Her beskrives et antistoffri in vitro-assay til direkte analyse af methyltransferase-aktivitet på syntetisk eller in vitro transkriberet RNA.
Der er mere end 100 kemisk adskilte modifikationer af RNA, hvoraf to tredjedele består af methyleringer. Interessen for RNA-modifikationer, og især methyleringer, er dukket op igen på grund af de vigtige roller, som de enzymer, der skriver og sletter dem i biologiske processer, som er relevante for sygdom og kræft, har spillet. Her er der en følsom in vitro-analyse til præcise analyser af RNA-methylerings skribent aktivitet på syntetisk eller in vitro transkriberet RNAs. Denne analyse bruger en i form af S-adenosyl-methionin, hvilket resulterer i direkte mærkning af methyleret RNA med tritium. Den lave energi af tritium stråling gør metoden sikker, og præ-eksisterende metoder til tritium signal forstærkning, gør det muligt at kvantificere og visualisere det methylerede RNA uden brug af antistoffer, som er almindeligt tilbøjelige til artefakter. Mens denne metode er skrevet til RNA methylering, få tweaks gøre det gældende for studiet af andre RNA modifikationer, der kan radioaktivt mærket, såsom RNA acetylering med 14C acetyl coenzym A. samlet, denne analyse gør det muligt hurtigt at vurdere RNA methylering betingelser, hæmning med små molekyle hæmmere, eller virkningen af RNA eller enzym mutanter, og giver et kraftfuldt værktøj til at validere og udvide resultater opnået i cellerne.
DNA, RNA og proteiner er genstand for ændringer, der stramt regulerer genekspression1. Blandt disse modifikationer forekommer methyleringer på alle tre biopolymere. DNA og protein methyleringer har været meget godt undersøgt i de sidste tre årtier. I modsætning hertil er interessen for RNA-methylering først for nylig blevet opildnet i lyset af de vigtige roller, som proteiner, der skriver, sletter eller binder RNA-methyleringer, spiller i udvikling og sygdom2. Ud over bedre kendte funktioner i rigelige ribosomale og overføre RNAs, RNA methylering veje regulerer specifikke Messenger RNA stabilitet3,4, splejsning5 og oversættelse6,7, Mirna behandler8,9 og transkriptional pauser og frigiver10,11.
Her rapporteres en enkel og robust metode til in vitro-verifikation af RNA-methyltransferase-aktiviteten ved fastsættelsen af et molekylær biologi laboratorium (opsummeret i figur 1). Mange undersøgelser vurderer aktiviteten af en RNA-methyltransferase gennem dot-blot med et antistof mod RNA-ændringen af interesse. Dot-blot verificerer dog ikke RNA-integriteten ved inkubation med RNA-methyltransferase. Dette er vigtigt, fordi selv mindre forureninger af rekombinante proteiner med nukleaser kan føre til delvis RNA nedbrydning og forstyrrende resultater. Desuden kan selv meget specifikke RNA modifikation antistoffer genkende umodificerede RNAs med specifikke sekvenser eller strukturer. Den in vitro-RNA-methyltransferase-analyse, der rapporteres her, udnytter det faktum, at S-adenosyl methionin kan tritieres på methylgruppe donor (figur 1), hvilket gør det muligt at registrere det methylerede RNA nøjagtigt uden brug af antistoffer . Instruktioner er fastsat til in vitro transskription og rensning af en udskrift af interesse og afprøvning af methylering af nævnte afskrift af enzymet af interesse. Denne metode er fleksibel og robust, og kan justeres i henhold til behovene i et givet projekt. For eksempel, in vitro transkriberet og renset RNAs, kemisk syntetiseret RNAs, men også cellulære RNAs kan anvendes. Denne analyse giver kvantitative oplysninger i form af scintillationstal, samt kvalitative oplysninger ved at vise, hvor præcis det methylerede RNA kører på en gel. Dette kan give unik indsigt i funktionen af en RNA-methyltransferase, især når du bruger cellulære RNAs som et substrat, da det giver en metode til direkte at observere størrelsen af RNA eller RNAs, der er målrettet til methylering.
Her rapporteres en enkel og robust metode til in vitro-verifikation af RNA-methyltransferase-aktiviteten i retning af specifikke transskriptioner. Analysen udnytter det faktum, at S-adenosyl methionin kan tritieres på methylgruppe donor (figur 1), hvilket gør det muligt at detekteres det METHYLEREDE RNA nøjagtigt uden brug af antistoffer. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne analyse ikke kan indikere, hvilken restkoncentration eller kemisk gruppe der er methyleret af enzymet. For at i…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Turja Kanti Debnath for hans hjælp med ChemDraw. Forskning i Xhemalçe Lab understøttes af Department of Defense-Congressionally instrueret Medical Research program-brystkræft gennembrud Award (W81XWH-16-1-0352), NIH Grant R01 GM127802 og start-up midler fra Institute of Cellular og Molekylær biologi og College of Natural Sciences ved University of Texas i Austin, USA.
10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |