Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Amputation og regenerering af voksent muse ciffer: en simpel model til undersøgelse af dannelsen af pattedyrs blastema og Intramembranøs ossifikation

Published: July 12, 2019 doi: 10.3791/59749
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Veterinary Integrative Biosciences, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 3Department of Neurosurgery, University of Mississippi Medical Center

Summary

Her præsenterer vi en protokol af voksne mus Terminal falanks amputation at undersøge pattedyrs tema dannelse og Intramembranous ossifikation, analyseret af fluorescerende Immunhistokemi og sekventiel in vivo mikrocomputer tomografi.

Abstract

Her præsenterer vi en protokol af voksne mus distale Terminal falanks (P3) amputation, en proceduremæssigt enkel og reproducerbar pattedyrs model af epimorphic regenerering, som involverer tema dannelse og Intramembranous ossifikation analyseret af Fluorescens Immunhistokemi og sekventiel in vivo-mikrocomputer tomografi (μCT). Regenerering af pattedyr er begrænset til amputationer, der transektere den distale region af terminalen falanks (P3); cifre amputeret på mere proksimale niveauer undlader at regenerere og gennemgå fibrotisk helbredelse og ardannelse. Regenererings reaktionen medieres ved dannelsen af en proliferativ blastema, efterfulgt af knogle regenerering via intramembranøs ossifikation for at genoprette den amputerede skelet længde. P3 amputation er en præklinisk model til at undersøge epimorphic regenerering i pattedyr, og er et effektivt værktøj til design af terapeutiske strategier til at erstatte fibrotisk helbredelse med en vellykket regenerativ respons. Vores protokol bruger fluorescens Immunhistokemi til 1) identificere tidlige-og-sene tema cellepopulationer, 2) undersøgelse revaskularisering i forbindelse med regenerering, og 3) undersøge Intramembranous ossifikation uden behov for komplekse knogle stabiliseringsanordninger. Vi viser også brugen af sekventiel in vivo μCT til at skabe billeder i høj opløsning til at undersøge morfologiske ændringer efter amputation, samt kvantificere volumen-og længde ændringer i det samme ciffer i løbet af regenerering. Vi mener, at denne protokol tilbyder enorm nytte til at undersøge både epimorphic og vævs regenerativ reaktioner i pattedyr.

Introduction

Pattedyr, herunder mennesker og mus, har kapacitet til at regenerere spidserne af deres cifre efter distale amputation af terminalen falanks (P3)1,2,3. I mus er regenererings reaktionen amputation-niveau afhængig; stadigt mere proksimale talamputationer viser et progressivt svækket regenerativ respons, indtil komplet regenerativ fejl ved amputationer transekting og proksimalt til P3-negle matrixen4,5,6 , 7 , 8. P3-regenerering medieres ved dannelsen af en blastema, defineret som en population af prolifererende celler, der gennemgår morfogenese for at regenerere de amputerede strukturer9. Dannelsen af en tema for at regenerere de strukturer, der er gået tabt ved amputation, en proces, som kaldes epimorphic regenerering, adskiller P3-regenererings reaktionen på flere vævs niveauer fra traditionel vævsreparation efter skade6, 10. P3-regenerering er en reproducerbar og proceduremæssigt enkel model til undersøgelse af komplekse regenerativ processer, herunder sårheling11,12, knogle histolyse11,12, revaskularisering13, perifer nerve Regeneration14, og blastemal omdannelse til knogle via intramembranøs ossifikation15.

Tidligere studier med immun histokemi har vist, at tema er heterogent, Avaskulær, hypoxisk og meget proliferativ11,13,15,16. Efter distale P3-amputation er den tidlige tema i første omgang associeret med P3 periosteum og som og er karakteriseret ved robust proliferation og spirende osteogenese ved siden af knogleoverfladen15. Efter knoglenedbrydning og sårlukning dannes heterogene tema ved sammensmeltningen af periost-og endosteal-associerede celler, efterfulgt af differentieringen af blastemale komponenter, herunder knogle via intramembranøs ossifikation 15.

