Summary
Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal de ratón adulto para investigar la formación de blastema de mamíferos y la osificación intramembranosa, analizada por inmunohistoquímica fluorescente y tomografía microcomputada secuencial in vivo.
Abstract
Aquí, presentamos un protocolo de amputación de falange terminal distal de ratón adulto (P3), un modelo de regeneración epimórfica de mamíferos procedimentalmente simple y reproducible, que implica la formación de blastema y la osificación intrammal inmunohistoquímica de fluorescencia y microtomografía microcomputada secuencial en vivo (CT). La regeneración de mamíferos se limita a las amputaciones que transectan la región distal de la falange terminal (P3); dígitos amputados a niveles más proximales no se regeneran y se someten a curación fibrosa y formación de cicatrices. La respuesta de regeneración está mediada por la formación de un blastema proliferativo, seguido de la regeneración ósea a través de la osificación intramembranosa para restaurar la longitud esquelética amputada. La amputación P3 es un modelo preclínico para investigar la regeneración epimórfica en mamíferos, y es una poderosa herramienta para el diseño de estrategias terapéuticas para reemplazar la curación fibrosa con una respuesta regenerativa exitosa. Nuestro protocolo utiliza inmunohistoquímica de fluorescencia a 1) identificar poblaciones de células blastema tempranas y tardías, 2) estudiar la revascularización en el contexto de la regeneración, y 3) investigar la osificación intramembranosa sin necesidad de hueso complejo dispositivos de estabilización. También demostramos el uso de imágenes secuenciales in vivo-CT para crear imágenes de alta resolución para examinar los cambios morfológicos después de la amputación, así como cuantificar los cambios de volumen y longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. Creemos que este protocolo ofrece una enorme utilidad para investigar las respuestas regenerativas tanto epimórficas como tisulares en mamíferos.
Introduction
Los mamíferos, incluidos los humanos y los ratones, tienen la capacidad de regenerar las puntas de sus dígitos después de la amputación distal de la falange terminal (P3)1,2,3. En ratones, la respuesta de regeneración depende del nivel de amputación; las amputaciones de dígitos cada vez más proximales muestran una respuesta regenerativa progresivamente atenuada hasta que el fallo regenerativo completo en las amputaciones transectantes y proximal a la matriz de uñas P34,5,6 , 7 , 8. La regeneración P3 está mediada por la formación de un blastema, definido como unapoblación de células proliferantes que se someten a morfogénesis para regenerar las estructuras amputadas 9. La formación de un blastema para regenerar las estructuras perdidas por amputación, un proceso llamado regeneración epimórfica, distingue la respuesta de regeneración P3 a nivel multitejido de la reparación de tejido tradicional después de la lesión6, 10. La regeneración P3 es un modelo reproducible y procedimentalmente simple para investigar procesos regenerativos complejos, incluyendo la cicatrización de heridas11,12, histólisis ósea11,12, revascularización13, regeneración del nervio periférico14,y conversión blastemal a hueso a través de osificación intramembranosa15.
Estudios previos con inmunohistoquímica han demostrado que el blastema es heterogéneo, avascular, hipoxico y altamente proliferativo11,13,15,16. Después de la amputación distal de P3, el blastema temprano se asocia inicialmente con el periosteum P3 y el endosteum y se caracteriza por una proliferación robusta y osteogénesis naciente adyacente a la superficie ósea15. Después de la degradación ósea y el cierre de la herida, el blastema heterogéneo se forma por la fusión de células asociadas a periosteales y endosteales, seguido de la diferenciación de componentes blastemales, incluyendo hueso según la osificación intramembranosa 15.
La reparación ósea en respuesta a la lesión se produce típicamente por osificación endochondral, es decir, a través de un callo cartilageonoso inicial que forma una plantilla para la posterior formación ósea17,18. La osificación intramembranosa ósea larga, es decir, la formación ósea sin un intermedio cartilaginoso, se induce comúnmente utilizando dispositivos de distracción complejos o fijación quirúrgica19,20. La respuesta de regeneración de dígitos es un modelo preclínico que ofrece ventajas sobre los modelos convencionales de osificación intramembranosa: 1) no requiere fijación externa o interna después de una lesión para estimular la osificación intramembranosa, 2) es realizado utilizando 4 dígitos de cada animal, maximizando así las muestras y minimizando el uso de animales, y 3) el análisis secuencial de microcomputación in vivo (CT) se puede realizar con facilidad y velocidad.
