Summary
Hier stellen wir ein Protokoll der erwachsenen Maus-Terminal-Phalanx-Amputation vor, um die Explosion von Säugetieren und die intramembranöse Ossifikation zu untersuchen, die durch fluoreszierende Immunhistochemie und sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie analysiert wird.
Abstract
Hier stellen wir ein Protokoll der distalen Terminalphalanx (P3) amputation für Erwachsene vor, ein verfahrenstechnisch einfaches und reproduzierbares Säugetiermodell der epimorphen Regeneration, das die Blastemabildung und die intramembranöse Ossifikation umfasst, die von Fluoreszenz-Immunhistochemie und sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie (CT). Die Regeneration der Säugetiere beschränkt sich auf Amputationen, die den distalen Bereich der Terminalphalanx (P3) transsektieren; Ziffern, die auf proximaleren Ebenen amputiert werden, können sich nicht regenerieren und werden fibrotisch geheilt und narbt gebildet. Die Regenerationsreaktion wird durch die Bildung eines proliferativen Blastema summiert, gefolgt von knochenregeneration durch intramembranöse Verknöcherung, um die amputierte Skelettlänge wiederherzustellen. P3-Amputation ist ein präklinisches Modell zur Untersuchung der epimorphen Regeneration bei Säugetieren und ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung therapeutischer Strategien, um fibrotische Heilung durch eine erfolgreiche regenerative Reaktion zu ersetzen. Unser Protokoll verwendet Fluoreszenz-Immunhistochemie, um 1) früh- und späte Blastemzellpopulationen zu identifizieren, 2) Revaskularisation im Zusammenhang mit der Regeneration zu untersuchen und 3) die intramembranöse Verknöcherung ohne komplexe Knochen zu untersuchen Stabilisierungsvorrichtungen. Wir zeigen auch die Verwendung von sequenziellem in vivo -CT, um hochauflösende Bilder zu erstellen, um morphologische Veränderungen nach der Amputation zu untersuchen sowie Volumen- und Längenänderungen in derselben Ziffer im Verlauf der Regeneration zu quantifizieren. Wir glauben, dass dieses Protokoll einen enormen Nutzen bietet, um sowohl epimorphe als auch geweberegenerierende Reaktionen bei Säugetieren zu untersuchen.
Introduction
Säugetiere, einschließlich Menschen und Mäuse, haben die Fähigkeit, die Spitzen ihrer Ziffern nach distaler Amputation der Terminalphalanx (P3)1,2,3zu regenerieren. Bei Mäusen ist die Regenerationsreaktion amputationsniveauabhängig; zunehmend proximale Ziffernamputationen zeigen eine zunehmend abgeschwächte regenerative Reaktion bis zum vollständigen regenerativen Versagen bei Amputationen, die sich überschneiden, und proximal zur P3-Nagelmatrix4,5,6 , 7 , 8. Die P3-Regeneration wird durch die Bildung eines Blastema vermittelt, definiert als eine Population von sich ausbreitenden Zellen, die einer Morphogenese unterzogen werden, um die amputierten Strukturen zu regenerieren9. Die Bildung eines Blastema zur Regeneration der durch Amputation verlorenen Strukturen, ein Prozess, der als epimorphe Regeneration bezeichnet wird, unterscheidet die Multi-Gewebe-Level-P3-Regenerationsreaktion von der traditionellen Gewebereparatur nach Verletzung6, 10. P3 Regeneration ist ein reproduzierbares und verfahrenstechnisch einfaches Modell zur Untersuchung komplexer regenerativer Prozesse einschließlich Wundheilung11,12, Knochenhistolyse11,12, Revaskularisation13, periphere Nervenregeneration14, und blastemale Umwandlung in Knochen über intramembranöse Ossifikation15.
Frühere Studien mit Immunhistochemie haben gezeigt, dass das Blastema heterogen, avaskulär, hypoxisch und hoch proliferativ11,13,15,16ist. Nach distaler P3-Amputation wird das frühe Blastema zunächst mit dem P3-Periost und Endosteum assoziiert und zeichnet sich durch eine robuste Proliferation und aufkeimende Osteogenese neben der Knochenoberfläche15aus. Nach Knochenabbau und Wundverschluss wird das heterogene Blastema durch die Verschmelzung von periostealen und endostealassoziierten Zellen gebildet, gefolgt von der Differenzierung von blastemalen Komponenten einschließlich Knochen durch intramembranöse Verknöcherung 15.
