met behulp van micro-schaar. Breng 1 μL lokale Bupivacaine lokaal aan om de operatieplaats te verdoenen.
- Laat de distale punt van de terminale falanx (P3) op de cijfers 2 en 4 van elk achterledemaat met een steriel #10 scalpel (Figuur 1a) amputeren. Amputatie moet worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden, met inbegrip van sterilisatie van chirurgische instrumenten. Onder de dissectie Microscoop, zachtjes figuur de achterpoot om het oppervlak van het mediale cijfer bloot te leggen. Houd de scalpel onder een hoek parallel aan de fatpad om de amputatie uit te voeren die in Figuur 1bwordt weergegeven. Breng 1 μL topische Bupivacaine aan op de amputatie plaats.
Opmerking: Amputatie transecten het nagel orgel, dermis, het P3-bot, vasculatuur, en zenuwen, maar niet transect de beenmerg holte of het cijfer Fat pad. Als de bloeding wordt waargenomen, breng dan direct druk aan met behulp van een steriele katoenen tip applicator. - Het standaard P3-distale amputatie vlak verwijdert ongeveer 15% – 20% van het P3-botvolume21. MicroCT scanning (zie hieronder) kan worden uitgevoerd om de juiste amputatie lengte te bevestigen.
- Keer de muis terug naar een schone kooi en laat de wond genezen zonder wond dressing. Houd de muis 3 dagen in de gaten om ervoor te zorgen dat de muis terugkeert naar de normale activiteit.
2. verzameling van cijfers en weefsel voorbereiding
- Euthanaseer de muis met behulp van koolstofdioxide (CO2) in een gesloten kamer, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Gebruik een scalpel om het cijfer halverwege de weg door het aangrenzende botsegment, het middelste falanx (P2) bot, te verbreken bij ongeveer de tweede ventrale vetpad inspringen. Breng het cijfer (de cijfers) over in een Scintillatie flacon van 20 mL met 10 mL verse gebufferde zink formaline fixative, een oplossing van 18% formaldehyde (Zie tabel met materialen). Fixatief volume moet ten minste 20 x het volume van het aanwezige weefsel zijn.
Opmerking: Cijfers worden verzameld op verschillende tijdstippen na amputatie om de volledige regeneratie reactie te onderzoeken. In het algemeen, voor vroege blastema vorming, bot histolyse, en wondsluiting de collectie tijdspunten zijn 4 – 8 dagen na amputatie (DPA). Om de vroege osteogene blastema te onderzoeken zijn de afhaal tijdspunten 9 en 10 DPA, en om aanhoudende botregeneratie en mineralisatie te visualiseren, zijn de afhaal tijdspunten 14, 21 en 28 DPA. Niet-geampuleerde cijfers worden ook verzameld. - Bevestig het cijfer voor 24 – 48 h bij kamertemperatuur met zacht mengen op een shaker.
- Verwijder de fixeer en was het cijfer 2x voor 5 min in 5 mL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
- Plaats 10 mL verse Decalcifier I (Zie tabel met materialen), een 10% mierenzuur oplossing, in de injectieflacon met Scintillatie en meng zachtjes op een shaker voor 2 uur bij kamertemperatuur. Na 2 h, vervang Decalcifier ik met verse oplossing en decalcify Digit 's nachts bij kamertemperatuur met zachte menging op Shaker.
- Verwijder de Decalcifier I en was het cijfer 2x voor 5 min in 5 mL 1x PBS bij kamertemperatuur.
-
Verwerk het cijfer door middel van een Graded ethanol serie. Dit proces kan handmatig worden uitgevoerd in een 20 ml Scintillatie injectieflacon, met 10 ml van elke vloeistof indien minder dan 40 totale cijfers.
- Begin met 2 onderdomsels in verse 70% ethanol bij kamertemperatuur met zachte menging op een shaker, elk 1 uur, gevolgd door 2 onderdomsels in verse 95% ethanol bij kamertemperatuur met zachte menging op een shaker, elk 1 uur.
- Voltooi het cijfer uitdroging met 2 wases van verse 100% ethanol bij kamertemperatuur met zachte menging op een shaker, elk 1 uur. De uiteindelijke 100% ethanol reiniger kan 's nachts worden achtergelaten.