En el presente estudio, mostramos el plano de amputación P3 estandarizado para lograr una respuesta de regeneración reproducible y robusta. Además, demostramos un protocolo optimizado de inmunohistoquímica de fluorescencia utilizando secciones de parafina para visualizar la formación de blastema, la revascularización en el contexto de la regeneración y la conversión blastemal a hueso a través de Osificación. También demostramos el uso de la c.CT secuencial para identificar los cambios en la morfología ósea, el volumen y la longitud en el mismo dígito en el transcurso de la regeneración. El objetivo de este protocolo es investigar la formación de blastema de mamíferos después de la amputación y demostrar 2 técnicas, inmunohistoquímica de fluorescencia y secuencial in vivo-CT, para el estudio de la regeneración ósea intramembranosa.
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Protocol
Todos los usos y técnicas de los animales estaban en cumplimiento con los procedimientos operativos estándar del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad A&M de Texas.
1. Adult Mouse Hind Limb Distal P3 Amputación
- Anestetizar un ratón CD-1 de 8 a 12 semanas (Tablade Materiales)usando gas isoflurano en oxígeno; inicialmente anestesiar al 3% en una cámara, seguido de un 2% de isoflurano suministrado por un nosecone durante la duración de la cirugía. Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
NOTA: Los estudios adultos de amputación P3 estandarizados en nuestro laboratorio se realizan en ratones de 8 a 12 semanas de edad, y la respuesta de regeneración se conserva en todas las cepas probadas. - Bajo un microscopio de disección 10x, esterilizar los dígitos de la extremidad posterior con Povidona-yodo quirúrgico y 70% de etanol. Recortar el cabello lejos del sitio quirúrgico usando microtijeras. Aplicar 1 l de Bupivacaína tópica localmente para anestesiar el sitio quirúrgico.
- Amputar la punta distal de la falange terminal (P3) en los dígitos 2 y 4 de cada extremidad posterior utilizando un bisturí #10 estéril (Figura1A). La amputación debe realizarse en condiciones asépticas, incluida la esterilización de instrumentos quirúrgicos. Bajo el microscopio de disección, golpee suavemente la pata trasera para exponer la superficie del dígito medial. Sostenga el bisturí en un ángulo paralelo al fatpad para realizar la amputación que se muestra en la Figura 1B. Aplicar 1 l de Bupivacaína tópica en el sitio de la amputación.
NOTA: La amputación transecto el órgano de la uña, la dermis, el hueso P3, la vasculatura y los nervios, pero no transecta la cavidad de la médula ni la almohadilla de grasa de dígitos. Si se observa sangrado, aplique presión directa con un aplicador estéril de punta de algodón. - El plano de amputación distal P3 estándar elimina aproximadamente 15%–20% del volumen óseo P321. La exploración microCT (ver más abajo) se puede realizar para confirmar la longitud correcta de la amputación.
- Devuelva el ratón a una jaula limpia y deje que la herida sane sin vendaje de la herida. Supervise el ratón durante 3 días para asegurarse de que el ratón vuelve a la actividad normal.
2. Recolección de dígitos y preparación de tejidos
- Eutanasia del ratón condióxido de carbono (CO 2) en una cámara cerrada, seguido de dislocación cervical.
- Utilice un bisturí para cortar el dígito a mitad del segmento óseo adyacente, el hueso de la falange media (P2), aproximadamente en la segunda sangría de la almohadilla de grasa ventral. Transfiera los dígitos a un vial de centelleo de 20 ml que contenga un fijador de formalína de zinc tamponado fresco de 10 ml, una solución de formaldehído del 18% (ver Tabla de materiales). El volumen fijador debe ser al menos 20 veces el volumen del tejido presente.