Knogle reparation som reaktion på skade opstår typisk ved endokondral ossifikation, dvs. via en indledende brusk, der danner en skabelon for efterfølgende knogledannelse17,18. Lang knogle Intramembranous ossifikation, dvs, knogledannelse uden en brusk mellemliggende, er almindeligt induceret ved hjælp af komplekse distraktion anordninger eller kirurgisk fiksering19,20. Det ciffer regenererende respons er en præklinisk model, der giver fordele i forhold til konventionelle intramembranske ossifikation modeller: 1) det kræver ikke ekstern eller intern fiksering post skade at stimulere Intramembranous ossifikation, 2) det er udført ved hjælp af 4 cifre fra hvert dyr, og dermed maksimere prøver, mens minimere dyrs brug, og 3) sekventiel in vivo mikrocomputer tomografi (μCT) analyse kan udføres med lethed og hastighed.

I denne undersøgelse viser vi det standardiserede P3-amputerings plan for at opnå et reproducerbart og robust regenererings respons. Derudover demonstrerer vi en optimeret fluorescens immunhistokemisk protokol ved hjælp af paraffin sektioner for at visualisere tema dannelse, revaskularisering i forbindelse med regenerering og blastemal omdannelse til knogle via Intramembranous Ossifikation. Vi viser også brugen af sekventiel in vivo μCT til at identificere ændringer i knogle morfologi, volumen og længde i det samme ciffer i løbet af regenerering. Formålet med denne protokol er at undersøge dannelsen af pattedyr tema efter amputation og at påvise 2 teknikker, fluorescens Immunhistokemi og sekventiel in vivo μct, til studiet af intramembranøs knogle regenerering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr brug og teknikker var i overensstemmelse med de standardprocedurer for den institutionelle dyrepasning og brug Udvalget af Texas A & M University.

1. voksen mus bagben distal P3 amputation

  1. Anesthetize en 8 til 12 uger gamle CD-1 mus (tabel over materialer) ved hjælp af isofluran gas i ilt; i første omgang bedøve ved 3% i et kammer, efterfulgt af 2% isofluran leveret af en til over varigheden af operationen. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
    Bemærk: De voksne P3 amputation undersøgelser standardiseret i vores laboratorium udføres på 8 til 12 uger gamle mus, og regenerering respons er bevaret i alle testede stammer.
  2. Under en 10x dissektion mikroskop, sterilisere cifre i bagdelen med kirurgisk povidon-jod og 70% ethanol. Trim håret væk fra operationsstedet ved hjælp af mikro-saks. Påfør 1 μL aktuel Bupivacain lokalt for at anæstetisere operationsstedet.
  3. Amputate den distale spids af terminalen falanks (P3) på cifre 2 og 4 i hver bagled ved hjælp af en steril #10 skalpel (figur 1a). Amputation skal udføres under aseptiske forhold, herunder sterilisering af kirurgiske instrumenter. Under dissektion mikroskopet forsigtigt splay bagpote at udsætte den mediale ciffer overflade. Hold skalpel i en vinkel parallelt med fatpad for at udføre amputation vist i figur 1b. Påfør 1 μL aktuel Bupivacain på amputerings stedet.
    Bemærk: Amputation transects negle orgel, dermis, P3 knogle, vasculature, og nerver, men ikke transect marv hulrum eller ciffer fat pad. Hvis der observeres blødning, påføres direkte tryk ved hjælp af en steril bomulds spids applikator.
  4. Standard P3-det distale amputerings plan fjerner ca. 15% – 20% af P3-knogle volumenet21. Mikroct scanning (se nedenfor) kan udføres for at bekræfte den korrekte amputation længde.
  5. Returner musen til en ren bur og lad såret til at helbrede uden sår dressing. Overvåg musen i 3 dage for at sikre, at musen vender tilbage til normal aktivitet.

2. samling af cifre og vævs forberedelse

  1. Euthanize musen ved hjælp af kuldioxid (CO2) i et lukket kammer, efterfulgt af livmoderhals dislokation.
  2. Brug en skalpel til at afskære ciffer midtvejs gennem det tilstødende knogle segment, den midterste falanks (P2) knogle, ved omtrent den anden ventrale fat pad indrykning. Ciffer (r) overføres til et 20 mL scintillationshætte glas indeholdende 10 mL frisk bufferet zink formalin fixativ, en 18% formaldehyd opløsning (Se tabel over materialer). Fikativ volumen skal være mindst 20x volumenet af det tilstedeværende væv.
    Bemærk: Cifre indsamles på forskellige tidspunkter efter amputation for at undersøge det fulde regenererings respons. Generelt, for tidlig tema dannelse, knogle histolyse, og sårlukning indsamlings tidspunkter er 4 – 8 dage efter amputation (DPA). For at undersøge den tidlige osteogen tema indsamlings tidspunkter er 9 og 10 DPA, og for at visualisere fortsatte knogle regenerering og mineralisering, indsamlingen tidspunkter er 14, 21, og 28 DPA. Unamputated cifre indsamles også.
  3. Fastgør ciffer for 24 – 48 timer ved stuetemperatur med blid blanding på en shaker.
  4. Fjern fikseret og vask ciffer 2x i 5 min i 5 mL 1x fosfat bufferet saltvand (PBS) ved stuetemperatur.
  5. Der placeres 10 mL frisk Decalcifier i (Se tabel over materialer), en 10% myresyre opløsning, i scintillationsglasset og blandes forsigtigt på en shaker i 2 timer ved stuetemperatur. Efter 2 h, Udskift decalcifier jeg med frisk opløsning og Afkalk ciffer natten over ved stuetemperatur med blid blanding på shaker.
  6. Fjern Decalcifier i og vask ciffer 2x i 5 min i 5 mL 1x PBS ved stuetemperatur.
  7. Behandl ciffer gennem en graderet ethanol-serie. Denne proces kan udføres manuelt i et 20 mL scintillationshætte glas, ved brug af 10 mL af hver væske, hvis mindre end 40 samlede cifre.
    1. Begynd med 2 fordybninger i frisk 70% ethanol ved stuetemperatur med blid blanding på en shaker, 1 h hver, efterfulgt af 2 fordybninger i frisk 95% ethanol ved stuetemperatur med blid blanding på en shaker, 1 h hver.
    2. Komplet ciffer dehydrering med 2 skyller af frisk 100% ethanol ved stuetemperatur med blid blanding på en shaker, 1 h hver. Den endelige 100% ethanol vask kan overlades natten over.
  8. I det samme scintillationshætte glas skal du udskifte 100% ethanol med 10 mL friske xylener og anbringe hætteglasset i en kemisk udsugnings hætte for 1,5 h ved stuetemperatur. Gentag med en frisk vask af xylener i en kemisk Røghætte til 1,5 h ved stuetemperatur i alt 2 skyller.
  9. Udskift xylener med flydende paraffinvoks smeltet til 68 °C, og Placer hætteglasset i en inkubator ved 68 °C i 2 timer, 2 gange. Efter 4 total h fordybelse i paraffin, indlejre ciffer for paraffin skæring.
    Bemærk: Ciffer behandling for histologi kan udføres i en automatiseret processor, efter disse samme retningslinjer.
  10. Sektionens cifre ved 4 – 5 μm tykkelse ved hjælp af en mikrotom. Placer sektionerede prøver på selvklæbende slides ved hjælp af et 38 – 41 °C vandbad suppleret med en histologisk klæbe opløsning for at sikre, at prøverne overholder diaset. Placer slides på en 37 °C-glide varmer for at tørre.

3. immun Histokemisk farvning af voksne muse cifre til undersøgelse af blastema dannelse og Intramembranøs ossifikation