- Vervang in dezelfde Scintillatie flacon de 100% ethanol met 10 mL verse xylenes en plaats de injectieflacon in een chemische rook afzuigkap voor 1,5 uur bij kamertemperatuur. Herhaal dit met een Fresh Wash van xylenen in een chemische damp afzuigkap voor 1,5 uur bij kamertemperatuur voor in totaal 2 wasmiddelen.
- Vervang de xylenen met vloeibare paraffinewas gesmolten tot 68 °C en plaats de injectieflacon in een incubator bij 68 °C gedurende 2 uur, 2 keer. Na 4 totaal h van onderdompeling in paraffinewas, het cijfer insluiten voor het snijden van paraffine.
Opmerking: De cijfer verwerking voor histologie kan worden uitgevoerd in een geautomatiseerde processor, volgens dezelfde richtlijnen. - Sectie cijfers bij 4 – 5 μm dikte met behulp van een microtoom. Plaats gesectioneerde samples op zelfklevende glijbanen met een water bad van 38 tot 41 °C aangevuld met een histologische lijm oplossing om ervoor te zorgen dat monsters aan de glijbaan hechten. Plaats de glijbanen op een 37 °C schuif warmer om te drogen.
3. immunohistochemische kleuring van volwassen muis cijfers om de vorming van Blastema en Intramembraneuze ossificatie te onderzoeken
- Warmte-verdeelde glijbanen bij 65 °C gedurende 45 min, gevolgd door verwarming bij 37 °C gedurende niet minder dan 15 minuten om ervoor te zorgen dat monsters aan de glijbaan hechten.
- Deparaffiniseren en hydrateren dia's 2x met 5 min wasbare van xylenes, een Graded ethanol serie, en onderdompeling in water. Plaats dia's in een 50 – 100 mL capaciteits kleurings potje en blijf ondergedompeld in 1x tris gebufferde zoutoplossing met tween 20 (TBST).
Opmerking: Laat gedurende het kleuringsproces geen monsters drogen. Bij elke TBST stap kunnen dia's tot 2 uur worden geïnineerd. - Maak een bevochtigend kamer. Een 1-inch diep beklede kunststof Slide box met vochtig tissuepapier aan de basis is voldoende.
- Bereid de warmteophaaloplossing voor Runx2, Osterix (OSX) en prolifererende cel nucleair antigeen (PCNA). Voor het antigeen-opvraging van de vroege osteoprogenitor marker, Runx2, bereid een 1x oplossing van tris-EDTA, pH 8. Voor de osteoblast marker, OSX, bereid een 1x oplossing van citraat buffer, pH 6. PCNA-immunokleuring kan in beide oplossingen worden uitgevoerd.
- Bereid een proteinase K-antigeen-ophaal oplossing voor de blastema marker CXCR422 en de endotheliale Celmarker Von Willebrand factor 8 (vwf) door 100 ΜL proteinase k-oplossing per dia in een micro centrifugebuis te plaatsen en te verwarmen tot 37 °c (ongeveer 5 min).
Opmerking: Het ophalen van antigeen voor Runx2, OSX en pcna wordt uitgevoerd met behulp van warmte retrieval, en CXCR4 en vwf antigeen retrieval wordt uitgevoerd via proteïnase K behandeling. - Voor het ophalen van antilichamen die warmte vereisen, moet u de dia's in een kleurpot in de juiste antigeen-ophaal oplossing onderdompelen. Warmte schuift tot 95 °C gedurende 25 minuten, waardoor het koken niet voorkomt. Verwijder kleurenpot uit warmtebron en laat afkoelen bij kamertemperatuur 35 min.
- Voor het ophalen van proteinase K-antigeen, leg dia's plat in de bevochtigend kamer en plaats 100 μL van voorverwarmde proteinase K op de glijbaan. Dek de dia's af met een kleine strook Parafilm om ervoor te zorgen dat de glaasjes niet droog worden. Incuberen de glijbanen gedurende 12 minuten bij 37 °C.