NOTA: Los dígitos se recogen en varios puntos de tiempo después de la amputación para investigar la respuesta de regeneración completa. Generalmente, para la formación temprana de blastema, histólisis ósea y cierre de heridas, los plazos de recolección son de 4-8 días después de la amputación (DPA). Para investigar el blastema osteogénico temprano los plazos de recolección son 9 y 10 DPA, y para visualizar la regeneración ósea continua y la mineralización, los puntos de tiempo de recolección son 14, 21 y 28 DPA. Los dígitos no amputados también se recopilan. - Fijar el dígito de 24 a 48 h a temperatura ambiente con una mezcla suave en una coctelera.
- Retire el fijador y lave el dígito 2x durante 5 min en 5 ml de 1x solución salina tamponada de fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
- Colocar 10 ml de descalcificador fresco I (ver Tabla de Materiales), una solución de ácido fórmico al 10%, en el vial de centelleo y mezclar suavemente sobre una coctelera durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de 2 h, reemplace Decalcifier I con solución fresca y descalcitre el dígito durante la noche a temperatura ambiente con una mezcla suave en la coctelera.
- Retire el descalcificador I y lave el dígito 2x durante 5 min en 5 mL de 1x PBS a temperatura ambiente.
-
Procesar el dígito a través de una serie de etanol calificado. Este proceso se puede realizar manualmente en un vial de centelleo de 20 ml, utilizando 10 ml de cada líquido si es inferior a 40 dígitos totales.
- Comience con 2 inmersiones en etanol fresco 70% a temperatura ambiente con una mezcla suave en una coctelera, 1 h cada una, seguida de 2 inmersiones en etanol fresco 95% a temperatura ambiente con una mezcla suave en una coctelera, 1 h cada una.
- Completa la deshidratación del dígito con 2 lavados de etanol fresco 100% a temperatura ambiente con una mezcla suave en una coctelera, 1 h cada uno. El lavado final 100% de etanol se puede dejar durante la noche.
- En el mismo vial de centelleo, reemplace el etanol 100% por 10 ml de xilenos frescos y coloque el vial en una campana de humo sóquímico durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Repita con un lavado fresco de xilenos en una campana de humos químicos durante 1,5 h a temperatura ambiente para un total de 2 lavados.
- Sustituya los xilenos con cera de parafina líquida fundida a 68oC y colóquelo en una incubadora a 68oC durante 2 h, 2 veces. Después de 4 h total de inmersión en cera de parafina, incrustar el dígito para el seccionamiento de parafina.
NOTA: El procesamiento de dígitos para histología se puede realizar en un procesador automatizado, siguiendo estas mismas pautas. - Dígitos de sección de 4 a 5 m de espesor utilizando un microtome. Coloque las muestras seccionadas en las guías adhesivas, utilizando un baño de agua de 38-41 oC complementado con una solución adhesiva histológica para asegurar que las muestras se adhieran a la diapositiva. Coloque las diapositivas en un calentador deslizante de 37 oC para secar.
3. Tinción inmunohistoquímica de dígitos de ratón adulto para investigar la formación Blastema y la osificación intramembranosa
- Deslizamientos seccionados por calor a 65 oC durante 45 minutos, seguidos de calentamiento a 37 oC durante no menos de 15 minutos para garantizar que las muestras se adhieran a la diapositiva.
- Desparaffinizar y rehidratar los portaobjetos 2x con lavados de 5 min de xilenos, una serie de etanol calificado y inmersión en agua. Coloque las diapositivas en un frasco de tinción de capacidad de 50-100 ml y manténgase sumergido en 1 salino tris tamponado con Tween 20 (TBST).
NOTA: No permita que las muestras se sequen durante todo el proceso de tinción. En cualquier paso TBST, las diapositivas se pueden incubar hasta 2 h. - Preparen una cámara humidificadora. Una caja deslizante de plástico cubierta de 1 pulgada de profundidad con papel de tejido humedecido en la base es suficiente.
- Prepare la solución de recuperación de calor para Runx2, Osterix (OSX) y Proliferating Cell Nuclear Antígeno (PCNA). Para la recuperación de antígenos del marcador osteoprogenitor temprano, Runx2, prepare una solución 1x de Tris-EDTA, pH 8. Para el marcador de osteoblasto, OSX, prepare una solución 1x de tampón de citrato, pH 6. La inmunomancha PCNA se puede realizar en cualquiera de las dos soluciones.
