Summary

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Published: November 05, 2019
doi:

Summary

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Abstract

Organotypic, ou culturas da fatia, foram empregados extensamente para modelar aspectos do sistema nervoso central que funciona in vitro. Apesar do potencial das culturas de fatias na neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente os de seres humanos. O uso do tecido humano adulto para preparar culturas da fatia é particular atrativo realçar a compreensão de neuropatologias humanas, porque prendem as propriedades originais típicas do cérebro humano maduro que falta nas fatias produzidas do roedor (geralmente neonatal) tecido nervoso. Este protocolo descreve como usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias de curto prazo e flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas também são apresentados. Os resultados representativos demonstram que a laminação cortical humana típica está preservada nas fatias após 4 dias in vitro (DIV4), com presença prevista dos tipos principais da pilha neural. Além disso, as fatias no DIV4 passam por uma morte celular robusta quando desafiadas com um estímulo tóxico (H2O2),indicando o potencial deste modelo para servir como uma plataforma em ensaios de morte celular. Este método, uma alternativa mais simples e econômica ao protocolo amplamente utilizado usando inserções de membrana, é recomendado principalmente para a execução de ensaios de curto prazo destinados a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade. Finalmente, embora o protocolo seja dedicado ao uso de tecido cortical coletado de pacientes submetidos ao tratamento cirúrgico da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente, argumenta-se que o tecido coletado de outras regiões/condições cerebrais também deve ser consideradas como fontes para produzir culturas similares da fatia livre-flutuando.

Introduction

O uso de amostras humanas na pesquisa é inequivocamente uma ótima opção para estudar patologias cerebrais humanas, e técnicas modernas abriram novas maneiras de experimentação robusta e ética usando tecido derivado do paciente. Métodos como culturas organotípicas/fatias preparadas a partir do cérebro humano adulto têm sido cada vez mais utilizados em paradigmas como optogenética1,eletrofisiologia2,3,4,5, plasticidade 6,7,8,9, neurotoxicidade/neuroproteção10,11,12,13,terapia celular14, triagem de drogas15,16,17, genética e edição de genes12,18,19,20,entre outros, como estratégia para melhor compreender doenças neurológicas durante a idade adulta.

A compreensão dos mecanismos subjacentes às patologias cerebrais humanas depende de estratégias experimentais que exigem um grande número de sujeitos. Por outro lado, no caso de culturas de fatias, embora o acesso a amostras humanas ainda seja difícil, a possibilidade de gerar até 50 fatias de uma única amostra corticana contorna parcialmente a exigência de recrutamento de múltiplos voluntários, aumentando número de réplicas e ensaios realizados por tecido coletado21.

Vários protocolos para culturas organotípicas/fatias cerebrais foram descritos, que vão desde os rascunhos clássicos de oculo22,23 até tubo de rolo24,25,26,membranas semipermeáveis interface27,28,29,30,e fatias flutuantes31,32. Dependendo das particularidades de um projeto experimental, cada técnica tem suas próprias vantagens e desvantagens. A curto prazo, as culturas de fatias de flutuação livre de cérebros humanos adultos é, em alguns casos, vantajosa sobre o método usado por Stoppini et al.27, se considerar o fato de que, embora a sobrevivência celular a longo prazo in vitro é geralmente uma grande preocupação ao avaliar um método de cultura, em muitos experimentos apenas curtos períodos de tempo na cultura são necessários12,31,32,33,34,35. Nestas circunstâncias, o uso de culturas free-floating apresenta a vantagem de ser mais simples e mais eficaz na redução de custos, assim como assemelhando-se mais exatamente à condição humana original do tecido do que as fatias mantidas na cultura sobre 2-3 semanas.

Apesar do potencial das culturas de fatia para a neurociência, estudos usando tecido nervoso adulto para preparar tais culturas ainda são escassos, particularmente de seres humanos. Este artigo descreve um protocolo para usar o tecido cerebral coletado de doadores humanos vivos submetidos a cirurgia cerebral ressectiva para preparar culturas de fatias flutuantes. Procedimentos para manter e realizar ensaios bioquímicos e de biologia celular usando essas culturas são detalhados. Este protocolo foi provado valioso para analisar a viabilidade e a função neuronal nas investigações nos mecanismos das neuropatologias lig à idade adulta.

