RNA 메틸 트랜스퍼라제 활성 분석을 위한 항체 무첨가 분석

Summary

여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 메틸트랜스퍼라제 활성의 직접 분석을 위한 항체-무체질 시험관내 분석이 기재되어 있다.

Abstract

RNA의 100개 이상의 화학적으로 명백한 수정이 있습니다, 그 중 2/3는 메틸화로 이루어져 있습니다. RNA 수정, 특히 메틸화에 대한 관심은 질병과 암과 관련된 생물학적 과정에서 효소를 쓰고 지우는 중요한 역할로 인해 다시 나타났습니다. 여기서, 합성 또는 시험관내 전사 RNA에 대한 RNA 메틸화 기활성의 정확한 분석을 위한 민감한 시험관내 분석이 제공된다. 이 분석은 삼각형태인 S-아데노실-메티오닌을 사용하며, 그 결과 메틸화된 RNA를 트리튬으로 직접 라벨링합니다. 삼중수소 방사선의 낮은 에너지는 이 방법을 안전하고 기존의 삼중수소 신호 증폭 방법을 가능하게 하며, 일반적으로 유물에 걸리기 쉬운 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정량화하고 시각화할 수 있게 합니다. 이 방법은 RNA 메틸화를 위해 쓰여진 동안, 몇몇 비틀기는 ¹⁴C 아세틸 코엔자임 A를 가진 RNA 아세틸화와 같은 방사성으로 표지될 수 있는 그밖 RNA 수정의 연구 결과에 적용가능하게 합니다, 이 분석법은 RNA를 빨리 평가할 수 있습니다 메틸화 조건, 소분자 억제제로 억제, 또는 RNA 또는 효소 돌연변이체의 효과, 세포에서 얻은 결과를 검증하고 확장할 수 있는 강력한 도구를 제공한다.

Introduction

DNA, RNA 및 단백질은 유전자 발현을엄격하게 조절하는 변형의 대상이 된다 1. 이러한 수정 중, 메틸화는 세 가지 생체 고분자 모두에 발생합니다. DNA와 단백질 메틸화는 지난 3년간 아주 잘 연구되었습니다. 대조적으로, RNA 메틸화에 대한 관심은 최근에 RNA 메틸화를 쓰거나 지우거나 결합하는 단백질이 발달 및 질병^2에서재생하는 중요한 역할에 비추어 재점화되었다. 풍부한 리보좀 및 전사 RNA에서 더 잘 알려진 기능 외에도 RNA 메틸화 경로는특정 메신저 RNA 안정성 3,^4,접합⁵ 및 번역^6,7을조절합니다. miRNA처리 8,⁹ 및 전사 일시 중지 및 릴리스^10,11.

여기서, 분자 생물학 실험실의 설정에서 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다(도 1에요약). 많은 연구는 관심의 RNA 수정에 대하여 항체를 가진 점 얼룩을 통해 RNA 메틸 트랜스퍼라제의 활동을 평가합니다. 그러나, 도트-블롯은 RNA 메틸트랜스퍼라제와 배양시 RNA의 무결성을 검증하지 않는다. 이것은 중요 하기 때문에 뉴클레아제와 재조합 단백질의 사소한 오염 부분 RNA 저하 및 혼란 결과 이어질 수 있습니다. 더욱이, 고도로 특이적인 RNA 변형 항체조차도 특정 서열 또는 구조를 가진 수정되지 않은 RNA를 인식할 수 있다. 여기서 보고된 시험관내 RNA 메틸트랜스퍼라제 분석서는 S-아데노실 메티오닌이 메틸군 공여자에 삼각화될수 있다는 사실을 활용한다(그림 1), 항체를 사용하지 않고 메틸화된 RNA를 정확하게 검출할 수 있도록 함 . 지시서는 관심 있는 효소에 의해 말의 전사체의 메틸화및 시험의 생체외 전사 및 정제를 위해 제공된다. 이 방법은 유연하고 견고하며 주어진 프로젝트의 요구에 따라 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 시험관 내에서 전사 및 정제된 RNA, 화학적으로 합성된 RNA, 뿐만 아니라 세포 RNA도 사용될 수 있다. 이 분석법은 메틸화된 RNA가 겔에서 정확히 실행되는 위치를 보여줌으로써 질적 정보뿐만 아니라, 석질 카운트의 형태로 정량적 정보를 제공한다. 이것은 메틸화에 표적으로 하는 RNA RNA 또는 RNA의 크기를 직접 관찰하는 방법을 제공하기 때문에, 특히 세포 RNA를 기질로 사용하는 경우에, RNA 메틸 트랜스퍼라제의 기능에 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Protocol

1. 대상 RNA의 생체 외 전사 및 젤 정제 확립된 분자 복제 기술12 또는 키트를 사용하여 T7 및/또는 SP6 프로모터를 함유하는 플라스미드로 관심 의 순서를 복제합니다. 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿 선형화 앞서 설명한바와같이, 삽입을 통해 T7 프로모터 영역을 포함하도록 설계된 프라이머를 사용하여 플라스미드의 PCR에 의?…

Representative Results

생체 외 에서 전사 반응그림 2 A는 7SK snRNA의 T7 RNA 폴리머라제와의 시험관내 전사 반응으로부터의 전형적인 실행을 나타내며, 이는 비교적 짧은(331 nt) 및 고도로 구조화된 RNA이다. 원시 이미지에 표시된 것처럼, 여러 원치 않는 밴드가 있다, 둘 다 짧고 긴 7SK, 아마 임의의 전사 개시 또는 종료 이벤트에서 발생. 이 때문에, 시험관 내 전사 반응에 따…

Discussion

여기서, 특정 전사체를 향한 RNA 메틸트랜스퍼라제 활성의 시험관내 검증을 위한 간단하고 견고한 방법이 보고된다. 이 분석은 S-아데노실 메티오닌이 메틸 기공체에서 삼각화될 수있다는 사실을 활용합니다(그림 1), 메틸화된 RNA가 항체를 사용하지 않고 정확하게 검출될 수 있도록 한다. 그러나,이 분석효소는 어떤 잔기 또는 화학 기가 효소에 의해 메틸화되어 있는지 나타?…

Materials

10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS	N/A	N/A	For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter.
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes	GE Healthcare	RPN11649	For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter	Beckman	LS6500	For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System	Biorad	1704466	Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Applied Science	4693159001	For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes	Biorad	1656001	Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer	DeNovix	DS-11-S	Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials	Fisher	03-337-1	For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer	Biorad	1651745	For drying gel.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips	Gel Company	NC9431993	For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit	Ambion	AM1333	For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)	Gel staining box.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	For drying gel.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Nucleic acid gel stain.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit	life technologies		Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL)	Ambion	AM2238	For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea	Sigma	51456-500G	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper	GE Healthcare	3030-154	Chromatography paper for drying gel.