- Preparar la solución de recuperación de antígeno proteinasa K para el marcador de blastema CXCR422 y el marcador de células endoteliales von Willebrand Factor 8 (vWF) colocando 100 ml de solución de Proteinase K por diapositiva en un tubo de microcentrífuga y calentando a 37 oC (aproximadamente 5 min).
NOTA: La recuperación de antígenos para Runx2, OSX y PCNA se realiza mediante recuperación de calor, y la recuperación de CXCR4 y antígeno vWF se realiza mediante tratamiento con proteinasa K. - Para la recuperación de anticuerpos que requiera calor, sumerja las diapositivas en un frasco de tinción en la solución de recuperación de antígenos adecuada. El calor se desliza a 95 oC durante 25 minutos, asegurando que no se produzca ebullición. Retire el frasco de tinción de la fuente de calor y deje enfriar a temperatura ambiente durante 35 minutos.
- Para la recuperación del antígeno Proteinase K, coloque diapositivas planas en la cámara humidificadora y coloque 100 ml de Proteinase K precalentado en la diapositiva. Cubra los portaobjetos con una pequeña tira de parafilm para asegurarse de que las diapositivas no se sequen. Incubar toboganes durante 12 min a 37oC.
- Lave los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos en 1 TBST en frasco de tinción después de la recuperación del antígeno.
- Retire los portaobjetos del frasco de tinción y colóquelos en la cámara humidificadora. Coloque de 6 a 7 gotas de solución de bloqueo (Tablade materiales)en la diapositiva y cubra la diapositiva con una película de parafina fresca para asegurarse de que la diapositiva no se seque. Incubar toboganes durante 1 h a temperatura ambiente.
- Preparar los anticuerpos primarios diluyendo los anticuerpos en diluyente de anticuerpos (Tablade materiales). Vortex se puede combinar cada solución de anticuerpos primarios para 3 s. Se pueden combinar anticuerpos primarios derivados de diferentes especies huésped.
NOTA: Tinción inmunohistoquímica para Runx2 (anticuerpo anti-Runx2 de conejo, dilución 1:250, a una concentración final de 4 g/ml) combinada con PCNA (anticuerpo anti-PCNA de ratón monoclonal, dilución 1:2.000, a una concentración final de 0,5 g/ml) y OSX (conejo anti-OSX anticuerpos, 1:400 de dilución, a una concentración final de 0,125 g/ml) combinados con PCNA se muestran en la Figura2. El anticuerpo anti-PCNA de ratón utilizado en este estudio es muy específico y no requiere pasos de bloqueo adicionales más allá de los descritos en este protocolo. La tinción inmunohistoquímica mediante CXCR4 (anticuerpo anti-CXCR4 de rata, dilución 1:500 a una concentración final de 2 g/ml) y vWF (anticuerpo vWF vWF antihumano conejo, dilución 1:800, a una concentración final de 41,25 g/ml) se muestra en la figura2. Los anticuerpos primarios fueron optimizados y probados por nuestro laboratorio bajo las condiciones de este protocolo y se enumeran en la Tabla de Materiales. - Retire con cuidado la película de parafina y drene suavemente la diapositiva sobre el papel tisú para eliminar el exceso de solución de bloqueo. Coloque 100–200 ml de solución de anticuerpos primarios en la corredera, reemplace la cubierta del parafilm y vuelva a la cámara humidificadora. Incubar los toboganes en la cámara humidificadora cerrada durante la noche a 4oC.
NOTA: No deje que las diapositivas se sequen mientras drenan la solución de bloqueo. Este paso se realiza rápidamente. - Retire cuidadosamente el parafilm y drene suavemente la solución de anticuerpos primarios de la corredera. Coloque la diapositiva en un frasco de tinción que contenga 1X TBST fresco. Lavar con 1 x TBST fresco durante 5 min 3 veces.