- Wasglaasjes 3 keer gedurende 5 min in 1x TBST in kleurings potje na antigeen-opvraging.
- Verwijder de dia's uit de kleurende pot en plaats deze in de bevochtigend kamer. Plaats 6 – 7 druppels blokkerende oplossing (Inhoudsopgave) op de glijbaan en bedek de glijbaan met verse paraffine folie om ervoor te zorgen dat de glijbaan niet droog wordt. Incuberen de glaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid de primaire antilichamen door de antilichamen te verdunen in antilichaam verdunningsmiddel (tabel van materialen). Vortex elke primaire antilichaam oplossing voor 3 s. primaire antilichamen afkomstig van verschillende hostsoorten kunnen worden gecombineerd.
Opmerking: Immunohistochemische kleuring voor Runx2 (konijn anti-Runx2 antilichaam, 1:250 verdunning, bij een eindconcentratie van 4 μg/mL) in combinatie met PCNA (monoklonale muis anti-PCNA-antilichaam, 1:2000 verdunning, bij een eindconcentratie van 0,5 μg/mL), en OSX (konijn anti-OSX antilichaam, 1:400 verdunning, bij een eindconcentratie van 0,125 μg/mL) in combinatie met PCNA wordt weergegeven in Figuur 2. De muis anti-PCNA-antilichamen die worden gebruikt in deze studie is zeer specifiek en vereist geen extra blokkerende stappen verder dan die in dit protocol worden beschreven. Immunohistochemische kleuring met behulp van CXCR4 (rat anti-CXCR4 antilichaam, 1:500 verdunning bij een eindconcentratie van 2 μg/mL) en vWF (konijn anti-humaan vWF VIII-antilichaam, 1:800 verdunning, bij een eindconcentratie van 41,25 μg/mL) wordt weergegeven in Figuur 2. Primaire antilichamen werden geoptimaliseerd en getest door ons lab onder de voorwaarden in dit protocol en staan vermeld in de tabel met materialen. - Verwijder de paraffine folie voorzichtig en giet de schuif voorzichtig op het tissuepapier om de overtollige blokkerende oplossing te verwijderen. Plaats 100 – 200 μL primaire antilichaam oplossing op de glijbaan, vervang Parafilm afdekking en keer terug naar de bevochtigend kamer. Inbroed de glaasjes in de gesloten bevochtigend kamer 's nachts bij 4 °C.
Opmerking: Laat de glaasjes niet droog worden terwijl de blokkerende oplossing leeg raakt. Deze stap wordt snel uitgevoerd. - Verwijder voorzichtig de Parafilm en giet de primaire antilichaam oplossing voorzichtig uit de glijbaan. Plaats de glijbaan in een kleurpot die vers 1X TBST bevat. Wassen met verse 1x TBST voor 5 min 3 keer.
- Bereid de secundaire antilichamen door te combineren met antilichaam verdunningsmiddel (tabel van materialen). Vortex de secundaire antilichaam oplossing voor 3 sec. secundaire antilichamen die worden geconjugeerd met verschillende fluoroforen die zijn afgeleid van verschillende soorten, kunnen worden gecombineerd.
Opmerking: Fluorescerende secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. Alexa Fluor 488-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L) voor Runx2, OSX, en vWF, Alexa Fluor 568-geconjugeerde geit anti-rat IgG (H + L) voor CXCR4, en Alexa Fluor 647-geconjugeerde geit anti-muis IgG (H + L) voor PCNA, verdund bij 1:500 met een uiteindelijke concentratie van 4 μg/mL , werden gebruikt in Figuur 2. - Plaats 200 μL secundaire antilichaam oplossing op de glijbaan, dek de glijbaan af met verse paraffine folie en keer terug naar de bevochtigend kamer. Incuberen de glaasjes in de gesloten bevochtigend kamer gedurende 45 min bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de bevochtigend kamer gesloten is om licht te vermijden.
- Verwijder de paraffine folie voorzichtig en giet de secundaire antilichaam oplossing voorzichtig uit de glijbaan. Plaats de glijbaan in een kleurpot die vers 1x TBST bevat. Wassen met verse 1x TBST voor 5 min 3x. Vermijd licht.