Knochenreparatur als Reaktion auf Verletzungen tritt typischerweise durch endochondrale Verknöcherung auf, d.h. über einen ersten knorpelförmigen Callus, der eine Vorlage für die nachfolgende Knochenbildung bildet17,18. Die intramembranöse Verknöcherung des langen Knochens, d.h. die Knochenbildung ohne knorpelförmiges Zwischenprodukt, wird häufig mit komplexen Ablenkungsvorrichtungen oder chirurgischer Fixierunginduziert 19,20. Das Ziffernregenerationsverhalten ist ein präklinisches Modell, das Vorteile gegenüber herkömmlichen intramembranösen Verknöcherungsmodellen bietet: 1) es erfordert keine externe oder interne Fixierung nach verletzungen, um die intramembranöse Ossifikation zu stimulieren, 2) mit 4 Ziffern von jedem Tier durchgeführt, wodurch Proben bei gleichzeitiger Minimierung des Einsatzes von Tieren maximiert werden, und 3) sequentielle In-vivo-Mikrocomputertomographie-Analysen (CT) können mit Leichtigkeit und Geschwindigkeit durchgeführt werden.
In der vorliegenden Studie zeigen wir die standardisierte P3-Amputationsebene, um eine reproduzierbare und robuste Regenerationsreaktion zu erreichen. Zusätzlich zeigen wir ein optimiertes Fluoreszenz-Immunhistochemieprotokoll mit Paraffinabschnitten zur Visualisierung der Blastemabildung, Revaskularisation im Kontext der Regeneration und blastemalen Umwandlung in Knochen über intramembranöse Ossifikation. Wir zeigen auch die Verwendung von sequenziellem In-vivo-CT, um Veränderungen in der Knochenmorphologie, Volumen und Länge in der gleichen Ziffer im Laufe der Regeneration zu identifizieren. Ziel dieses Protokolls ist es, die Explosion bildung von Säugetieren nach der Amputation zu untersuchen und zwei Techniken, die Fluoreszenzimmunhistochemie und die sequenzielle in vivo-CT, zur Untersuchung der intramembranösen Knochenregeneration zu demonstrieren.
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Protocol
Alle Tieranwendungen und -techniken entsprachen den Standardverfahren des Institutional Animal Care and Use Committee der Texas A&M University.
1. Erwachsene Maus Hind Limb Distal P3 Amputation
- Anästhetisieren Sie eine 8 bis 12 Wochen alte CD-1-Maus (Materialtabelle) mit Isoflurangas in Sauerstoff; zunächst bei 3% in einer Kammer anästhesieren, gefolgt von 2% Isofluran, das von einem Nosecon über die Dauer der Operation geliefert wird. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Anästhesie zu verhindern.
HINWEIS: Die in unserem Labor standardisierten P3-Amputationsstudien für Erwachsene werden an 8 bis 12 Wochen alten Mäusen durchgeführt, und die Regenerationsreaktion wird in allen getesteten Stämmen konserviert. - Unter einem 10-fachen Seziermikroskop sterilisieren Sie die Stellen der Hinterbeinen mit chirurgischem Povidone-Jod und 70% Ethanol. Schneiden Sie das Haar mit einer Mikroschere von der chirurgischen Stelle weg. Tragen Sie 1 L topisches Bupivacaine lokal auf, um die chirurgische Stelle zu anästhesieren.
- Amputieren Sie die distale Spitze der Terminalphalanx (P3) auf den Ziffern 2 und 4 jeder Hintergliedmaße mit einem sterilen #10 Skalpell (Abbildung 1A). Die Amputation muss unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, einschließlich der Sterilisation chirurgischer Instrumente. Unter dem Seziermikroskop die Hinterpfote vorsichtig abspielen, um die mediale Zifferoberfläche freizulegen. Halten Sie das Skalpell in einem Winkel parallel zum Fatpad, um die in Abbildung 1Bdargestellte Amputation durchzuführen. Tragen Sie 1 L topisches Bupivacaine auf die Amputationsstelle auf.
HINWEIS: Die Amputation transektiert das Nagelorgan, die Dermis, den P3-Knochen, die Gefäße und die Nerven, überschneidet aber nicht die Markhöhle oder das Ziffernfettpad. Wenn Blutungen beobachtet werden, wenden Sie direkten Druck mit einem sterilen Baumwollspitzenapplikator an. - Die Standard-Distalamputationsebene P3 entfernt etwa 15%–20% des P3-Knochenvolumens21. MicroCT-Scans (siehe unten) können durchgeführt werden, um die korrekte Amputationslänge zu bestätigen.
- Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig zurück und lassen Sie die Wunde ohne Wundverband heilen. Überwachen Sie die Maus 3 Tage lang, um sicherzustellen, dass die Maus zur normalen Aktivität zurückkehrt.
2. Digit Collection und Gewebevorbereitung
- Euthanisieren Sie die Maus mit Kohlendioxid (CO2) in einer geschlossenen Kammer, gefolgt von Zervixdislokation.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um die Ziffer auf halbem Weg durch das benachbarte Knochensegment, den mittleren Phalanx (P2) Knochen, bei ungefähr dem zweiten ventralen Fettpolstereinzug zu trennen. Übertragen Sie die Ziffer(en) auf eine 20 ml Szintillationsdurchstechsons mit 10 ml frisch gepuffertem Zinkformalin fixativ, einer 18% Formaldehydlösung (siehe Materialtabelle). Das Fixierungsvolumen sollte mindestens das 20-fache des Vorhandenen Gewebevolumens betragen.