- Preparar los anticuerpos secundarios combinándolos con diluyente de anticuerpos (Tablade materiales). Vortex puede combinarse la solución secundaria de anticuerpos para 3 s. Se pueden combinar anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos derivados de diferentes especies.
NOTA: Los anticuerpos secundarios fluorescentes son sensibles a la luz. Alexa Fluor 488-conjugado cabra anticonejo IgG (H+L) para Runx2, OSX, y vWF, Alexa Fluor 568-conjugado cabra anti-rata IgG (H+L) para CXCR4, y Alexa Fluor 647-conjugado cabra anti-ratón IgG (H+L) para PCNA, diluido a 1:500 con una concentración final de 4 g /mL , se utilizaron en la Figura2. - Coloque 200 ml de solución de anticuerpos secundarios en el portaobjetos, cubra el portaobjetos con película de parafina fresca y vuelva a la cámara humidificadora. Incubar los portaobjetos en la cámara humidificadora cerrada durante 45 min a temperatura ambiente. Asegúrese de que la cámara humidificadora esté cerrada para evitar la luz.
- Retire cuidadosamente la película de parafina y drene suavemente la solución secundaria de anticuerpos de la corredera. Coloque la diapositiva en un frasco de tinción que contenga 1 x TBST fresco. Lavar con 1 x TBST fresco durante 5 min 3x. Evite la luz.
- Prepara la mancha nuclear. Añadir 20 l de DAPI (la solución DAPI en stock es de 5 mg/ml en H2O) a 200 ml de 1x PBS y agitar vigorosamente para garantizar la homogeneidad. Sumerja las diapositivas durante 5 minutos en la solución DAPI-PBS. Evite la luz.
- Lavar los portaobjetos en dH2O durante 3 min. Decantar el agua y dejar que los portaobjetos se sequen al aire o aspiren suavemente el agua del portaobjetos, asegurándose de que las muestras no se alteren durante la aspiración. Evite la luz.
- Toboganes secos cuidadosamente cubiertos con 100 ml de medio de montaje anti-fade (Tablade materiales); evitar la formación de burbujas de aire en el portaobjetos durante el paso de montaje. Almacene las diapositivas planas y deje que el medio de montaje se seque durante la noche a temperatura ambiente en un recipiente a prueba de luz. Una vez secado el medio de montaje, guarde las diapositivas planas en un recipiente a prueba de luz en 4 oC hasta que esté naícargo para ver.
NOTA: Si hay niveles inaceptables de burbujas de aire después del montaje, la corredera montada se puede colocar suavemente en 1pbS, el cubreobjetos se puede quitar, y una vez que el portaobjetos se enjuaga de nuevo en agua y se vuelve a secar, se puede volver a montar.
4. Microscopía y análisis de imágenes
NOTA: En este experimento se utilizan imágenes y análisis mediante un microscopio de desconvolución de fluorescencia y un software asociado, equipado con 3 filtros fluorescentes (para visualizar señales Alexa Fluor 488, 568 y 647 nm), además de DAPI (419 nm).
- Imagen de la diapositiva a un aumento de 10x para capturar toda la región blastema.
NOTA: La proliferación de la detección de anticuerpos primarios osteoblastos utiliza anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 488 y 647) con espectros de emisión no superpuestos para minimizar la identificación incorrecta de células etiquetadas co-etiquetar. La resta de fondo de la señal autofluorescente se puede realizar utilizando el filtro de 568 nm para garantizar la integridad de las señales 488 o 647. La detección de anticuerpos primarios Blastema utiliza anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 488 o 568). La resta de fondo de la señal autofluorescente se puede realizar con el filtro 568 si se utiliza el anticuerpo conjugado 488, y el filtro 488 está utilizando el anticuerpo conjugado 568. La señal autofluorescente se asocia típicamente con la placa de uñas y eritrocitos a lo largo del dígito, y se observa en los filtros 488, 568 y 647.
5. Tomografía microcalculada secuencial en Vivo (CT)
- Los dígitos regeneradores del mismo animal escaneado a 1 día antes de la amputación (sin amputación), 1 DPA, y en varios puntos de tiempo hasta la regeneración completa en 28 DPA utilizando el vivaCT 40 (Tablade Materiales)se realiza en este experimento y se muestra en este experimento y se muestra en Figura 3A.
- Aparejar el ct con tubos para permitir el flujo de oxígeno dentro y fuera de la cámara animal de la CT, asegurándose de que el oxígeno que fluye está equipado con un filtro de carbón activado para atrapar el isoflurano.
NOTA: Asegúrese de que la cámara de animales de la tc esté bien cerrada; de esta manera, no se requiere un animal nariz-cono para suministrar isoflurano al ratón durante la exploración. - Prepare los parámetros de escaneado de la c.CT. Los dígitos se escanean a un tamaño de voxel de 10,5 m, a 55 kVp, 145 uA con 1000 proyecciones por 180o utilizando rotación continua, y con un tiempo de integración de 200 ms, lo que resulta en un máximo de 213 rebanadas por escaneo. Los escaneos realizados en este experimento miden aproximadamente 9 minutos de largo. Una disminución de la corriente eléctrica se puede compensar con un tiempo de integración proporcionalmente mayor, pero resultará en tiempos de escaneo más largos.
- Anestesiar el ratón adulto usando isoflurano; inicialmente anestesiar al 3% en una cámara, seguido de un 1,5% de isoflurano suministrado a la cámara animal de la CT durante la duración de la exploración. Coloque suavemente el ratón en la cámara de animales de la clact con los dígitos de las extremidades posteriores dispuestos en estrecha relación, plano, ventral lado hacia arriba con la pata izquierda en el lado izquierdo y la pata derecha en el lado derecho en la plataforma de escaneo, seguido de asegurar suavemente los dígitos en su lugar usando Cinta. Aplique pomada oftálmica en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Devuelva el ratón a una jaula limpia y monitoree el ratón hasta que despierte. Continúe escaneando el mismo ratón en puntos de tiempo quincenales a semanales para visualizar toda la respuesta de regeneración ósea.
- Después de escanear, espere hasta varias horas para que se produzca la reconstrucción de la imagen de la imagen de la cTU. Usando el software proporcionado con el .CT, convertir los archivos a una serie de archivos dicom; cada archivo de dicom corresponderá a un segmento del análisis, por lo tanto, si se han escaneado 213 sectores, se generarán 213 archivos de dicom y se cargarán en el servidor de la empresa.
- Descargue la serie dicom en una sola carpeta utilizando un descargador de archivos por lotes en un navegador web.
- Descargue el plugin BoneJ23 y arrastre el archivo a la carpeta del plugin ImageJ. En ImageJ, abra la serie de archivos dicom como una pila arrastrando y soltando la carpeta en la barra ImageJ. Se abrirá una pila de imágenes de 16 bits que muestre todos los valores grises. Para mostrar solo hueso, realiceel umbral de imagen (Imago > Ajustar > Umbral).
NOTA: Al ver archivos ImageJ, la salida ImageJ corresponderá a una imagen invertida de los dígitos; es decir, los dígitos dispuestos en la plataforma de escaneo ventral lado hacia arriba, con la pata izquierda en el lado izquierdo de la plataforma y la pata derecha en el lado derecho de la plataforma, aparecerán como lado dorsal hacia arriba, pata derecha en el lado izquierdo y la pata izquierda en el lado derecho de la pila de imágenes ImageJ. - Una vez abierto el cuadro de diálogo de umbral, deslice la barra inferior, correspondiente al umbral superior, hacia el extremo derecho, y ajuste la barra superior, correspondiente al umbral inferior, hasta que solo se resalte el hueso en rojo. El valor de umbral inferior será de aproximadamente 10.000–13.000 a una intensidad de señal máxima de 32.767. Haga clic en Aplicary, en el nuevo cuadro de diálogo, haga clic en Fondo negro. Haga clic en Aceptar.
- Se generará una imagen de 8 bits que muestre valores en blanco y negro, con el blanco correspondiente al hueso. Seleccione el hueso P3 dibujando un rectángulo alrededor de él y duplique la pila. Generar una imagen 3D (Plugins > 3D Viewer). Para recortar cualquier hueso innecesario de la imagen, haga clic en la herramienta de selección a mano alzada y circule el hueso que desea eliminar. Haga clic con el botón derecho y seleccione Rellenar selección para eliminar el hueso.
NOTA: Los pasos descritos anteriormente se aplican a ImageJ 1.52h, Java 8 y pueden diferir ligeramente cuando se utiliza una versión diferente de ImageJ. Para el umbral, recomendamos la determinación de un valor óptimo y el uso coherente de ese valor. - Cuantifique el volumen óseo a partir de la representación 3D utilizando el complemento BoneJ Volume Fraction (Plugins > BoneJ > Volume Fraction). Aparecerá una ventana de resultados y se mostrará el volumen óseo (BV) en mm3.
- Cuantifique la longitud ósea del renderizado 3D utilizando la herramienta multipunto ImageJ.
NOTA: La longitud ósea es dinámica en el transcurso de la regeneración P3; la longitud disminuye entre 7-10 DPA asociado con la degradación ósea mediada por osteoclasto11, y es seguido por un período de recrecimiento de hueso distal entre 14-28 DPA (Figura3B). La longitud se mide desde la base central de la articulación P2/P3 hasta el punto más lejano de mineralización en el ápice del hueso distal, pero no incluye el hueso degradado que se ha desprendido completamente (Figura3B). BoneJ permite la evaluación 3D completa de la arquitectura ósea; por lo tanto, el ángulo en el que se escanea el hueso no alterará la capacidad de medir la longitud. - Capture una imagen de la representación 3D haciendo clic en Very tome una instantánea. Guarde la imagen como un archivo tif o jpeg.
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Representative Results
Ratón adulto que regenera los dígitos P3 a 6/7 DPA (Figura2A-D), 9 DPA (Figura2E-H)y 10 DPA (Figura2I-L) fueron inmunomanchados con anticuerpos a Runx2, OSX y PCNA para visualizar hueso intrammalembranous regeneración e inmunostecadas con anticuerpos contra CXCR4 y vWF para visualizar la formación de blastema. Las representaciones representativas de los dígitos escaneados antes de la amputación y en varios puntos de tiempo en el transcurso de la regeneración (Figura3A,B)y la identificación de los puntos de referencia utilizados para identificar las mediciones de longitud (Figura3B)son también se muestra.
Figura 1: Número de dígitos e identificación del plano de amputación Disal P3 del ratón adulto. La pata trasera derecha del ratón adulto se muestra con dígitos numerados 1-5; las amputaciones realizadas en este estudio se llevan a cabo en los dígitos 2 y 4 (A). Se muestra el plano distal de amputación P3 (línea discontinua) en los dígitos 2 y 4 (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Osificación intramembranosa temprana y formación de blastema en el dígito P3 de ratón adulto regenerador. La inmunofluorescencia doble Runx2 (verde) y PCNA (magenta) muestra que los osteoprogenitores proliferantes se localizan inicialmente en las superficies óseas periosteales y endosteales a 6/7 DPA, y se expanden al blastema distal a 9 y 10 DPA(A, E,I). La inmunofluorescencia doble OSX (verde) y PCNA (magenta) muestra pocos osteoblastos oSX positivos y una amplia proliferación a 6/7 (B), y la inmunomancha Mejorada de OSX delimitada disalmente por células que proliferan a 9 y 10 DPA (F, J). La inmunofluorescencia CXCR4 (roja) identifica la formación tempranade blastema a 6/7 DPA (C), seguida de una robusta inmunomancha CXCR4 en los dígitos regeneradores de 9 y 10 DPA (G, K). La inmunomancha vWF (verde) identifica la vasculatura intacta en la médula de los dígitos amputados, y pocas células positivas asociadas con el blastema avascular (D, H, L). Muestras con contadores con DAPI. Dorsal está en la parte superior, distal está a la derecha. Bl - blastema, m de médula. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Regeneración ósea P3 visualizada por la exploración secuencial in-vivo-CT. Representaciones representativas de CT de un dígito escaneado antes de la amputación (unamp), y en 1, 7, 10, 14, 21 y 28 DPA. La exploración por TC demuestra que la regeneración p3 se caracteriza por una respuesta inicial de hisólisis ósea, seguida de la formación de islas óseas a 14 DPA y una regeneración ósea robusta a 21 y 28 DPA (A). Representaciones representativas de CT de un dígito escaneado antes de la amputación y en 1, 7, 10, 14, 21 y 28 DPA que ilustran las regiones en las que se mide la longitud del dígito en cada punto de tiempo. (B) Los puntos verdes indican la longitud total medida, mientras que la X roja indica la región del hueso expulsado excluido de la medida de longitud. Las imágenes de dígitos individuales creadas por ImageJ se pueden recortar para estandarizar el tamaño de los dígitos para permitir la creación de imágenes vistas en esta figura. Distal está a la derecha, dorsal está en la parte superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un procedimiento estandarizado de amputación disal de P3 de ratón adulto, tinción inmunohistoquímica fluorescente para visualizar e investigar la formación de blastema y la osificación intramembranosa, y escaneo secuencial en vivoCT para identificar los cambios morfológicos, de volumen y longitud óseas después de la amputación. La amputación P3 es un modelo único, procedimentalmente simple y reproducible para analizar un entorno de heridas pro-regenerativo que desencadena la formación de blastema. Además, el modelo de dígitos P3 ofrece numerosas ventajas sobre los modelos tradicionales de lesiones óseas para investigar la osificación intramembranosa.
Para garantizar el éxito de este protocolo, se debe realizar una descalcificación completa de los dígitos. En caso de que el dígito no esté completamente descalcificado, se desmoronará y desmenuzará durante el proceso de seccionamiento. Además, la inmunohistoquímica de recuperación de calor puede ser problemática, ya que los tejidos pueden desprenderse ligeramente o desalojarse por completo de la diapositiva. Para aliviar este problema, las muestras deben montarse en portaobjetos adhesivos utilizando un baño de agua complementado con un agente adhesivo histológico, así como hornear los portaobjetos secos a 65 oC antes de su uso. Por último, los dígitos del ratón son relativamente pequeños; por lo tanto, con el fin de visualizar con precisión la morfología y cuantificar los cambios en el volumen y la longitud ósea, el tMI debe ser de resolución suficiente para funcionar con los parámetros de escaneo adecuados.
Una limitación de este método es que no todos los anticuerpos primarios son compatibles con la fijación de tejidos y el procesamiento de parafina. En este caso, se puede realizar criosección de tejido congelado estándar para garantizar la integridad del antígeno primario de anticuerpos11. La criosección también elimina la necesidad del paso de descalcificación, sin embargo, hemos descubierto que la criosección de dígitos es técnicamente más difícil que la sección de parafina.
Todo el blastema se puede visualizar con un aumento de 10x mediante microscopía de deconvolución y, utilizando el software de cuantificación de imagen adecuado, los resultados de inmunomancha se pueden cuantificar fácilmente. El sondeo de inmunohistoquímica fluorescente para marcadores osteogénicos del dígito regenerador proporciona una visión única de la diferenciación blastemal a través de la osificación intramembranosa. La tinción inmunohistoquímica revela que la respuesta de regeneración ósea P3 está polarizada y da lugar a la formación ósea organizada de proximal a distal (Figura2). En etapas de regeneración posteriores, los osteoblastos no proliferativos derivados del blastema se localizan adyacentes al muñón óseo y están delimitados disalmente por osteoblastos proliferantes. Los osteoblastos proliferantes, a su vez, están delimitados disalmente por la proliferación de células blastemales indiferenciadas. El sondeo de inmunohistoquímica fluorescente para el marcador de blastema CXCR4 identifica las células blastema tempranas asociadas con la superficie ósea lesionada seguida de una inmunomancha mejorada en etapas de regeneración posteriores (Figura2). El blastema es avascular13 e inmunofluorescencia para el marcador de células endoteliales vWF identifica pocas células positivas dentro de la región blastema (Figura2).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del Laboratorio Muneoka y del Instituto de Medicina Genómica de Texas (TIGM). Este trabajo fue apoyado por la Universidad Texas A&M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
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