- Bereid kern vlek voor. Voeg 20 μL DAPI (voorraad DAPI-oplossing is 5 mg/mL in H2O) toe aan 200 ml 1x PBS en schud krachtig om de homogeniteit te waarborgen. Dompel dia's 5 minuten onder in DAPI-PBS-oplossing. Vermijd licht.
- Spoel de glijbanen in dH2O gedurende 3 min. Giet het water af en laat de glaasjes in de lucht drogen of het water van de glijbaan zachtjes aanzuigen, zodat de monsters niet worden gestoord tijdens het stofzuigen. Vermijd licht.
- Zorgvuldig afdekbare droge glijbanen met 100 μL anti-fade montage medium (inhoudstafel); Vermijd de vorming van luchtbellen op de glijbaan tijdens de montage stap. Bewaar de platen plat en laat het afdekmedium 's nachts op kamertemperatuur drogen in een lichtbestendige container. Nadat het afdekmedium droog is, worden de glijbanen plat in een lichtbestendige container in 4 °C bewaard tot ze klaar zijn om te bekijken.
Opmerking: Als er na de montage onaanvaardbare niveaus van luchtbellen aanwezig zijn, kan de gemonteerde glijbaan voorzichtig in 1x PBS worden geplaatst, de Afdeklijst kan worden verwijderd en zodra de dia opnieuw wordt gespoeld in water en opnieuw wordt gedroogd, kan deze opnieuw worden gemonteerd.
4. microscopie en beeldanalyse
Opmerking: Beeldvorming en analyse met behulp van een fluorescentie deconvolutie-Microscoop en bijbehorende software, uitgerust met 3 fluorescerende filters (om Alexa Fluor 488, 568 en 647 nm signalen te visualiseren), plus DAPI (419 nm) wordt gebruikt in dit experiment.
- Beeld de dia met een 10x vergroting om het hele blastema-gebied vast te leggen.
Opmerking: Proliferating osteoblast primaire antilichaam detectie maakt gebruik van secundaire antilichamen (Alexa Fluor 488 en 647) met niet-overlappende emissiespectra om onjuiste identificatie van co-gelabelde cellen te minimaliseren. Achtergrond aftrekken van het autofluorescerende signaal kan worden uitgevoerd met behulp van de 568 nm filter om de integriteit van de 488 of 647 signalen te garanderen. Blastema primaire antilichaam detectie maakt gebruik van secundaire antilichamen (Alexa Fluor 488 of 568). Achtergrond aftrekken van het autofluorescerende signaal kan worden uitgevoerd met het 568-filter bij gebruik van het 488-geconjugeerde antilichaam, en 488 filter gebruikt het 568-geconjugeerde antilichaam. Auto fluorescerende signaal wordt meestal geassocieerd met de nagel plaat en erytrocyten door het cijfer, en wordt waargenomen in de 488, 568, en 647 filters.
5. sequentiële in vivo microcomputer tomografie (μCT)
- Regenereren van cijfers van hetzelfde dier gescand op 1 dag voorafgaand aan amputatie (ongeamputeert), 1 DPA, en op verschillende tijdstippen totdat volledige regeneratie op 28 DPA met behulp van de vivaCT 40 (tabel van de materialen) wordt uitgevoerd in dit experiment en weergegeven in Afbeelding 3A.
- Maak het μCT met slangen om de zuurstoftoevoer naar en uit de μCT-dieren kamer te laten stromen, zodat de uitvloeiende zuurstof is uitgerust met een geactiveerde koolstoffilter om de Isofluraan te vangen.
Opmerking: Ervoor zorgen dat de dier kamer van μCT strak is ingesloten; op deze manier is een dierlijke neus-kegel niet nodig voor het leveren van Isofluraan aan de muis tijdens de scan. - De scanparameters van μCT voorbereiden. Cijfers worden gescand op een Voxel-grootte van 10,5 μm, bij 55 kVp, 145 uA met 1000 projecties per 180 ° met behulp van continue rotatie, en met een integratie tijd van 200 msec, resulterend in een maximum van 213 segmenten per scan. Scans uitgevoerd in dit experiment zijn ongeveer 9 minuten lang. Een verminderde elektrische stroom kan worden gecompenseerd met proportioneel toegenomen integratie tijd, maar zal resulteren in langere scantijden.