HINWEIS: Ziffern werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Amputation gesammelt, um die vollständige Regenerationsreaktion zu untersuchen. Im Allgemeinen sind die Sammelzeitpunkte bei früher Blastemabildung, Knochenhistolyse und Wundverschluss 4–8 Tage nach der Amputation (DPA). Um das frühe osteogene Blastema zu untersuchen, sind die Sammelzeitpunkte 9 und 10 DPA, und um die weitere Knochenregeneration und -mineralisierung zu visualisieren, sind die Sammelzeitpunkte 14, 21 und 28 DPA. Auch unamputierte Ziffern werden gesammelt. - Befestigen Sie die Ziffer für 24–48 h bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf einem Shaker.
- Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Ziffer 2x für 5 min in 5 ml 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) bei Raumtemperatur.
- 10 ml frischer Decalcifier I (siehe Materialtabelle), eine 10% Ameisensäurelösung, in die Szintillationsdurchstechflasche geben und bei Raumtemperatur vorsichtig auf einem Shaker für 2 h mischen. Nach 2 h Decalcifier I durch frische Lösung ersetzen und Ziffer über Nacht bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf Shaker entkalken.
- Entfernen Sie den Decalcifier I und waschen Sie die Ziffer 2x für 5 min in 5 ml 1x PBS bei Raumtemperatur.
-
Verarbeiten Sie die Ziffer durch eine abgestufte Ethanolserie. Dieser Prozess kann manuell in einer 20 ml Szintillationsdurchstechflasche durchgeführt werden, wobei 10 ml jeder Flüssigkeit verwendet werden, wenn weniger als 40 Ziffern.
- Beginnen Sie mit 2 Eintauchen in frisches 70% Ethanol bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf einem Shaker, je 1 h, gefolgt von 2 Eintauchen in frisches 95% Ethanol bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf einem Shaker, je 1 h.
- Vervollständigen Sie die Ziffernaustrocknung mit 2 Waschungen von frischem 100% Ethanol bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf einem Shaker, jeweils 1 h. Die letzte 100% Ethanolwäsche kann über Nacht verlassen werden.
- In der gleichen Szintillationsdurchstechflasche das 100% Ethanol durch 10 ml frische Xylole ersetzen und die Durchstechflasche in eine chemische Rauchhaube für 1,5 h bei Raumtemperatur legen. Mit einer frischen Wäsche von Xylolen in einer chemischen Dunstabzugshaube für 1,5 h bei Raumtemperatur für insgesamt 2 Waschungen wiederholen.
- Ersetzen Sie die Xylole durch flüssiges Paraffinwachs, das auf 68 °C geschmolzen ist, und legen Sie die Durchstechflasche in einen Inkubator bei 68 °C für 2 h, 2 mal. Nach 4 insgesamt h Eintauchen in Paraffinwachs, betten Sie die Ziffer für Paraffin-Sektion.
HINWEIS: Die Digit-Verarbeitung für die Histologie kann in einem automatisierten Prozessor nach denselben Richtlinien durchgeführt werden. - Schnittziffern mit einer Dicke von 4 bis 5 m mit einem Mikrotom. Legen Sie schnittige Proben auf Klebeschlitten, indem Sie ein 38–41 °C Wasserbad verwenden, das durch eine histologische Klebstofflösung ergänzt wird, um sicherzustellen, dass die Proben am Schlitten haften. Schieben Sie die Dias auf einen 37 °C-Schiebewärmer, um es zu trocknen.
3. Immunhistochemische Färbung von erwachsenen Mausziffern zur Untersuchung der Blastema-Bildung und der intramembranösen Ossifikation
- Wärmegeschnittene Dias bei 65 °C für 45 min, gefolgt von einer Erwärmung bei 37 °C für nicht weniger als 15 min, um sicherzustellen, dass die Proben am Schlitten haften.
- Deparaffinieren und rehydrieren Sie Dias 2x mit 5 min Xylolen, einer abgestuften Ethanolserie, und Untertauchen in Wasser. Legen Sie Dias in ein 50–100 ml Großes Färbeglasglas und halten Sie sich in 1x Tris Buffered Saline mit Tween 20 (TBST) auf.
HINWEIS: Lassen Sie die Proben während des gesamten Färbevorgangs nicht trocknen. Bei jedem TBST-Schritt können Dias bis zu 2 h inkubiert werden. - Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer vor. Eine 1-Zoll tief bedeckte Kunststoff-Diabox mit befeuchteten Tissuepapier an der Basis ist ausreichend.
- Bereiten Sie die Wärmeabruflösung für Runx2, Osterix (OSX) und Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) vor. Für die Antigen-Retrieval des frühen Osteoprogenitor-Markers Runx2, bereiten Sie eine 1x Lösung von Tris-EDTA, pH 8 vor. Für den Osteoblastenmarker OSX eine 1x Lösung des Citratpuffers, pH 6, vorbereiten. PCNA-Immunostainierung kann in beiden Lösungen durchgeführt werden.
- Bereiten Sie die Proteinase-K-Antigen-Retrievallösung für den Blastema-Marker CXCR422 und den Endothelzellmarker von Willebrand Factor 8 (vWF) vor, indem Sie 100 l Proteinase-K-Lösung pro Schlitten in ein Mikrozentrifugenrohr legen und auf 37 °C erhitzen (ungefähr 5 Min.).
HINWEIS: Der Antigenabruf für Runx2, OSX und PCNA erfolgt über Denheat-Retrieval und CXCR4- und vWF-Antigenabruf wird über die Proteinase-K-Behandlung durchgeführt. - Für die Wärmeabrufung von Antikörpern, die Wärme benötigen, gleitet in ein Färbeglas in die entsprechende Antigen-Retrieval-Lösung. Die Wärme gleitet 25 min auf 95 °C, so dass kein Kochen entsteht. Entfernen Sie das Färbeglas von der Wärmequelle und lassen Sie es bei Raumtemperatur 35 min abkühlen.
- Für Proteinase K Antigen-Retrieval, legen Sie Flachrutschen in der Befeuchtungskammer, und legen Sie 100 l vorgewärmte Proteinase K auf der Rutsche. Bedecken Sie die Dias mit einem kleinen Streifen Parafilm, um sicherzustellen, dass die Dias nicht trocken werden. Inkubieren Sie Dias für 12 min bei 37 °C.
- Waschen Sie Dias 3 mal für 5 min in 1x TBST in Färbeglas nach Antigen-Retrieval.
- Entfernen Sie die Dias aus dem Färbeglas und legen Sie sie in die Befeuchtungskammer. Legen Sie 6–7 Tropfen Blockierlösung (Tabelle der Materialien) auf die Folie und bedecken Sie das Dia mit frischem Paraffinfilm, um sicherzustellen, dass die Folie nicht trocken wird. Inkubieren Sie Dias für 1 h bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie die primären Antikörper vor, indem Sie die Antikörper in Antikörperverdünnungsmittel verdünnen (Materialtabelle). Wirbel jede primäre Antikörperlösung für 3 s. Primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsarten können kombiniert werden.
HINWEIS: Immunhistochemische Färbung für Runx2 (Kaninchen-Anti-Runx2-Antikörper, 1:250 Verdünnung, bei einer Endkonzentration von 4 g/ml) in Kombination mit PCNA (monoklonaler Maus-Anti-PCNA-Antikörper, 1:2.000 Verdünnung, bei einer Endkonzentration von 0,5 g/ml) und OSX (Kaninchen-Anti-OSX Antikörper, 1:400 Verdünnung, bei einer Endkonzentration von 0,125 g/ml) in Kombination mit PCNA ist in Abbildung 2dargestellt. Der in dieser Studie verwendete Maus-Anti-PCNA-Antikörper ist sehr spezifisch und erfordert keine zusätzlichen Blockierungsschritte, die über die in diesem Protokoll beschriebenen hinausgehen. Immunohistochemische Färbung mit CXCR4 (Rattenanti-CXCR4-Antikörper, 1:500 Verdünnung bei einer Endkonzentration von 2 g/ml) und vWF (Kaninchen antihumaner vWF VIII-Antikörper, 1:800 Verdünnung, bei einer Endkonzentration von 41,25 g/ml) ist in Abbildung 2dargestellt. Primäre Antikörper wurden von unserem Labor unter den Bedingungen in diesem Protokoll optimiert und getestet und sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. - Entfernen Sie den Paraffinfilm vorsichtig, und lassen Sie den Schlitten vorsichtig auf Tissuepapier ab, um eine überschüssige Blockierlösung zu entfernen. Legen Sie 100–200 L primärer Antikörperlösung auf das Dia, ersetzen Sie die Parafilmabdeckung und kehren Sie in die Befeuchtungskammer zurück. Die Dias in der geschlossenen Befeuchtungskammer über Nacht bei 4 °C inkubieren.
HINWEIS: Lassen Sie die Dias nicht trocken werden, während Sie die Blockierlösung entleeren. Dieser Schritt wird schnell ausgeführt. - Entfernen Sie den Parafilm vorsichtig, und entleeren Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig vom Dia. Legen Sie die Folie in ein Färbeglasmitenglas mit frischem 1X TBST. Waschen Sie mit frischen 1x TBST für 5 min 3 mal.
- Bereiten Sie die sekundären Antikörper durch Kombination mit Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle). Vortex die sekundäre Antikörperlösung für 3 s. Sekundäre Antikörper, die mit verschiedenen Fluorophoren aus verschiedenen Arten konjugiert sind, können kombiniert werden.
HINWEIS: Fluoreszierende Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Alexa Fluor 488-konjugierte Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) für Runx2, OSX und vWF, Alexa Fluor 568-konjugierte Ziege Anti-Ratten-IgG (H+L) für CXCR4, und Alexa Fluor 647-konjugierte Ziege Anti-Maus IgG (H+L) für PCNA, verdünnt bei 1:500 mit einer Endkonzentration von 4 g/ml , wurden in Abbildung 2verwendet. - 200 L Sekundärantikörperlösung auf das Dia legen, mit frischem Paraffinfilm abdecken und in die Befeuchtungskammer zurückkehren. Inkubieren Sie die Dias in der geschlossenen Befeuchtungskammer für 45 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Befeuchtungskammer geschlossen ist, um Licht zu vermeiden.
- Entfernen Sie den Paraffinfilm vorsichtig und entleeren Sie die sekundäre Antikörperlösung vorsichtig vom Dia. Legen Sie die Rutsche in ein Färbeglasmitenglas mit frischem 1x TBST. Mit frischem 1x TBST für 5 min 3x waschen. Vermeiden Sie Licht.
- Bereiten Sie nukleare Flecken vor. Fügen Sie 20 l DAPI (Lager-DAPI-Lösung beträgt5 mg/ml in H2 O) zu 200 ml 1x PBS und schütteln Sie kräftig, um Homogenität zu gewährleisten. Tauchen Sie Folien für 5 min in DAPI-PBS Lösung ein. Vermeiden Sie Licht.
- Waschen Sie Dias in dH2O für 3 min. Dekantieren Sie das Wasser und lassen Sie die Dias das Wasser aus der Rutsche lufttrocknen oder sanft ansaugen, so dass die Proben beim Staubsaugen nicht gestört werden. Vermeiden Sie Licht.
- Sorgfältig eisfeste Trockenschlitten mit 100 l Anti-Fade-Montagemedium(Materialtabelle); vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen auf dem Schlitten während des Montageschritts. Bewahren Sie die Dias flach auf und lassen Sie das Montagemedium bei Raumtemperatur über Nacht in einem lichtdichten Behälter trocknen. Nachdem das Montagemedium trocken ist, gleitet flach in einem lichtdichten Behälter in 4 °C, bis es sichtbar ist.
HINWEIS: Wenn nach der Montage unannehmbare Luftblasenvorhanden sind, kann der montierte Schlitten schonend in 1x PBS platziert werden, der Deckelrutsch kann entfernt werden, und sobald der Schlitten wieder in Wasser gespült und wieder getrocknet wird, kann wieder montiert werden.
4. Mikroskopie und Bildanalyse
HINWEIS: In diesem Experiment wird die Bildgebung und Analyse mit einem Fluoreszenz-Dekonvolution-Mikroskop und zugehöriger Software, ausgestattet mit 3 Fluoreszenzfiltern (zur Visualisierung von Alexa Fluor 488-, 568- und 647 nm-Signalen) sowie DAPI (419 nm) verwendet.
- Stellen Sie die Folie mit der 10-fachen Vergrößerung vor, um die gesamte Blastema-Region einzufangen.
HINWEIS: Die proliferierende Osteoblast-Primärantikörperdetektion nutzt sekundäre Antikörper (Alexa Fluor 488 und 647) mit nicht überlappenden Emissionsspektren, um eine falsche Identifizierung von ko-markierten Zellen zu minimieren. Hintergrundsubtraktion des autofluoreszierenden Signals kann mit dem 568 nm Filter durchgeführt werden, um die Integrität der 488 oder 647 Signale zu gewährleisten. Blastema Primärantikörper-Erkennung nutzt sekundäre Antikörper (Alexa Fluor 488 oder 568). Hintergrundsubtraktion des autofluoreszierenden Signals kann mit dem 568-Filter durchgeführt werden, wenn der 488-konjugierte Antikörper verwendet wird, und 488 Filter verwendet den 568-konjugierten Antikörper. Autofluoreszierendes Signal wird in der Regel mit der Nagelplatte und Erythrozyten in der gesamten Ziffer assoziiert und wird in den Filtern 488, 568 und 647 beobachtet.
5. Sequenzielle In-Vivo-Mikrotomographie
- Regenerierende Ziffern desselben Tieres, das 1 Tag vor der Amputation (unputiert), 1 DPA und zu verschiedenen Zeitpunkten bis zur vollständigen Regeneration bei 28 DPA mit dem vivaCT 40 (Materialtabelle) gescannt wurde, werden in diesem Experiment durchgeführt und in Abbildung 3A.