  1. Varme sektionerede slides ved 65 °C i 45 min, efterfulgt af opvarmning ved 37 °C i mindst 15 minutter for at sikre, at prøverne overholder diaset.
  2. Deparaffinize og rehydrerer slides 2x med 5 min. vask af xylener, en gradueret ethanolserie og nedsænkning i vand. Placer slides i en 50 – 100 mL farvnings krukke, og hold dig nedsænket i 1x Tris bufferet saltvand med Tween 20 (TBST).
    Bemærk: Lad ikke prøverne tørre under hele farvningsprocessen. På ethvert TBST-trin kan slides inkuberet op til 2 timer.
  3. Forbered et befugtning kammer. En 1-tommer dyb dækket plastik slide kasse med fugtet silkepapir i bunden er tilstrækkelig.
  4. Forbered varme genfinding løsning til Runx2, Osterix (OSX), og prolifererende celle nukleare antigen (PCNA). For antigen hentning af den tidlige osteoprogenitormarkør, Runx2, forberede en 1x opløsning af Tris-EDTA, pH 8. For osteoblastdannelse markør, OSX, Forbered en 1x opløsning af citratbuffer, pH 6. PCNA immunofarvning kan udføres i begge løsninger.
  5. Der fremstilles proteinase-antigen søgnings opløsning til tema-mærket CXCR422 og endotel-celle mærket von Willebrand Factor 8 (VWF) ved at anbringe 100 μl proteinase k-opløsning pr. slide i et mikrocentrifuge glas og varme til 37 °c (ca. 5 min).
    Bemærk: Antigen hentning for Runx2, OSX og PCNA udføres ved hjælp af varme genfinding, og CXCR4 og vWF antigen hentning udføres via proteinase K behandling.
  6. Ved antistof udtagning, der kræver varme, nedsænkes gliderne i en farvnings beholder i den relevante antigen søgnings opløsning. Varme glider til 95 °C i 25 min, at sikre kogning ikke forekommer. Fjern farvnings glasset fra varmekilden, og lad det køle af ved stuetemperatur i 35 min.
  7. Til genfinding af proteinase K-antigen lægges gliderne fladt i befugtning kammer og Placer 100 μL forvarmet proteinase K på diaset. Dæk gliderne med en lille stribe parafilm for at sikre, at lysbillederne ikke bliver tørre. Inkubatglas sene i 12 min ved 37 °C.
  8. Vask slides 3 gange i 5 min i 1x TBST i farvning jar efter antigen hentning.
  9. Fjern slides fra farvnings glasset og Placer den i befugtning kammer. Placer 6 – 7 dråber blokerende opløsning (tabel over materialer) på diaset, og dæk sliden med frisk paraffin folie for at sikre, at diaset ikke bliver tørt. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  10. De primære antistoffer fremstilles ved fortynding af antistofferne til antistof fortyndingsmiddel (tabel over materialer). Vortex hver primær antistof opløsning for 3 s. primære antistoffer afledt af forskellige værtsarter kan kombineres.
    Bemærk: Immun Histokemisk farvning for Runx2 (kanin anti-Runx2 antistof, 1:250 fortynding, i en endelig koncentration på 4 μg/mL) kombineret med PCNA (monoklonalt mus anti-PCNA-antistoffer, 1:2000 fortynding, i en endelig koncentration på 0,5 μg/mL), og OSX (kanin anti-OSX antistof, 1:400 fortynding, i en endelig koncentration på 0,125 μg/mL) kombineret med PCNA er vist i figur 2. Det anti-PCNA-antistof, der anvendes i dette studie, er meget specifikt og kræver ingen yderligere blokerende trin ud over dem, der er skitseret i denne protokol. Immun Histokemisk farvning ved hjælp af CXCR4 (rotte anti-CXCR4 antistof, 1:500 fortynding i en endelig koncentration på 2 μg/mL) og vWF (kanin anti-humant vWF VIII-antistof, 1:800 fortynding, i en endelig koncentration på 41,25 μg/mL) er vist i figur 2. Primære antistoffer blev optimeret og testet af vores laboratorium under betingelserne i denne protokol og er opført i tabellen over materialer.
  11. Fjern forsigtigt paraffin filmen, og Tøm forsigtigt sliden på silkepapir for at fjerne overskydende blokerende opløsning. Placer 100 – 200 μL primær antistof opløsning på diaset, Udskift parafilm dækslet, og vend tilbage til befugtning kammeret. Slidene i det lukkede befugtning kammer natten over ved 4 °C.
    Bemærk: Lad ikke diasene blive tørre, mens du dræner blokerings opløsningen. Dette trin udføres hurtigt.
  12. Fjern omhyggeligt parafilm, og dræne forsigtigt den primære antistof opløsning fra diaset. Placer diaset i en farvnings krukke med frisk 1X TBST. Vask med frisk 1x TBST i 5 min 3 gange.
  13. Forbered de sekundære antistoffer ved at kombinere med antistof Fortynd (tabel over materialer). Vortex den sekundære antistof opløsning til 3 s. sekundære antistoffer konjugeret til forskellige fluorophorer afledt af forskellige arter kan kombineres.
    Bemærk: Fluorescerende sekundære antistoffer er lysfølsomme. Alexa fluor 488-konjugeret ged anti-kanin IgG (H + L) til Runx2, OSX, og vWF, Alexa fluor 568-konjugeret ged anti-rotte IgG (H + L) til CXCR4, og Alexa fluor 647-konjugeret ged anti-mus IgG (H + L) til PCNA, fortyndet ved 1:500 med en endelig koncentration på 4 μg/mL , blev anvendt i figur 2.
  14. Placer 200 μL sekundær antistof opløsning på sliden, Cover slide med frisk paraffin film, og vend tilbage til befugtning kammer. Inkubatet i det lukkede befugtning kammer i 45 min ved stuetemperatur. Sørg for, at befugtning kammer er lukket for at undgå lys.
  15. Tag forsigtigt paraffin filmen ud, og dræne den sekundære antistof opløsning forsigtigt fra sliden. Placer diaset i en farvnings krukke med frisk 1x TBST. Vask med frisk 1x TBST i 5 min 3 x. Undgå lys.
  16. Forbered Atom pletter. Der tilsættes 20 μL DAPI (Stock DAPI-opløsning er 5 mg/mL i H2O) til 200 ml 1x PBS og rystes kraftigt for at sikre ensartethed. Nedsænk lysbilleder i 5 minutter i DAPI-PBS-løsning. Undgå lys.
  17. Vask slides i dH2O i 3 min. sæt vandet i, og lad gliderne lufttørre, eller sug forsigtigt vandet ud af sliden, så det sikres, at prøverne ikke forstyrres under støvsugning. Undgå lys.
  18. Omhyggeligt Dæmp tørre slides med 100 μL anti-fade monterings medium (tabel over materialer); undgå dannelse af luftbobler på diaset under monterings trinnet. Opbevar gliderne fladt og lad monterings mediet tørre natten over ved stuetemperatur i en lyssikker beholder. Når monterings mediet er tørt, skal du opbevare slides fladt i en lyssikker beholder i 4 °C, indtil den er klar til visning.
    Bemærk: Hvis der er uacceptable niveauer af luftbobler efter montering, kan den monterede glide forsigtigt placeres i 1x PBS, dæksedlen kan fjernes, og når lysbilledet skylles igen i vand og gentørres, kan det monteres igen.

4. mikroskopi og billedanalyse

Bemærk: Billeddannelse og analyse ved hjælp af et fluorescens devolution mikroskop og tilhørende software, udstyret med 3 fluorescerende filtre (for at visualisere Alexa fluor 488, 568 og 647 nm signaler), plus DAPI (419 nm) anvendes i dette eksperiment.

  1. Billede diaset ved 10x forstørrelse for at fange hele tema-regionen.
    Bemærk: Prolifererende osteoblastdannelse primær antistof detektering anvender sekundære antistoffer (Alexa fluor 488 og 647) med ikke-overlappende emissions spektre for at minimere ukorrekt identifikation af co-mærkede celler. Baggrunds subtraktion af Auto-luorescent signal kan udføres ved hjælp af 568 nm-filteret for at sikre integriteten af 488-eller 647-signalerne. Blastema Primary antistof Detection anvender sekundære antistoffer (Alexa fluor 488 eller 568). Baggrunds subtraktion af Autofilter-signal kan udføres med 568-filteret, hvis du bruger det 488-konjugeret antistof, og 488-filteret bruger det 568-konjugeret antistof. Autofilter-signalet forbindes typisk med neglepladen og erytrocytter i hele ciffer og observeres i filtrene 488, 568 og 647.

5. sekventiel in vivo Mikroberegnet tomografi (μCT)