- Anesthetiseer de volwassen muis met behulp van isoflurane; aanvankelijk anesthetiseren bij 3% in een kamer, gevolgd door 1,5% Isofluraan geleverd aan de μct dier kamer gedurende de duur van de scan. Plaats de muis voorzichtig in de dieren kamer van μCT met de achterledematen die in nauwe associatie zijn gerangschikt, vlak, ventrale kant-omhoog met linkerpoot aan de linker-en rechterpoot aan de rechterkant op het Scan platform, gevolgd door het zachtjes vastzetten van de cijfers op zijn plaats met behulp van chirurgische Tape. Breng oftalmische zalf aan op de ogen om droogheid te voorkomen onder anesthesie.
- Keer de muis terug naar een schone kooi en bewaak de muis totdat deze wakker wordt. Doorgaan met het scannen van dezelfde muis op tweewekelijkse naar wekelijkse tijdpunten om te visualiseren van de gehele bot regeneratie reactie.
- Na het scannen, u maximaal enkele uren voor μCT image reconstructie optreden. Met behulp van de software die bij het μCT wordt geleverd, converteert u de bestanden naar een reeks DICOM-bestanden; elk DICOM-bestand komt overeen met één segment van de scan, dus als 213-segmenten zijn gescand, worden 213 DICOM-bestanden gegenereerd en geüpload naar de server van het bedrijf.
- Download de DICOM-serie in een enkele map met behulp van een batch file Downloader in een webbrowser.
- Download de BoneJ plugin23 en sleep het bestand naar de imagej plugin folder. Open in ImageJ de DICOM-bestands reeks als een stapel door de map naar de ImageJ-balk te slepen en neer te zetten. Een 16-bits afbeeldingsstapel waarin alle grijze waarden worden weergegeven, wordt geopend. Als u alleen bot wilt weergeven, voert u afbeelding drempelmethode (IkMage > > drempelaanpassen).
Opmerking: Bij het bekijken van ImageJ-bestanden komt de ImageJ-uitvoer overeen met een omgekeerde afbeelding van de cijfers; dat wil zeggen, cijfers gerangschikt in het Scan platform ventrale side-up, met linker poot aan de linkerkant van het platform en rechterpoot aan de rechterkant van het platform, zal verschijnen als rugvin kant-up, rechterpoot op de linker kant en linker poot aan de rechterkant van de imagej afbeelding stack. - Zodra het dialoogvenster drempel is geopend, schuift u de onderste balk, die overeenkomt met de bovenste drempel, naar de uiterste rechterkant en past u de bovenste balk aan, overeenkomend met de lagere drempel, totdat alleen de bone rood is gemarkeerd. De lagere drempelwaarde is ongeveer 10000 – 13000 met een maximale signaalintensiteit van 32.767. Klik op toepassenen klik in het dialoogvenster Nieuw op zwarte achtergrond. Klik op OK.
- Er wordt een 8-bits afbeelding met zwart-witwaarden gegenereerd, waarbij wit overeenkomt met het bot. Selecteer het P3-bot door er een rechthoek omheen te tekenen en dupliceer de stapel. Genereer een 3D-afbeelding (Plugins > 3D-viewer). Als u een onnodige Bone uit de afbeelding wilt bijsnijden, klikt u op het gereedschap selectie vrije hand en cirkelt u de bone die u wilt verwijderen. Klik met de rechtermuisknop en selecteer Vul selectie om bone te verwijderen.
Opmerking: De hierboven beschreven stappen zijn van toepassing op ImageJ 1.52 h, Java 8 en kunnen enigszins afwijken bij gebruik van een andere versie van ImageJ. Voor Thresholding raden we aan om een optimale waarde te bepalen en deze waarde consistent te gebruiken. - Kwantificeer het botvolume van de 3D-rendering met behulp van de plug-in BoneJ volume breuk (Plug-ins ≫ Bonej > volumefractie). Er verschijnt een resultaatvenster, en Bone volume (BV) wordt weergegeven in mm3.