- Rüsten Sie den CT mit Schläuchen aus, um den Sauerstofffluss in und aus der Tierkammer zu ermöglichen, um sicherzustellen, dass der ausströmende Sauerstoff mit einem Aktivkohlefilter ausgestattet ist, um das Isofluran einzufangen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tierkammer des 'CT fest eingeschlossen ist; auf diese Weise ist kein tierischer Nasenkegel für die Versorgung der Maus während des Scans erforderlich. - Bereiten Sie die Scanparameter von 'CT vor. Die Ziffern werden bei einer Voxelgröße von 10,5 m, bei 55 kVp, 145 uA mit 1000 Projektionen pro 180° in kontinuierlicher Rotation und mit einer Integrationszeit von 200 msec gescannt, was zu maximal 213 Slices pro Scan führt. Die in diesem Experiment durchgeführten Scans sind ca. 9 min lang. Ein verringerter elektrischer Strom kann durch proportional erhöhte Integrationszeit kompensiert werden, führt aber zu längeren Scanzeiten.
- Anästhesisieren Sie die erwachsene Maus mit Isofluran; zunächst bei 3% in einer Kammer anästhesieren, gefolgt von 1,5% Isofluran, das der Tierkammer des 'CT während der Dauer des Scans zugeführt wird. Legen Sie die Maus vorsichtig in die Tierkammer des 'CT mit den in enger Verbindung angeordneten Hinterglieds, flach, ventrale Seite-up mit linker Pfote auf der linken Seite und rechter Pfote auf der rechten Seite auf der Scanplattform, gefolgt von der sanften Sicherung der An-Ort-Ziffern mit chirurgischer band. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Anästhesie zu verhindern.
- Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig zurück und überwachen Sie die Maus, bis sie wach ist. Fahren Sie mit dem Scannen derselben Maus an zweiwöchentlichen bis wöchentlichen Zeitpunkten fort, um die gesamte Reaktion auf die Knochenregeneration zu visualisieren.
- Lassen Sie nach dem Scannen bis zu mehreren Stunden Zeit, um die Bildrekonstruktion von CT zu ermöglichen. Konvertieren Sie die Dateien mithilfe der Software, die mit dem CT geliefert wird, in eine Reihe von Dicom-Dateien; Jede dicom-Datei entspricht einem Slice des Scans, daher werden, wenn 213 Slices gescannt wurden, 213 dicom-Dateien generiert und auf den Server des Unternehmens hochgeladen.
- Laden Sie die dicom-Serie in einem einzigen Ordner mit einem Batchdatei-Downloader in einem Webbrowser herunter.
- Laden Sie das BoneJ Plugin23 herunter und ziehen Sie die Datei in den ImageJ-Plugin-Ordner. Öffnen Sie in ImageJ die dicom-Dateiserie als Stapel, indem Sie den Ordner in die ImageJ-Leiste ziehen und ablegen. Ein 16-Bit-Bildstapel, der alle Grauwerte anzeigt, wird geöffnet. Um nur Bone anzuzeigen, führen Sie bildbeschfeinige Schwellenwerte (Image > Anpassen > Schwellenwert) durch.
HINWEIS: Beim Anzeigen von ImageJ-Dateien entspricht die ImageJ-Ausgabe einem umgekehrten Bild der Ziffern. d.h. Ziffern, die in der Scanplattform ventral side-up angeordnet sind, mit linker Pfote auf der linken Seite der Plattform und rechter Pfote auf der rechten Seite der Plattform, erscheinen als dorsale Side-up, rechte Pfote auf der linken Seite und linke Pfote auf der rechten Seite des ImageJ-Bildstapels. - Nachdem das Dialogfeld "Schwellenwert" geöffnet wurde, schieben Sie die untere Leiste, die der oberen Schwelle entspricht, nach ganz rechts, und passen Sie die obere Leiste, die dem unteren Schwellenwert entspricht, so lange an, bis nur der Knochen rot hervorgehoben ist. Der untere Schwellenwert wird bei einer maximalen Signalintensität von 32.767 etwa 10.000 bis 13.000 betragen. Klicken Sie auf Anwenden, und klicken Sie im neuen Dialogfeld auf schwarzen Hintergrund. Klicken Sie auf OK.
- Es wird ein 8-Bit-Bild mit Schwarzweißwerten erzeugt, wobei Weiß dem Knochen entspricht. Wählen Sie den P3-Bone aus, indem Sie ein Rechteck um ihn zeichnen, und duplizieren Sie den Stapel. Generieren Sie ein 3D-Bild (Plugins > 3D Viewer). Um unnötige Bone aus dem Bild zuzuschneiden, klicken Sie auf das Freihandauswahlwerkzeug, und kreisen Sie den zu löschenden Bone ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Auswahl ausfüllen aus, um den Bone zu löschen.
HINWEIS: Die oben beschriebenen Schritte gelten für ImageJ 1.52h, Java 8 und können bei Verwendung einer anderen Version von ImageJ leicht abweichen. Für die Schwellenentwicklung empfehlen wir die Ermittlung eines optimalen Wertes und die konsequente Verwendung dieses Wertes. - Quantifizieren Sie das Bone-Volume aus dem 3D-Rendering mithilfe des BoneJ Volume Fraction Plugins (Plugins > BoneJ > Volume Fraction). Ein Ergebnisfenster wird angezeigt, und das Knochenvolumen (BV) wird in mm3angezeigt.
- Quantifizieren Sie die Knochenlänge aus dem 3D-Rendering mithilfe des ImageJ-Multipoint-Werkzeugs.
HINWEIS: Die Knochenlänge ist im Laufe der P3-Regeneration dynamisch; die Länge nimmt zwischen 7-10 DPA im Zusammenhang mit Osteoklast-vermittelten Knochenabbau11, und wird von einer Periode der distalen Knochen nachwachsen zwischen 14-28 DPA (Abbildung 3B) gefolgt. Die Länge wird von der zentralen Basis des P2/P3-Gelenks bis zum entferntesten Mineralisierungspunkt an der distalen Knochenspitze gemessen, schließt jedoch keinen abgebauten Knochen ein, der vollständig abgetrennt wurde (Abbildung 3B). BoneJ ermöglicht die vollständige 3D-Bewertung der Knochenarchitektur; Der Winkel, in dem der Knochen gescannt wird, ändert somit nichts an der Fähigkeit, die Länge zu messen. - Erfassen Sie ein Bild des 3D-Renderings, indem Sie auf Ansichtklicken, und erstellen Sie einen Snapshot. Speichern Sie das Bild als tif- oder JPEG-Datei.
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Representative Results
Adult mouse regenerating P3 digits at 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Abbildung 2E-H) und 10 DPA (Abbildung 2I-L) wurden mit Antikörpern gegen Runx2, OSX und PCNA immunstainiert, um intramembranöse Knochen zu visualisieren und immunstainiert mit Antikörpern gegen CXCR4 und vWF, um die Blastemabildung zu visualisieren. Repräsentative 'CT-Renderings von Ziffern, die vor der Amputation und zu verschiedenen Zeitpunkten im Laufe der Regenerierung gescannt wurden (Abbildung 3A,B) und die Identifizierung der Landmarken, die zur Identifizierung von Längenmessungen verwendet werden (Abbildung 3B) sind auch angezeigt.
Abbildung 1: Ziffernnummer und Identifizierung der distalen P3-Amputationsebene der erwachsenen Maus. Die erwachsene Maus rechte Hinterpfote wird mit Ziffern mit der Nummer 1-5 angezeigt; Amputationen, die in dieser Studie durchgeführt werden, werden auf den Ziffern 2 und 4 (A) durchgeführt. Die distale P3-Amputationsebene wird (gestrichelte Linie) auf den Ziffern 2 und 4 (B )angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Frühe intramembranöse Verknöcherung und Blastemabildung in der regenerierenden Erwachsenenmaus P3-Ziffer. Runx2 (grün) und PCNA (Magenta) Doppelimmunfluoreszenz zeigen, dass sich vermehrende Osteoprogeneitoren zunächst auf die periostealen und endostealen Knochenoberflächen bei 6/7 DPA lokalisiert werden und sich auf das distale Blastema bei 9 und 10 DPA(A, E,I) ausdehnen. OSX (grün) und PCNA (Magenta) Doppelimmunfluoreszenz zeigen nur wenige OSX-positive Osteoblasten und breite Proliferation bei 6/7 (B), und verbesserte OSX-Immunostainierung distally begrenzt durch proliferierende Zellen bei 9 und 10 DPA (F, J). CXCR4 (rot) Immunfluoreszenz identifiziert frühe Blastema-Bildung bei 6/7 DPA (C), gefolgt von robuster CXCR4-Immunostainierung in den 9 und 10 DPA regenerierenden Ziffern (G, K). vWF (grün) Immunostainierung identifiziert intakte Vaskulatur im Mark von amputierten Ziffern, und wenige positive Zellen mit dem avaskulären Blastema assoziiert (D, H, L). Mit DAPI kontrastainierte Proben. Dorsal ist nach oben, distal ist nach rechts. Bl = blastema, m = Mark. Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: P3-Knochenregeneration durch sequenzielles In-vivo-CT-Scannen visualisiert. Repräsentative CT-Renderings einer Ziffer, die vor der Amputation (Unamp) gescannt wurden, und bei 1, 7, 10, 14, 21 und 28 DPA. Das Scannen von CT zeigt, dass die P3-Regeneration durch eine anfängliche Knochenhistolysereaktion gekennzeichnet ist, gefolgt von der Knocheninselbildung bei 14 DPA und einer robusten Knochenregeneration bei 21 und 28 DPA (A). Repräsentative CT-Renderings einer Ziffer, die vor der Amputation gescannt wurden, und bei 1, 7, 10, 14, 21 und 28 DPA, die die Bereiche veranschaulichen, in denen die Ziffernlänge zu jedem Zeitpunkt gemessen wird. (B) Grüne Punkte geben die gemessene Gesamtlänge an, während das rote X den Bereich des ausgestoßenen Knochens angibt, der von der Längenmessung ausgeschlossen ist. Einzelne Ziffernbilder, die von ImageJ erstellt wurden, können zugeschnitten werden, um die Zifferngröße zu standardisieren, um die Erstellung von Bildern in dieser Abbildung zu ermöglichen. Distal ist auf der rechten Seite, dorsal ist nach oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein standardisiertes Verfahren der distalen P3-Amputation von Erwachsenenmäusen, fluoreszierende immunhistochemische Färbung zur Visualisierung und Untersuchung der Blastembildung und intramembranösen Verknöcherung sowie Knochenmorphologie, Volumen und Längenänderungen nach der Amputation zu identifizieren. P3-Amputation ist ein einzigartiges, prozedural einfaches und reproduzierbares Modell zur Analyse einer pro-regenerativen Wundumgebung, die die Blastemabildung auslöst. Darüber hinaus bietet das P3-stellige Modell zahlreiche Vorteile gegenüber herkömmlichen Knochenverletzungsmodellen zur Untersuchung der intramembranösen Verknöcherung.
Um den Erfolg dieses Protokolls zu gewährleisten, muss eine vollständige Ziffernentkalkung durchgeführt werden. Für den Fall, dass die Ziffer nicht vollständig entkalkt ist, wird sie während des Schnittvorgangs zerbröckelt und zerkleinert. Darüber hinaus kann die Wärmerückgewinnungsimmunhistochemie insofern problematisch sein, als sich das Gewebe leicht lösen oder sich vollständig von der Rutsche lösen kann. Um dieses Problem zu lindern, sollten Proben auf Klebeschlitten mit einem Wasserbad montiert werden, das mit einem histologischen Klebstoff ergänzt wird, sowie die Trockenschlitten vor der Verwendung auf 65 °C backen. Schließlich sind die Mausziffern relativ klein; Um die Morphologie genau zu visualisieren und Veränderungen des Knochenvolumens und der Knochenlänge zu quantifizieren, muss der CT daher eine ausreichende Auflösung aufweisen, um an den entsprechenden Scanparametern zu funktionieren.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass nicht alle primären Antikörper mit Gewebefixierung und Paraffinverarbeitung kompatibel sind. In diesem Fall kann standardgefrorene Gewebekryosektion durchgeführt werden, um die Integrität des primären Antikörperantinen11zu gewährleisten. Kryosektionen eliminieren auch die Notwendigkeit für den Entkalkungsschritt, aber wir haben festgestellt, dass das Kryosektionen von Ziffern technisch schwieriger ist als Paraffinschnitte.
Das gesamte Blastema kann mit 10-facher Vergrößerung durch Dekonvolutionmikroskopie visualisiert werden, und mit der entsprechenden Bildquantifizierungssoftware können die immunstainierenden Ergebnisse leicht quantifiziert werden. Die fluoreszierende Immunhistochemie, die nach osteogenen Markern der regenerierenden Ziffer sucht, bietet einen einzigartigen Blick auf die blastemale Differenzierung durch intramembranöse Verknöcherung. Immunhistochemische Färbung zeigt, dass die P3 Knochenregenerationsreaktion polarisiert ist und zu einer organisierten proximalen bis distalen Knochenbildung führt (Abbildung 2). In späteren Regenerationsstadien werden nicht-proliferative Osteoblasten, die aus dem Blastema abgeleitet werden, neben dem Knochenstumpf lokalisiert und durch sich vermehrende Osteoblasten distal begrenzt. Die wuerstenden Osteoblasten wiederum werden durch sich ausbreitende undifferenzierte Blastemalzellen distär begrenzt. Fluoreszierende Immunhistochemie, die für den Blastema-Marker CXCR4 untersucht, identifiziert frühe Blastemazellen, die mit der verletzten Knochenoberfläche assoziiert sind, gefolgt von einer verbesserten Immunfärbung in späteren Regenerationsstadien (Abbildung 2). Das Blastema ist avaskulär13 und Immunfluoreszenz für den Endothelzellmarker vWF identifiziert nur wenige positive Zellen innerhalb der Blastema-Region (Abbildung 2).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Mitgliedern des Muneoka Lab und des Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Diese Arbeit wurde von der Texas A&M University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
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