  1. Regenererende cifre af det samme dyr, der scannes ved 1 dag før amputation (unamputated), 1 DPA, og på forskellige tidspunkter, indtil fuldstændig regenerering ved 28 DPA ved brug af vivaCT 40 (tabel over materialer) udføres i dette eksperiment og vises i Figur 3A.
  2. Udstyre μCT med slanger for at muliggøre ilt flow ind og ud af μCT animalsk kammer, sikre, at den udstrømmende ilt er udstyret med et aktivt kul filter til at fælde isofluran.
    Bemærk: Sørg for, at det μCT dyre kammer er tæt indesluttet; på denne måde er en dysenæse-kegle ikke nødvendig for at forsyne isofluran med musen under scanningen.
  3. Klargør μCT-scannings parametrene. Cifre scannes ved en voxel-størrelse på 10,5 μm, ved 55 kVp, 145 uA med 1000 projektioner pr. 180 ° ved brug af kontinuerlig rotation og med en integrationstid på 200 msec, hvilket resulterer i maksimalt 213 udsnit pr. scanning. Scanninger, der udføres i dette eksperiment, er ca. 9 min. lange. En nedsat elektrisk strøm kan kompenseres med forholdsmæssigt forøget integrationstid, men vil resultere i længere scanningstider.
  4. Bedøve den voksne mus ved hjælp af isoflurane; i første omgang bedøretisere ved 3% i et kammer, efterfulgt af 1,5% isofluran leveret til μCT animalsk kammer i løbet af scanningen. Placer forsigtigt musen i μCT dyre kammeret med baglemmer cifre arrangeret i tæt forening, flad, ventrale side-up med venstre pote på venstre side og højre pote på højre side på scannings platformen, efterfulgt af forsigtigt at sikre de cifre på plads ved hjælp af kirurgiske Tape. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
  5. Returnere musen til en ren bur og overvåge musen indtil vågen. Fortsæt med at scanne den samme mus på bi-ugentlig til ugentlige tidspunkter for at visualisere hele knogle regenerering respons.
  6. Efter scanning, tillade op til flere timer for μCT billede rekonstruktion at forekomme. Ved hjælp af den software, der leveres med μCT, konvertere filerne til en række DICOM filer; hver DICOM-fil vil svare til et udsnit af scanningen, derfor, hvis 213 skiver er blevet scannet, 213 DICOM filer vil blive genereret og uploadet til virksomhedens server.
  7. Download DICOM-serien i en enkelt mappe ved hjælp af en batchfil downloader i en webbrowser.
  8. Download BoneJ plugin23 og træk filen ind i ImageJ plugin folder. I ImageJ skal du åbne DICOM-filserien som en stak ved at trække og slippe mappen til ImageJ-linjen. En 16-bit billedstak, der viser alle de grå værdier, vil blive åbnet. For kun at vise knogle skal du udføre image tærskel (Image > justere > tærskel).
    Bemærk: Når ImageJ-filer vises, svarer ImageJ-outputtet til et inverteret billede af cifrene. dvs., cifre arrangeret i scannings platformen ventrale side-up, med venstre pote på venstre side af platformen og højre pote på højre side af platformen, vises som dorsale side-up, højre pote på venstre side og venstre pote på højre side af ImageJ image stack.
  9. Når dialogboksen tærskel er åbnet, skal du skubbe den nederste bjælke, svarende til den øvre tærskel, længst til højre, og justere den øverste bjælke, svarende til den nedre tærskel, indtil kun knoglen er fremhævet rødt. Den nedre tærskelværdi vil være ca. 10000 – 13000 ved en maksimal signalintensitet på 32.767. Klik på Anvend, og klik på sort baggrundi dialogboksen Ny. Klik på OK.
  10. Et 8-bit billede, der viser sorte og hvide værdier, vil blive genereret med hvidt svarende til knogle. Vælg P3 knogle ved at tegne et rektangel omkring det, og duplikere stakken. Generer et 3D-billede (Plugins ≫ 3D Viewer). Hvis du vil beskære en unødvendig knogle fra billedet, skal du klikke på værktøjet Frihåndsmarkering og cirkle den knogle, som skal slettes. Højreklik, og vælg Udfyld valg for at slette knogle.
    Bemærk: Trinene beskrevet ovenfor gælder for ImageJ 1.52 h, Java 8 og kan afvige en smule, når du bruger en anden version af ImageJ. For thresholding anbefaler vi, at der fastslås en optimal værdi, og at værdien anvendes konsekvent.
  11. Kvantificer knogle volumen fra 3D-gengivelsen ved hjælp af BoneJ Volume brøk plugin'et (Plugins ≫ Bonej > volumenfraktion). Et resultat vindue vises, og knogle volumen (BV) vil blive vist i mm3.
  12. Kvantificer knogle længden fra 3D-gengivelsen ved hjælp af værktøjet ImageJ multipoint.
    Bemærk: Knogle længden er dynamisk i løbet af P3 regenerering; længden falder mellem 7-10 DPA forbundet med osteoklast-medieret knoglenedbrydning11, og efterfølges af en periode med distale knogle genvækst mellem 14-28 DPA (figur 3b). Længden måles fra den centrale base af P2/P3-leddet til det fjerneste punkt af mineraliseringen ved den distale knogle spids, men omfatter ikke nedbrudt knogle, der er fuldstændig løsrevet (figur 3b). BoneJ giver mulighed for en komplet 3D-vurdering af knogle arkitekturen; således vil den vinkel, hvor knoglen scannes, ikke ændre evnen til at måle længden.
  13. Tag et billede af 3D-gengivelsen ved at klikke på Visog tage snapshot. Gem billede som en TIF-eller JPEG-fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voksne mus regenererende P3-cifre ved 6/7 DPA(figur 2a-D), 9 DPA(figur 2E-H) og 10 DPA (figur 2i-L) var immun farvede med antistoffer mod Runx2, OSX og pcna til at visualisere Intramembranous knogle immun plettet med antistoffer mod CXCR4 og vWF for at visualisere tema dannelse. Repræsentative μCT-gengivelser af cifre, der er scannet før amputation, og på forskellige tidspunkter i løbet af regenerering (figur 3a, B) og identifikation af de landemærker, som anvendes til at identificere længde målinger (figur 3b), er også vist.