- Kwantificeer de botlengte van de 3D-rendering met behulp van de ImageJ-tool voor meerdere punten.
Opmerking: Been lengte is dynamisch in de loop van de P3-regeneratie; de lengte daalt tussen 7-10 DPA geassocieerd met osteoclast-gemedieerde botdegradatie11, en wordt gevolgd door een periode van distale bothergroei tussen 14-28 DPA (Figuur 3b). De lengte wordt gemeten vanaf de centrale basis van de P2/P3-verbinding tot het verste punt van de mineralisatie op de Apex van het distale bot, maar omvat geen aangetast bot dat volledig losgemaakt is (Figuur 3b). BoneJ maakt de volledige 3D-beoordeling van de botarchitectuur mogelijk; Zo verandert de hoek waarin het bot wordt gescand niet de mogelijkheid om lengte te meten. - Leg een afbeelding van de 3D-rendering vast door op beeldte klikken en momentopname te maken. Afbeelding opslaan als TIF-of JPEG-bestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volwassen muis regenereert P3-cijfers bij 6/7 DPA(afbeelding 2a-D), 9 DPA(figuur 2e-H) en 10 DPA (figuur 2i-L) waren immunogekleurd met antilichamen tegen Runx2, OSX en pcna om intramembraneuze botten te visualiseren en immunobevlekt met antilichamen tegen CXCR4 en vWF om de vorming van blastema te visualiseren. Representatief μCT-weergave van de cijfers die zijn gescand vóór de amputatie en op verschillende tijdstippen tijdens de regeneratie (Figuur 3a, B) en de identificatie van de herkenningspunten die worden gebruikt om lengtemetingen te identificeren (Figuur 3b) zijn ook weergegeven.
Figuur 1: cijfer nummer en identificatie van volwassen muis distale P3 amputatie vlak. De volwassen muis rechter achterpoot wordt weergegeven met cijfers genummerd 1-5; de in deze studie uitgevoerde amputaties worden uitgevoerd op de cijfers 2 en 4 (a). Het distale P3-amputatie vlak wordt weergegeven (onderbroken lijn) op de cijfers 2 en 4 (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: vroege intramembraneuze ossificatie en blastema formatie in de regenereert volwassen muis P3-cijfer. Runx2 (groen) en PCNA (magenta) dubbele immunofluorescentie tonen aan dat prolifererende osteoprogenitors in eerste instantie zijn gelokaliseerd op de periosteelt en endosteal Bone oppervlakken op 6/7 DPA, en uit te breiden naar de distale blastema op 9 en 10 DPA (A, E, I). OSX (groen) en PCNA (magenta) dubbele immunofluorescentie vertonen weinig OSX-positieve osteoblasten en een brede proliferatie op 6/7 (B), en verbeterde OSX-immunokleuring, die in een DISTAAL begrensd door prolifererende cellen op 9 en 10 DPA (F, J). CXCR4 (rood) immunofluorescentie identificeert vroegtijdige vorming van blastema op 6/7 DPA (C), gevolgd door robuuste CXCR4-immuunkleuring in de 9 en 10 DPA regenererende cijfers (G, K). vWF (groen) immunokleuring identificeert intact vasculatuur in het merg van geampuleerde cijfers, en enkele positieve cellen geassocieerd met de avasculaire blastema (D, H, L). Monsters met DAPI. Dorsal is naar de top, distale is aan de rechterkant. BL = blastema, m = merg. Schaal staven = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: P3-botregeneratie gevisualiseerd door sequentieel in-vivo μCT scanning. Representatief μCT weergaven van één cijfer gescand voorafgaand aan amputatie (unamp), en op 1, 7, 10, 14, 21 en 28 DPA. μCT Scanning demonstreert de P3-regeneratie wordt gekenmerkt door een initiële respons van de bothistolyse, gevolgd door de vorming van boteilanden bij 14 DPA en robuuste botregeneratie op 21 en 28 DPA (A). Representatief μCT-weergaven van één cijfer gescand voorafgaand aan amputatie en op 1, 7, 10, 14, 21 en 28 DPA die de regio's illustreren waarin de cijfer lengte op elk moment wordt gemeten. B) groene stippen geven de totale gemeten lengte aan, terwijl de rode X de regio van uitgezet bot aanduidt die is uitgesloten van de lengtemeting. Afzonderlijke cijfer afbeeldingen die door ImageJ zijn gemaakt, kunnen worden bijgesneden om de cijfer grootte te standaardiseren, zodat afbeeldingen in deze afbeelding kunnen worden gemaakt. Distale is aan de rechterkant, rugvin is naar de top. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure van volwassen muis distale P3 amputatie, fluorescerende immunohistochemische kleuring om blastema vorming en intramembraneuze ossificatie te visualiseren en te onderzoeken, en sequentieel in-vivo μCT scanning om Identificeer botmorfologische, volume-en lengte wijzigingen na amputatie. P3-amputatie is een uniek, procedureel eenvoudig en reproduceerbaar model om een Pro-regeneratieve wondomgeving te analyseren die blastema-vorming activeert. Bovendien biedt het P3-cijferige model talrijke voordelen ten opzichte van traditionele botletsel modellen om intramembraneuze ossificatie te onderzoeken.
Om het succes van dit protocol te garanderen, moet volledige Digit-decalcificatie worden uitgevoerd. In het geval dat het cijfer niet volledig is gedecalcificeerd, zal het afbrokkelen en versnipperen tijdens het snijproces. Bovendien kan de Immunohistochemie van warmteafgifte problematisch zijn doordat de weefsels iets kunnen losmaken of volledig van de glijbaan worden losgekoppeld. Om dit probleem te verhelpen, moeten monsters worden gemonteerd op zelfklevende dia's met behulp van een waterbad aangevuld met een histologisch lijm middel, evenals het bakken van de droge glijbanen tot 65 °C vóór gebruik. Ten slotte zijn de muis cijfers relatief klein; om morfologie en kwantificeren van veranderingen in het botvolume en de lengte nauwkeurig te visualiseren, moet het μCT daarom voldoende resolutie hebben om te kunnen functioneren bij de juiste Scanparameters.
Een beperking van deze methode is dat niet alle primaire antilichamen compatibel zijn met weefsel fixatie en paraffine verwerking. In dit geval kan cryosectioning voor standaard bevroren weefsel worden uitgevoerd om de integriteit van het primaire antilichaam-antigeen11te waarborgen. Cryosnijden elimineert ook de noodzaak voor de decalcificatie stap, maar we hebben geconstateerd dat het cryosnijden van cijfers technisch uitdagender is dan het snijden van paraffine.
De hele blastema kan worden gevisualiseerd bij 10x vergroting door deconvolutie microscopie, en, met behulp van de juiste beeld kwantificerings software, kunnen de immunokleurings resultaten eenvoudig worden becijferd. Fluorescerende immunohistochemie indringende voor osteogenic markers van het regenererende cijfer biedt een uniek beeld van blastemal differentiatie via intramembraneuze ossificatie. Immunohistochemische kleuring onthult de P3-botregeneratie respons wordt gepolariseerd en resulteert in een georganiseerde proximale-tot-distale botvorming (Figuur 2). Bij latere regeneratie stadia zijn niet-proliferatieve osteoblasten afgeleid van de blastema gelokaliseerd grenzend aan de botstronk en worden ze door prolifererende osteoblasten in de DISTAAL grenzen begrensd. De prolifererende osteoblasten worden op hun beurt in een distale wijze begrensd door het prolifereren van ongedifferentieerde blastemal cellen. Fluorescerende immunohistochemie indringende voor de blastema marker CXCR4 identificeert vroege blastema cellen geassocieerd met het gewonde botoppervlak, gevolgd door verbeterde immunokleuring in latere regeneratie stadia (Figuur 2). De blastema is avasculaire13 en immunofluorescentie voor de endotheliale Celmarker vwf identificeert weinig positieve cellen in het blastema-gebied (Figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het Muneoka Lab en het Texas Institute for genomic Medicine (TIGM). Dit werk werd gesteund door Texas A & M University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A.
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
