वयस्क मानव मस्तिष्क से मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों को तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल झिल्ली आवेषण का उपयोग कर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया टुकड़ा संस्कृति विधि की एक भिन्नता है. यह सरल, लागत प्रभावी है, और अल्पकालिक परख उम्र से जुड़े मस्तिष्क रोगों के पीछे neurodegeneration के तंत्र को जानने के उद्देश्य से चलाने के लिए सिफारिश की.
Organotypic, या टुकड़ा संस्कृतियों, व्यापक रूप से इन विट्रो में कार्य कर रहे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के मॉडल पहलुओं के लिए नियोजित किया गया है. तंत्रिका विज्ञान में टुकड़ा संस्कृतियों की क्षमता के बावजूद, वयस्क तंत्रिका ऊतक का उपयोग कर ऐसी संस्कृतियों को तैयार करने के अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं, विशेष रूप से मानव विषयों से उन. वयस्क मानव ऊतक का उपयोग टुकड़ा संस्कृतियों तैयार करने के लिए विशेष रूप से मानव neuropathologies की समझ को बढ़ाने के लिए आकर्षक है, के रूप में वे परिपक्व मानव मस्तिष्क कृंतक से उत्पादित स्लाइस में कमी के विशिष्ट अद्वितीय गुण पकड़ (आमतौर पर नवजात) तंत्रिका ऊतक. इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मस्तिष्क ऊतक जीवित मानव दाताओं से एकत्र करने के लिए अल्पकालिक, मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों तैयार करने के लिए resective मस्तिष्क सर्जरी के लिए प्रस्तुत किया. इन संस्कृतियों का उपयोग कर जैव रासायनिक और कोशिका जीव विज्ञान परख को बनाए रखने और निष्पादित करने की प्रक्रियाएं भी प्रस्तुत की जाती हैं। प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शित करता है कि ठेठ मानव cortical लेमिनेशन इन विट्रो में 4 दिनों के बाद स्लाइस में संरक्षित है (DIV4), मुख्य तंत्रिका कोशिका प्रकार की उम्मीद उपस्थिति के साथ. इसके अलावा, DIV4 में स्लाइस मजबूत सेल मौत से गुजरना जब एक विषाक्त उत्तेजना के साथ चुनौती दी (एच2हे2 2),सेल मौत परख में एक मंच के रूप में सेवा करने के लिए इस मॉडल की क्षमता का संकेत. इस विधि, झिल्ली आवेषण का उपयोग कर व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विकल्प, मुख्य रूप से उम्र से जुड़े मस्तिष्क रोगों के पीछे neurodegeneration के तंत्र को जानने के उद्देश्य से अल्पकालिक परख चलाने के लिए सिफारिश की है. अंत में, हालांकि प्रोटोकॉल फार्माकोप्रतिरोधी अस्थायी पालि मिर्गी के शल्य चिकित्सा उपचार के लिए प्रस्तुत रोगियों से एकत्र cortical ऊतक का उपयोग करने के लिए समर्पित है, यह तर्क दिया है कि ऊतक अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से एकत्र / इसी तरह के मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों का उत्पादन करने के लिए स्रोतों के रूप में माना जाता है।
अनुसंधान में मानव नमूनों का उपयोग स्पष्ट रूप से मानव मस्तिष्क रोगों का अध्ययन करने के लिए एक बढ़िया विकल्प है, और आधुनिक तकनीकों रोगी व्युत्पन्न ऊतक का उपयोग कर मजबूत और नैतिक प्रयोग के लिए नए तरीके खोल दिया है. वयस्क मानव मस्तिष्क से तैयार organotypic / टुकड़ा संस्कृतियों की तरह तरीकों तेजी से इस तरह के optogenetics1, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी2,3,4,5, plasticity के रूप में प्रतिमानों में इस्तेमाल किया गया है 6,7,8,9, न्यूरोटॉक्सिसिटी / औषध जांच15,16,17, आनुवंशिकी और जीन संपादन12,18,19,20, अन्य के लिए एक रणनीति के रूप में , बेहतर करने के लिए एक रणनीति के रूप में वयस्कता के दौरान स्नायविक रोगों को समझना.
मानव मस्तिष्क रोगों अंतर्निहित तंत्र की समझ प्रयोगात्मक रणनीतियों है कि विषयों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता पर निर्भर करता है. इसके विपरीत, टुकड़ा संस्कृतियों के मामले में, हालांकि मानव नमूनों के लिए उपयोग अभी भी मुश्किल है, एक भी cortical नमूना से 50 स्लाइस पैदा करने की संभावना आंशिक रूप से कई स्वयंसेवकों की भर्ती की आवश्यकता को दरकिनार प्रतिकृति की संख्या और एकत्र ऊतक21प्रति परख प्रदर्शन किया .
मस्तिष्क organotypic/ टुकड़ा संस्कृतियों के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, शास्त्रीय oculo ड्राफ्ट से लेकर22,23 रोलर ट्यूब24,25,26, अर्द्ध पारगम्य झिल्ली इंटरफ़ेस27,28,29,30, और मुक्त चल स्लाइस31,32. एक प्रयोगात्मक डिजाइन की विशेषताओं पर निर्भर करता है, प्रत्येक तकनीक अपने स्वयं के फायदे और नुकसान है. अल्पकालिक, मुक्त चल वयस्क मानव दिमाग से स्लाइस संस्कृतियों कुछ मामलों में Stoppini एट अल द्वारा इस्तेमाल किया विधि पर फायदेमंद है27,अगर तथ्य यह है कि हालांकि इन विट्रो में लंबी अवधि के सेल अस्तित्व आमतौर पर एक प्रमुख चिंता का विषय है जब मूल्यांकन अनेक प्रयोगों में संस्कृति में केवल अल्प समय की आवश्यकता होती है12,31,32,33,34,35. इन शर्तों के तहत, मुक्त चल संस्कृतियों का उपयोग सरल और अधिक लागत प्रभावी होने का लाभ प्रस्तुत करता है, साथ ही अधिक सही 2-3 सप्ताह से अधिक संस्कृति में रखा स्लाइस से मूल मानव ऊतक हालत जैसी.
तंत्रिका विज्ञान के लिए टुकड़ा संस्कृतियों की क्षमता के बावजूद, वयस्क तंत्रिका ऊतक का उपयोग कर ऐसी संस्कृतियों को तैयार करने के अध्ययन अभी भी दुर्लभ हैं, विशेष रूप से मानव विषयों से. यह लेख मुक्त चल टुकड़ा संस्कृतियों को तैयार करने के लिए resective मस्तिष्क सर्जरी के लिए प्रस्तुत मानव दाताओं से एकत्र मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. इन संस्कृतियों का उपयोग कर जैव रासायनिक और सेल जीव विज्ञान परख को बनाए रखने और प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण है। इस प्रोटोकॉल वयस्कता से जुड़े neuropathologies के तंत्र पर जांच में व्यवहार्यता और न्यूरॉन समारोह का विश्लेषण करने के लिए मूल्यवान साबित किया गया है.
मुक्त चल, अल्पकालिक टुकड़ा संस्कृतियों के उत्पादन के लिए यह प्रोटोकॉल वयस्क मानव neocortical स्लाइस culturing के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. स्लाइस संस्कृतियों के लिए इस तरह के एक प्रोटोकॉल पर अध्ययन के लिए अनुकूल हो…
The authors have nothing to disclose.
यह काम FAPESP (अनुदान 25681-3/2017 से AS), CAPES (पोस्ट-डॉक्टरल फैलोशिप PNPD/INCT-HSM द्वारा A.F. और पूर्व-डॉक्टरल फैलोशिप N.D.M. को) और FAEPA द्वारा समर्थित है। G.M.A. FAPESP (MS 2018/06614-4) से मास्टर की फेलोशिप रखता है। एन.जी.सी. एक सीएनपीक्यू रिसर्च फैलोशिप रखती है। हम इस अध्ययन के लिए resected ऊतकों दान के लिए रोगियों और उनके परिवारों को धन्यवाद. हम निवासियों, नर्सों, तकनीशियनों, और CIREP टीम के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं, Ribeiro प्रीटो मेडिकल स्कूल, साओ पाउलो विश्वविद्यालय, जो इस प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में मदद की पर नैदानिक अस्पताल से.
2-Propanol | Merck | 1096341000 | |
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution | Sigma Aldrich | A3449 | |
Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) | Santa Cruz Biotecnology | sc-154 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
Antibody anti-pERK (mouse) | Santa Cruz Biotecnology | sc-7383 | Dilution 1:1,000 in BSA 2.5% |
B27 | Gibco | 17504-044 | |
BDNF | Sigma Aldrich | SRP3014 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 500-0205 | |
EDTA | Sigma | T3924 | Used in RIPA buffer |
Glucose | Merck | 108337 | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
Hank's Balanced Salts | Sigma Aldrich | H1387-10X1L | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
Hydrogen Peroxide (H2O2) | Vetec | 194 | |
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) | GE | NA931-1ML | |
NaCl | Merck | 1064041000 | Used in RIPA buffer |
Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
Non-fat dry milk (Molico) | Nestlé | Used for membrane blocking | |
PBS Buffer pH 7,2 | Laborclin | 590338 | |
Penicilin/Streptomicin | Sigma Aldrich | P4333 | |
Potassium Chloride | Merck | 1049361000 | |
Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
SDS | Sigma | L5750 | Used in RIPA buffer |
TEMED | GE | 17-1312-01 | |
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma Aldrich | M5655 | |
Tris | Sigma | T-1378 | Used in RIPA buffer |
Triton x-100 | Sigma | X100 | Used in RIPA buffer |
Ultrapure Water | Millipore | Sterile water, derived from MiliQ water purification system | |
Equipment and Material | |||
24-well plates | Corning | CL S3526 | Flat Bottom with Lid |
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane) | GE | 29047575 | |
Carbogen Mixture | White Martins | 95% O2, 5% CO2 | |
CO2 incubator | New Brunswick Scientific | CO-24 | Incubation of slices 5% CO2, 36ºC |
Microplate Reader | Molecular Devices | ||
Microtubes | Greiner | 001608 | 1,5mL microtube |
Motorized pestle | Kimble Chase | ||
Plastic spoon | Size of a dessert spoon | ||
Razor Blade | Bic | Chrome Platinum, used in slicing with vibratome | |
Scalpel Blade | Becton Dickinson (BD) | Number 24 | Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller |
Superglue (Loctite Super Bonder) | Henkel | Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer | |
Vibratome | Leica | 14047235612 – VT1000S | |
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry | |||
Antibody anti-NeuN (mouse) | Millipore | MAB377 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-GFAP (mouse) | Merck | MAB360 | Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer |
Antibody anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | EPR16588 – ab178846 | Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer |
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) | Vector | BA-9200 | |
DAB | Sigma Aldrich | D-9015 | |
Entellan | Merck | 107960 | |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
Gelatin | Synth | 00G1002.02.AE | Used for coating slides |
Microtome | Leica | SM2010R | Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 158127 | |
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) | GE | NA934-1ML | |
Slides (Star Frost) | Knittel Glaser | Gelatin coated slides | |
Sucrose | Vetec | 60REAVET017050 | |
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vector | PK-4000, Kit Standard | |
Xylene | Synth | 01X1001.01.BJ |