Figure 1
Figur 1: ciffer nummer og identifikation af det distale P3-amputerings plan for voksne mus. Den voksne mus højre Hind pote er vist med cifre nummereret 1-5; amputationer udført i dette studie udføres på cifre 2 og 4 (A). Det distale P3-amputerings plan vises (stiplet linje) på ciffer 2 og 4 (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tidlig intramembranøs ossifikation og tema dannelse i det regenererende voksne muse P3-ciffer. Runx2 (grøn) og pcna (magenta) dobbelt immunofluorescens viser, at prolifererende osteoprogenitorer er oprindeligt lokaliseret til periost og endosteal knogleoverflader ved 6/7 DPA, og udvide til den distale tema ved 9 og 10 DPA (A, E, I). OSX (grøn) og pcna (magenta) dobbelt immunofluorescens viser få OSX-positive osteoblaster og bred spredning ved 6/7 (B), og forbedret OSX immun farvning fikseres afgrænset af prolifererende celler ved 9 og 10 DPA (F, J). CXCR4 (rød) immunofluorescens identificerer tidlig tema dannelse ved 6/7 DPA (C), efterfulgt af robust CXCR4 immunofarvning i de 9 og 10 DPA regenererende cifre (G, K). vWF (grøn) immun farvning identificerer intakt vaskulatur i marv af amputerede cifre, og få positive celler forbundet med den avaskulære tema (D, H, L). Prøver, som er modfarvet med DAPI. Dorsal er til toppen, distale er til højre. Bl = blastema, m = marv. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: P3-knogle regenerering visualiseret ved sekventiel in vivo μCT-scanning. Repræsentative μCT-gengivelser af et ciffer, som er scannet før amputation (unamp), og ved 1, 7, 10, 14, 21 og 28 DPA. μCT-scanning viser P3-regenerering er karakteriseret ved en Initial knogle histolyse respons, efterfulgt af knogle ødannelse ved 14 DPA og robust knogle Regeneration ved 21 og 28 DPA (A). Repræsentative μCT-gengivelser af et ciffer scannet før amputation og ved 1, 7, 10, 14, 21 og 28 DPA, der illustrerer de regioner, hvor ciffer længden måles ved hvert tidspunkt. B) grønne prikker angiver den samlede målte længde, hvorimod det røde X betegner den udstødte knogle, der er udelukket fra længde målingen. Individuelle ciffer billeder skabt af ImageJ kan beskæres for at standardisere ciffer størrelsen for at muliggøre oprettelse af billeder set i denne figur. Distal er til højre, dorsale er til toppen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en standardiseret procedure for voksne mus distale P3 amputation, fluorescerende immun Histokemisk farvning til at visualisere og undersøge tema dannelse og Intramembranous ossifikation, og sekventiel in vivo μct scanning til Identificer knogle morfologiske, volumen og længde ændringer post amputation. P3 amputation er en unik, proceduremæssigt enkel og reproducerbar model til at analysere et Pro-regenerativ sårmiljø, der udløser tema dannelse. Desuden giver P3-cifret model talrige fordele i forhold til traditionelle knogleskade modeller til at undersøge intramembranøs ossifikation.