Protocol

Tecidos cerebrais adultos vivos foram obtidos de pacientes submetidos a neurocirurgia resectiva para o tratamento da epilepsia do lobo temporal farmacoresistente (Figura 1A). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital de Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto (17578/2015), e os pacientes (ou sua pessoa responsável legal) concordaram e assinaram os termos de consentimento informado. A coleta do tecido foi feita pela equipe de neuroc…

Representative Results

Um aspecto crítico para avaliar a qualidade e a saúde das fatias cultivadas é a presença e morfologia típica dos tipos esperados de células neurais, neurônios e células gliais. A arquitetura típica da laminação cortical humana foi observada em uma fatia em DIV4, revelada pela imunorotulagem neuronal (Figura 2D). Além disso, também foi observada a presença esperada de microglia e astroglia (Figura 2B,C). Esses resul…

Discussion

Este protocolo para a produção de culturas de fatias de curto prazo flutuantes e de curto prazo é um método alternativo para cultivar fatias neocorticas humanas adultas. Tal protocolo para culturas de fatia pode ser passível de estudos sobre (mas não restrito a) optogenética1,44,45, eletrofisiologia2,3,4,<sup class="xr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pela FAPESP (Grant 25681-3/2017 para AS), CAPES (Bolsa de Pós-Doutorado PNPD/INCT-HSM para A.F. e bolsa de pré-doutorado para N.D.M.) e FAEPA. A G.M.A. possui uma bolsa de mestrado da FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. é dona de uma Bolsa de Pesquisa cnpq. Agradecemos aos pacientes e suas famílias por doarem os tecidos ressecados para este estudo. Gostaríamos de reconhecer o apoio de moradores, enfermeiros, técnicos e da equipe do CIREP, do Hospital Clínico da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, que ajudou em diversas etapas do processo.

Materials

2-Propanol Merck 1096341000
Acrylamide/Bis-Acrylamide, 30% solution Sigma Aldrich A3449 
Agarose Sigma Aldrich A9539
Ammonium persulfate Sigma A3678-25G
Amphotericin B Gibco 15290-018
Antibody anti-ERK 2 (rabbit) Santa Cruz Biotecnology sc-154 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
Antibody anti-pERK (mouse) Santa Cruz Biotecnology sc-7383 Dilution 1:1,000 in BSA 2.5%
B27 Gibco 17504-044
BDNF Sigma Aldrich SRP3014
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Bradford 1x Dye Reagent BioRad 500-0205
EDTA Sigma T3924 Used in RIPA buffer
Glucose Merck 108337
Glutamax Gibco 35050-061
Hank's Balanced Salts Sigma Aldrich H1387-10X1L
Hepes Sigma Aldrich H4034
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Hydrogen Peroxide (H2O2) Vetec 194
Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (anti-mouse) GE NA931-1ML
NaCl Merck 1064041000 Used in RIPA buffer
Neurobasal A Gibco 10888-022
Non-fat dry milk (Molico) Nestlé Used for membrane blocking
PBS Buffer pH 7,2 Laborclin 590338
Penicilin/Streptomicin Sigma Aldrich P4333
Potassium Chloride Merck 1049361000
Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
SDS Sigma L5750 Used in RIPA buffer
TEMED GE 17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) Sigma Aldrich M5655
Tris Sigma T-1378 Used in RIPA buffer
Triton x-100 Sigma X100 Used in RIPA buffer
Ultrapure Water Millipore Sterile water, derived from MiliQ water purification system
Equipment and Material
24-well plates Corning CL S3526 Flat Bottom with Lid
Amersham Potran Premium (nitrocellulose membrane)  GE 29047575
Carbogen Mixture White Martins 95% O2, 5% CO2
CO2 incubator New Brunswick Scientific CO-24 Incubation of slices 5% CO2, 36ºC
Microplate Reader Molecular Devices
Microtubes Greiner 001608 1,5mL microtube
Motorized pestle Kimble Chase
Plastic spoon Size of a dessert spoon
Razor Blade Bic Chrome Platinum, used in slicing with vibratome
Scalpel Blade Becton Dickinson (BD) Number 24 Used for slicing of tissue; recommended same size or smaller
Superglue (Loctite Super Bonder) Henkel Composition: Etilcianoacrilato; 2-Propenoic acid; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresol; homopolymer
Vibratome  Leica 14047235612 – VT1000S
Name of Material/ Equipment for Immunohistochemistry
Antibody anti-NeuN (mouse) Millipore  MAB377 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-GFAP (mouse) Merck MAB360 Dilution 1:1,000 in Phosphate Buffer
Antibody anti-Iba1 (rabbit) Abcam EPR16588 – ab178846 Dilution 1:2,000 in Phosphate Buffer
Biotinylated anti-mouse IgG Antibody (H+L) Vector BA-9200
DAB Sigma Aldrich D-9015
Entellan Merck 107960
Ethanol Merck 1.00983.1000
Gelatin Synth 00G1002.02.AE Used for coating slides
Microtome Leica SM2010R Equipped with Freezing Stage (BFS-10MP, Physiotemp), set to -40ºC
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127
Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (anti-rabbit) GE NA934-1ML
Slides (Star Frost) Knittel Glaser Gelatin coated slides
Sucrose Vetec 60REAVET017050
Vectastain ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) Vector PK-4000, Kit Standard
Xylene Synth 01X1001.01.BJ

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Fernandes, A., Mendes, N. D., Almeida, G. M., Nogueira, G. O., Machado, C. d. M., Horta-Junior, J. d. A. d. C., Assirati Junior, J. A., Garcia-Cairasco, N., Neder, L., Sebollela, A. Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain. J. Vis. Exp. (153), e59845, doi:10.3791/59845 (2019).

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