Transcranial optisk billeddannelse tillader bred-felt billeddannelse af cerebrospinalvæske transport i cortex af levende mus gennem en intakt kraniet.
Cerebrospinalvæske (CSF) flow i gnavere er stort set blevet undersøgt ved hjælp af ex vivo kvantificering af røbestoffer. Teknikker såsom to-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI) har aktiveret in vivo kvantificering af CSF flow, men de er begrænset af reduceret billeddannelse volumen og lav rumlig opløsning, hhv. Nylige arbejde har fundet, at CSF ind i hjernen parenkym gennem et netværk af perivaskulære rum omkring de piale og penetratere arterier af gnaver cortex. Denne perivaskulære indtræden af CSF er en primær drivkraft for det glymphatiske system, en vej, der er impliceret i clearance af giftige metaboliske opløfter (f. eks. amyloid-β). Her illustrerer vi en ny makroskopisk billedbehandlings teknik, der giver mulighed for realtids, mesoskopisk billeddannelse af fluorescerende CSF-røbestoffer gennem det intakte dødningehoved af levende mus. Denne minimalt-invasive metode letter en lang række eksperimentelle designs og muliggør en enkelt eller gentagen testning af CSF dynamik. Macroscopes har høj rumlig og tidsmæssig opløsning, og deres store Gantry og arbejdsdistance giver mulighed for billeddannelse, mens de udfører opgaver på adfærdsmæssige enheder. Denne billeddannelses metode er blevet valideret ved hjælp af to-foton billeddannelse, og fluorescens målinger opnået fra denne teknik er stærkt korrelerer med ex vivo fluorescens og kvantificering af radiomærkede røbestoffer. I denne protokol beskriver vi, hvordan transcranial makroskopisk billeddannelse kan anvendes til at evaluere glyfatisk transport i levende mus, hvilket giver et tilgængeligt alternativ til dyrere billedbehandlings metoder.
Cerebrospinalvæske (CSF) bader hjernen og rygmarven og er involveret i at opretholde homøostase, levering af næringsstoffer, og regulere intrakranielt tryk1. CSF i subarachnoid rummet kommer ind i hjernen gennem et netværk af perivaskulære rum (PVS) omgivende kortikale piale arterier og derefter strømmer ned langs penetrering arterioler2. En gang i parentchyma, CSF udvekslinger med interstitiel væske (ISF), transporterer skadelige metabolitter såsom amyloid-β (Aβ) og Tau protein aggregater ud af hjernen gennem lav modstand hvidt stof skrifter og perivenøse rum2,3 . Denne vej er afhængig af astroglial aquaporin-4 (AQP4) kanaler og er derfor blevet kaldt glial-lymphatic (glymphatic) system4. Affaldsprodukter af neuropil er i sidste ende ryddet fra CSF-ISF gennem lymfe skibe nær kranielle nerver og i meninges ud mod de cervikale lymfeknuder5. Svigt af dette system har været impliceret i flere neurologiske sygdomme som Alzheimers sygdom6,7, traumatisk hjerneskade3, og iskæmisk og hæmoragisk slagtilfælde8.
CSF transport kan visualiseres ved at inficere røbestoffer i Cisterna Magna (cm)9,10 og glymfatiske undersøgelser i fortiden har hovedsagelig udnyttet to-foton mikroskopi4,11,12, 13, magnetisk resonans imaging (MRI) 14,15,16,17og ex vivo Imaging3,6,11, 18 for at evaluere Tracer kinetik. To-foton mikroskopi er en egnet metode til detaljeret billeddannelse af CSF røbestoffer i pvss og parenkym på grund af sin høje rumlige opløsning, men det har et snævert synsfelt og kræver en invasiv kraniel vindue eller udtynding af kraniet. Ex vivo-billeddannelse, i kombination med immun histokemi, muliggør analyser i flere niveauer, som spænder fra enkeltceller op til hele hjernen19. Men processen med perfusion-fiksering, der er nødvendig for at observere post mortem-væv producerer dybtgående ændringer i CSF flowretning og kollapser PVS, betydeligt ændre fordelingen og placeringen af røbestoffer12. Endelig, mens MRI kan spore CSF flow i hele murine og menneskelige hjerne, det mangler rumlig og tidsmæssig opløsning af perivaskulære flow.
En ny teknik, transcranial macroskopisk billeddannelse, løser nogle af disse begrænsninger ved at muliggøre vidfelt Imaging af perivaskulær CSF transport i hele rygbarken af levende mus. Denne type billeddannelse udføres med et epifluorescerende makroskop ved hjælp af en multi bånds filter kube, en tunbar LED-lyskilde og et højeffektivt CMOS-kamera10. Disse set-ups er i stand til at løse PVSs op til 1-2 mm under kraniets overflade og kan detektere fluorophorer op til 5-6 mm under den kortikale overflade, mens de forlader kraniet helt intakt10. Multiband filtre og lysdioder, der hurtigt kan finjustere excitation bølgelængde gør det muligt at bruge flere fluorophorer tillader CSF at blive mærket med røbestoffer af forskellige molekylvægt og kemiske egenskaber i samme eksperiment.
Denne procedure kræver en enkel, minimalt invasiv operation for at udsætte kraniet og placere en letvægts hovedplade for at stabilisere hovedet under billedbehandlings sessionen. Røbestoffer kan leveres i cm uden boring i kraniet eller trænge ind i det kortikale væv med pipetter eller kanyle9,20. Både CM-kanyle og hovedplader forbliver stabile i flere dage til uger og letter mere komplekse eksperimentelle design sammenlignet med den klassiske endepunkts visualisering. Denne protokol beskriver, hvordan transcranial macroskopisk billeddannelse anvendes til at studere glymphatiske systemfunktion efter akut eller kronisk injektion af fluorescerende CSF Tracer i CM af bedøvet/sovende eller vågen mus.
Vi har beskrevet en detaljeret protokol til udførelse af transcranial CSF Imaging i levende mus ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende makroskoper og Tracers. Denne teknik er enkel og minimalt-invasiv, men kvantitativ. In vivo Imaging korrelerer godt med følsomme metoder såsom flydende scintillationstælling af radiomærkede røbestoffer, herunder 3H-dextran og 14C-inulinsirup efter cm levering, og med ex vivo koronalsektion Section kvantificering10, <…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 og RF1AG057575 til MN), Fondation Leducq transatlantiske net of Excellence-programmet og EU Horizon 2020-programmet for forskning og innovation (Grant nr. 666881; SVDs @ Target). Vi vil også gerne takke Dan Xue for eksperthjælp med grafiske illustrationer.
0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
Xylazine | University of Rochester Vivarium |