For at sikre, at denne protokol lykkes, skal der udføres komplet ciffer afkalkning. I tilfælde af at ciffer ikke er helt dekalcificeret, vil det smuldre og makulere under skæreprocessen. Desuden kan varme genfinding immun histokemi være problematisk, idet vævene kan løsne sig en anelse eller blive helt opløst fra diaset. For at afhjælpe dette problem, bør prøverne monteres på klæbende slides ved hjælp af et vandbad suppleret med en histologisk klæbemiddel, samt bagning de tørre slides til 65 °C før brug. Endelig er musens cifre relativt små; for præcist at kunne visualisere morfologi og kvantificere ændringer i knogle volumen og-længde skal μCT derfor være af tilstrækkelig opløsning til at fungere ved de relevante scanningsparametre.

En begrænsning af denne metode er, at ikke alle primære antistoffer er kompatible med vævs fiksation og paraffin behandling. I så fald kan der udføres standard cryosectioning med frosset væv for at sikre integriteten af det primære antistof antigen11. Cryosectioning eliminerer også behovet for afkalknings trinnet, men vi har konstateret, at kryosektionering af cifre er teknisk mere udfordrende end paraffin skæring.

Hele tema kan visualiseres ved 10x forstørrelse ved dekoncentrering mikroskopi, og ved hjælp af passende billed kvantificering software, kan immun farvning resultater let kvantificeres. Fluorescerende immunhistokemisk sondering for osteogene markører af det regenererende ciffer giver et unikt overskud af blastemal differentiering via intramembranøs ossifikation. Immun Histokemisk farvning afslører P3-knogle regenererings responset er polariseret og resulterer i organiseret proksimal-til-distal knogledannelse (figur 2). Ved senere regenererings stadier er ikke-proliferative osteoblaster afledt af tema lokaliseret ved siden af knogle stump og er fikseres afgrænset af prolifererende osteoblaster. De prolifererende osteoblaster er til gengæld fikseres afgrænset af prolifererende udifferentierede blastemale celler. Fluorescerende immunhistokemisk sondering for tema-mærket CXCR4 identificerer tidlige tema-celler forbundet med den skadede knogle overflade efterfulgt af øget immun farvning ved senere regenererings stadier (figur 2). Tema er Avaskulær13 og immunofluorescens for endotheliale cellemarkør vWF identificerer få positive celler i tema-regionen (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af Muneoka Lab og Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Dette arbejde blev støttet af Texas A & M University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protein Block Serum Free DAKO X0909 Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody Abcam ab29 1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody R&D Systems MAB21651 1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody DAKO A0082 1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody Abcam ab22552 1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody Sigma-Aldrich Co. HPA022040 1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen A21235 1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11008 1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Invitrogen A11077 1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930 Ready to use
Surgipath Decalicifier 1 Leica Biosystems 3800400 Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative Anatech LTD 174 Ready to use
CD-1 Female Mouse Envigo ICR(CD-1) 8-12-weeks-old
vivaCT 40 SCANCO Medical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
  2. Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
  3. Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
  4. Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
  5. Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).
  6. Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
  7. Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
  8. Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
  9. Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).
  10. Carlson, B. M. Principles of Regenerative Biology. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).
  11. Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).
  12. Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
  13. Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
  14. Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).
  15. Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
  16. Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
  17. Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
  18. Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
  19. Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
  20. Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
  21. Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
  22. Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).
  23. Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).

Tags

Udviklingsmæssige biologi ciffer amputation epimorphic regenerering Intramembranous ossifikation osteoprogenitorer blastema afkalkning fluorescens immun histokemi mikrocomputer tomografi
Amputation og regenerering af voksent muse ciffer: en simpel model til undersøgelse af dannelsen af pattedyrs blastema og Intramembranøs ossifikation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, … More

Dawson, L. A., Brunauer, R., Zimmel, K. N., Qureshi, O., Falck, A. R., Kim, P., Dolan, C. P., Yu, L., Lin, Y. L., Daniel, B., Yan, M., Muneoka, K. Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification. J. Vis. Exp. (149), e59749, doi:10.3791/59749 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter