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Biochemistry

Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/59914
Automatic Translation
1, 1,2
1Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, 2Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

Le but de ce protocole est de montrer comment utiliser la microscopie lattice Light-Sheet pour visualiser en quatre dimensions la dynamique des récepteurs de surface dans les cellules vivantes. Ici, les récepteurs des lymphocytes T sur les lymphocytes T CD4et primaires sont montrés.

Abstract

La signalisation et la fonction d'une cellule sont dictées par les structures dynamiques et les interactions de ses récepteurs de surface. Pour vraiment comprendre la relation structure-fonction de ces récepteurs in situ, nous devons les visualiser et les suivre sur la surface des cellules vivantes avec une résolution spatiotemporal suffisante. Ici, nous montrons comment utiliser récemment développé Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) pour l'image des récepteurs à cellule T (TCRs) en quatre dimensions (4D, l'espace et le temps) à la membrane cellulaire vivante. Les lymphocytes T sont l'une des principales cellules effectrices du système immunitaire adaptatif, et ici nous avons utilisé les lymphocytes T comme exemple pour montrer que la signalisation et la fonction de ces cellules sont entraînées par la dynamique et les interactions des TCR. LLSM permet une imagerie 4D avec une résolution spatiotemporal sans précédent. Cette technique de microscopie peut donc être généralement appliquée à un large éventail de molécules de surface ou intracellulaires de différentes cellules en biologie.

Introduction

La dynamique précise du trafic et de la diffusion des molécules sur la surface tridimensionnelle des cellules en temps réel a été une énigme à résoudre. La microscopie a toujours été un équilibre de vitesse, de sensibilité et de résolution; si un ou deux sont maximisés, le troisième est minimisé. Par conséquent, en raison de la petite taille et de la vitesse immense avec laquelle les récepteurs de surface se déplacent, le suivi de leur dynamique est resté un défi technologique majeur dans le domaine de la biologie cellulaire. Par exemple, de nombreuses études ont été menées à l'aide de la microscopie interne totale de fluorescence (TIRF)1,2,3, qui a une résolution temporelle élevée, mais ne peut imager qu'une tranche très mince de la membrane des lymphocytes T (100 nm), et manque donc des événements qui se produisent plus loin dans la cellule. Ces images TIRF ne montrent également qu'une section bidimensionnelle de la cellule. En revanche, les techniques de super-résolution, telles que la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM)4, la microscopie de localisation photoactivée (PALM)5, et la microscopie d'épuisement des émissions stimulée (STED)6, peuvent surmonter la limite de diffraction de l'abbéenne de la lumière. Ces techniques ont une résolution spatiale élevée (résolution de 20 nm)4,5,6,7, mais elles prennent souvent de nombreuses minutes pour acquérir une image bidimensionnelle complète (2D) ou tridimensionnelle (3D), et donc la résolution temporelle est perdue. En outre, des techniques telles que STORM et PALM qui reposent sur des signaux clignotants peuvent avoir des inexactitudes dans le comptage8,9. La microscopie électronique a de loin la plus haute résolution (jusqu'à 50 h de résolution)10; il peut même être effectué en trois dimensions avec la microscopie électronique focalisée de balayage de faisceau d'ions (FIB-SEM), ayant pour résultat jusqu'à 3 nm XY et 500 nm Z résolution11. Cependant, toute forme de microscopie électronique nécessite une préparation d'échantillons rigoureux et ne peut être menée qu'avec des cellules ou des tissus fixes, éliminant ainsi la possibilité d'imagerie d'échantillons vivants au fil du temps.

Les techniques pour obtenir la résolution spatiotemporal élevée exigée pour identifier la dynamique des molécules de surface et intracellulaires dans les cellules vivantes dans leur vraie nature physiologique 3D sont seulement récemment développées. Une de ces techniques est Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM)12, qui utilise une feuille de lumière structurée pour réduire considérablement photoblanchiment. Développé en 2014 par le prix Nobel Eric Betzig, la haute résolution axiale, le faible photoblanchiment et le bruit de fond, et la capacité d'imager simultanément des centaines d'avions par champ de vision font des microscopes LLS supérieurs aux microscopes widefield, TIRF et confocal12,13,14,15,16,17,18,19. Cette technique d'imagerie en quatre dimensions (x, y, z et temps), bien que toujours limitée à la diffraction (résolution XYZ de 200 nm), a une résolution temporelle incroyable (nous avons atteint un taux d'image d'environ 100 fps, résultant en une image cellulaire reconstruite en 3D avec 0,85 seconde par image) pour l'acquisition spatiale 3D.

LLSM peut généralement être utilisé pour suivre la dynamique en temps réel de toutes les molécules dans n'importe quelle cellule au niveau monomolécule et unicellulaire, en particulier ceux dans les cellules très motiles telles que les cellules immunitaires. Par exemple, nous montrons ici comment utiliser LLSM pour visualiser la dynamique des récepteurs des lymphocytes T (TCR). Les lymphocytes T sont les cellules effectrices du système immunitaire adaptatif. Les TCR sont chargés de reconnaître les ligands peptide-MHC (pMHC) affichés à la surface des cellules présentant des antigènes (APC), qui déterminent la sélection, le développement, la différenciation, le sort et la fonction d'une cellule T. Cette reconnaissance se produit à l'interface entre les lymphocytes T et les APC, résultant en un regroupement localisé des récepteurs pour former ce qu'on appelle la synapse immunologique. Bien qu'il soit connu que les TCR à la synapse immunologique sont impératifs pour la fonction effector de Cellule T, encore inconnus sont les mécanismes sous-jacents du trafic en temps réel de TCR à la synapse. LLSM nous a permis de visualiser en temps réel la dynamique des TCR avant et après le trafic à la synapse avec l'interaction pMHC-TCR qui en résulte (Figure 1). LLSM peut donc être utilisé pour résoudre les questions actuelles de la dynamique formatrice des TCR et fournir des idées pour comprendre comment une cellule fait la distinction entre l'individu et les antigènes étrangers.

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Protocol

5C. C7 TCR-transgénique RAG2 knock-out souris en B10. Un fond ont été employés dans cette étude selon un protocole approuvé par le comité institutionnel de soin et d'utilisation des animaux de l'université de Chicago.

1. Récolter et activer les lymphocytes T

REMARQUE : Cette partie du protocole est basée sur des protocoles précédents. Voir les citations pour plus de détails20,21.

  1. Euthanasier un 5C de 10-12 semaines. Souris transgénique C7 de l'un ou l'autre sexe (de 20 à 25 g) selon le protocole approuvé de l'IACUC (c.-à-d. la chambre CO2 suivie d'une luxation cervicale).
  2. Vaporiser soigneusement la carcasse de souris avec 70 % d'éthanol pour tremper la fourrure et l'apporter dans une armoire de sécurité BSL-2.
  3. Tournez la souris sur son côté droit et faites une petite incision dans la cavité du corps avec des ciseaux chirurgicaux. Retirez la rate à l'aide de forceps chirurgicaux. Couper le tissu conjonctif au besoin avec des ciseaux chirurgicaux.
  4. Placer la rate dans une passoire à cellules en maille de 70 m m et écraser à l'arrière d'un piston à seringues de 1 ml. Lavez-vous soigneusement à travers la passoire avec le RPMI complet (RPMI avec 10% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM L-glutamine, 1% pénicilline/streptomycine, 50 'M 2-mercaptoethanol).
  5. Centrifugelant la suspension à cellule unique des splenocytes à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant.
    REMARQUE: La pastille à ce stade sera rouge.
  6. Resuspendre les splenocytes dans un tampon de lyse RBC de 5 mL. Incuber 5 min, puis étancher avec 5 ml de RPMI complet.
  7. Centrifugelant la suspension à cellule unique des splenocytes à 300 x g pendant 5 min. Jetez le supernatant.
    REMARQUE: La pastille à ce stade doit être blanche, pas rouge.
  8. Resuspendre la pastille en 5 ml de RPMI complet.
  9. Transférer dans un flacon T-25 et ajouter 10 m cytochrome-C (MCC, séquence ANERADLIAYLKQATK). Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 oC, 5 % de CO2 pendant la nuit.
  10. Le lendemain, ajouter la souris recombinante IL-2 à une concentration finale de 100 U/mL.
  11. Observez pour les jours suivants, ajoutant des médias frais que les médias actuels devient jaune. Les lymphocytes T mourront s'ils sont laissés dans des médias jaunes sans surveillance pendant plus de 48 h. Les cellules sont prêtes à être utilisées 6 à 10 jours après la récolte.

2. Préparer les cellules

  1. Incuber les couvercles ronds de 5 mm avec 0,1 % de polylysine pendant 10 min. Aspirate et laisser sécher naturellement.
  2. Utilisez un réactif de gradient de densité (voir le Tableau des matériaux) pour séparer les cellules mortes et obtenir 1 x 106 lymphocytes T et 1 x 106 APC (CH27 cellules21,22 transduced with cytosolic mCherry) séparément.
    REMARQUE : Les cellules sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre.
    1. Ajouter 3 ml de réagent de gradient de densité à un tube conique de 15 ml et ajouter les cellules dans le sens goutte à bord du tube avec soin. Ne pas mélanger. Centrifugeuse à 930 x g pendant 10 min à 4 oC; l'accélération/décélération : SLOW/SLOW. Enlever soigneusement la fine couche moyenne des cellules entre le milieu complet et le gradient de densité, en plaçant chaque type de cellule dans des tubes coniques séparés.
      REMARQUE: Il est nécessaire de préparer plus de cellules que nécessaire pour l'imagerie, car nous constatons que 50% est perdu en moyenne au cours du processus. Plus il y a de cellules utilisées pour le processus, plus il est facile de les récolter à partir du gradient de densité. Nous utilisons 4-8 ml des deux types de cellules pour assurer l'excès de cellules. Si désiré, les cellules peuvent être comptées avant cette étape pour assurer le volume nécessaire. Toutes les cellules supplémentaires sont remises dans leurs flacons respectifs.
    2. Laver les deux tubes des lymphocytes T et des cellules CH27 trois fois avec un RPMI complet de 5 ml (300 x g pendant 5 min). Jeter le supernatant à chaque fois pendant le lavage. Resuspendre chaque tube en 1 ml complet RPMI et compter les cellules par un hémocytomètre.
  3. Resuspendre 1 x 106 APC dans 500 L complet RPMI et ajouter 10 M MCC. Incuber pendant 3 h à 37 oC, 5 % DE CO2. Laver les cellules trois fois avec un RPMI complet de 500 l (300 x g pendant 5 min). Jetez les supernatants.
  4. Resuspendre 1 x 106 lymphocytes T dans 500 L complet RPMI. Ajouter 2 g de Fab étiqueté e (clone H57) à 500 oL de cellules. Incuber pendant 30 min à 37 oC, 5 % de CO2. Laver les cellules trois fois avec 500 oL de RPMI complet (300 x g pendant 5 min). Jeter le supernatant après chaque lavage.
    REMARQUE : L'anticorps anti-TCR divalent a été coupé en Fab monovalent à l'aide d'un kit de préparation Fab (voir le Tableau des matériaux) pour éviter de relier les récepteurs des lymphocytes T par l'anticorps divalent (cette étape est facultative).
  5. Resuspendre les deux types de cellules dans 500 l de milieux d'imagerie (milieu L-15 sans phenol avec 10% FBS, 1% pénicilline/streptomycine, 2 mM L-glutamine).

3. Conduite de l'alignement quotidien LLSM

REMARQUE : (Important) Ce protocole d'alignement est basé sur l'instrument LLSM utilisé (voir le Tableau des matériaux). Chaque LLSM peut être différent et nécessiter des stratégies d'alignement différentes, en particulier celles qui sont construites à la maison. Effectuer l'alignement de routine approprié et continuer à l'article 4.

  1. Ajoutez 10 ml d'eau plus 30 l de fluorescéine (1 mg/mL de bouillon) au bain LLSM (volume de 10 ml), appuyez sur Image (Home) pour déplacer l'objectif vers la position de l'image, et regardez un seul modèle de faisceau laser Bessel. Alignez le faisceau laser à l'aide des guides et de la région d'intérêt pré-réglé (ROI) pour faire du faisceau un motif mince équilibré dans toutes les directions.
    1. Le faisceau doit également apparaître concentré dans la caméra de recherche. Utilisez deux régleurs d'inclinaison de miroir, micromètre supérieur, foyer, et collier objectif d'émission pour ajuster. Voir Figure 2A,B pour faisceau correctement aligné.
  2. Laver le bain et les objectifs avec au moins 200 ml d'eau pour enlever complètement la fluorescéine.
  3. Perles fluorescentes standard d'image dans les supports d'imagerie (préparées en adhérant à une feuille de couverture de 5 mm avec de la poly-L-lysine, voir le Tableau des matériaux;cela peut être pré-préparé et réutilisé) pour la fonction physique de propagation des points (PSF) dans les supports d'imagerie.
    REMARQUE: Il ne peut y avoir qu'une seule perle en vue pour le traitement ultérieur, alors essayez de trouver une perle qui est par lui-même dans le spectateur ou peut facilement être recadrée pour obtenir une perle unique.
    1. Allumez le dither en réglant à 3 dans la boîte 'X Galvo'. Appuyez sur Live pour voir le champ actuel. Déplacez-vous le long de la direction Z pour trouver le bordereau de couverture et les perles. Trouver le centre d'une perle en se déplaçant le long de Z, appuyez sur Arrêtez de mettre en pause le laser. Vérifiez 3D, centre de presse, puis appuyez sur Exécuter. Cela permettra de recueillir les données.
    2. Ajustez manuellement le miroir d'inclinaison, le collier objectif et le micromètre de mise au point pour les valeurs grises les plus élevées, puis ajustez-les au besoin pour obtenir les modèles appropriés pour les modes de balayage objectif, z galvo, z-objectif (totPSF) et de capture d'échantillon (samplePSF). Voir Figure 2C-F pour les projections d'intensité maximale correctement ajustées (PMI).
      REMARQUE : Les différents modes de capture (balayage objectif, z galvo, z-objectif et analyse de l'échantillon) modifient la façon dont la feuille de lumière se déplace à travers l'échantillon. Tous les modes d'analyse doivent être utilisés pour l'alignement.
    3. L'analyse de l'échantillon montre comment les données seront recueillies au cours de l'expérience. Recueillir l'échantillon PSF en appuyant sur Execute en mode d'analyse de l'échantillon pour le dékewing et la déconvolution (voir la section 5). Changez les lasers en mode trois couleurs (488, 560, 647) et appuyez à nouveau sur Execute.
      REMARQUE : Étant donné que les images LLSM en angle (57,2 degrés), les images capturées en mode « analyse de l'échantillon » sont recueillies à cet angle et sont donc « biaisées ». Le débiais est le processus de correction de cet angle et de « réalignement » de l'image sur une véritable z-pile. Ces données doivent être collectées dans des supports d'imagerie et dans tous les canaux qui seront photographiés au cours de l'expérience. Si cela n'est pas recueilli correctement, les données ne seront pas correctement débiaisées. De même, assurez-vous que les médias ont été réchauffés à 37 oC (ou à la température expérimentale désirée).

4. Mise en place de cellules avec LLSM

  1. Ajouter 100 000 APC (50 l) de l'étape 2,5 à un bordereau circulaire de 5 mm de diamètre à partir de l'étape 2.1 et leur permettre de se contenter de 10 min.
  2. Graisser le support de l'échantillon, puis ajouter le coverslip cellule-côté vers le haut à elle. Ajouter une goutte de support d'imagerie à l'arrière de la couverture pour éviter les bulles avant de placer dans le bain. Visser le porte-échantillon sur le piezo, et appuyez sur Image (Home).
  3. Trouvez un APC à l'image pour s'assurer que le LLSM et le logiciel d'imagerie (voir tableau des matériaux)fonctionnent correctement.
    REMARQUE : Nous imagez à la taille d'étape de 0.4 'm avec 60 z-steps et 10 ms d'exposition pour deux couleurs avec l'ensemble de fossé à 3, qui a comme conséquence 1.54 s par image de l'image 3D avec la résolution de '200 nm XY et de 400 nm Z. Ces paramètres peuvent devoir être ajustés en fonction de la taille de la cellule, de la résolution z souhaitée et de la force du signal de la technique d'étiquetage fluorescent utilisée. La consommation d'énergie au laser variera également en fonction de la technique d'étiquetage fluorescent utilisée.
    1. Appuyez sur Live pour afficher l'image actuelle. Déplacez-vous le long de Z pour trouver le bordereau de couverture et les cellules.
    2. Trouvez le centre d'un APC en se déplaçant dans la direction Z, puis appuyez sur Arrêtez pour mettre en pause le laser. Vérifiez la 3D et entrez les paramètres souhaités (voir l'étape 4.3.1), appuyez sur Centre, puis appuyez sur Exécuter. Cela permettra de recueillir les données.
  4. Abaissez l'étape pour charger la position et ajoutez 50 L de lymphocytes T dans les supports d'imagerie (100 000 cellules, à partir de l'étape 2.5) directement sur le bordereau de couverture. Il est préférable de laisser une goutte se former à l'extrémité de la pointe de la pipette, puis de toucher la pointe au liquide du bain. Remontez la scène en cliquant sur "Image (Retour)".
  5. Commencer l'imagerie. Assurez-vous de définir la taille de la pile désirée et la durée du laps de temps. Par exemple, imagez 60 z-stacks à une taille d'étape de 0,4 m et entrez 500 échéanciers. (Typiquement) arrêter l'enregistrement avant 500 images sont atteintes pour éviter le photoblanchiment. Utilisez le mode Live pour rechercher des paires de cellules, et lorsque les paramètres sont prêts et désirés, appuyez sur Exécuter pour collecter des données. Voir le film 1 et la figure 1 par exemple.

5. Suivre la dynamique de surface

  1. Exporter les données du logiciel d'imagerie (voir le Tableau des matériaux). Cela créera des fichiers TIF z-pile pour chaque point de temps dans chaque couleur.
  2. D'abord débiaiser et décongestioner les données.
    REMARQUE : Nous utilisons le pipeline LLSpy sous licence par le Janelia Research Campus18 deHHMI, mais le dékewing et la déconvolution sont également disponibles dans plusieurs logiciels d'imagerie (voir Tableau des matériaux).
  3. Debleach les données.
    REMARQUE: Nous utilisons la fonction de bleach Fidji avec l'assortir histogramme (Fiji Pathway: Image Ajuster Correction de l'eau de Javel Histogram Matching - France OK).
  4. Importer dans le logiciel de suivi (voir le Tableau des matériaux). Suivre les clusters selon les spécifications logicielles. Voir Movie 2 pour un exemple.
    REMARQUE : Le suivi des résultats dépendra du logiciel de suivi utilisé, de l'algorithme choisi, des paramètres de sortie souhaités sélectionnés, etc. Par exemple, dans le logiciel de suivi que nous avons utilisé (voir le Tableau des Matériaux), nous avons choisi de permettre au logiciel de suivre les formes irrégulières, plutôt que d'attribuer chaque fonctionnalité un seul endroit, puisque les clusters TCR ne sont pas organisés en sphères parfaites. De plus, nous avons choisi de recueillir 35 paramètres, y compris la vitesse, la direction, le volume, l'intensité, la zone, l'emplacement et l'information sur la durée de la voie. Cependant, différentes méthodes ou paramètres seront bénéfiques pour répondre à différentes questions.
    1. Si le suivi n'est pas souhaité, utilisez le plugin ClearVolume pour Fidji pour visualiser et créer des films à partir de données hyperstack.

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Representative Results

Ici, nous décrivons l'isolement, la préparation, et l'imagerie de la souris primaire 5C. Cellules T C7 à l'aide d'un microscope à feuilles de lumière en treillis. Pendant la section 3, il est impératif d'aligner correctement le microscope et de recueillir quotidiennement des FPS pour décongestionner les données après la collecte. Dans la figure 2, nous montrons les images d'alignement correctes qui seront vues lors de l'alignement du microscope. La figure 2A et la figure 2B montrent respectivement la trajectoire et l'alignement corrects du faisceau lorsqu'ils sont représentés en fluorescéine. L'analyse objective doit montrer une grande forme X dans les projections XZ et YZ qui est aussi symétrique que possible; cela devrait également être ajusté pour être aussi petit qu'un X que possible (figure 2C). Ceci est principalement réalisé en ajustant le collier objectif d'émission. Le z galvo scan doit montrer un ovale en XZ et XY avec un seul point de chaque côté (ci-dessus et ci-dessous pour XZ et à gauche et à droite pour YZ) (Figure 2D). Ceci est principalement réalisé en ajustant l'inclinaison du miroir galvo, soit manuellement ou avec l'ajustement motorisé dans le logiciel. Enfin, l'analyse z-objectif et l'analyse de l'échantillon doivent montrer des points qui semblent aussi ronds que possible(figure 2E et Figure 2F, respectivement). Ceux-ci peuvent avoir un petit X, mais cela devrait être aussi dimished que possible. Ceux-ci devraient être bien alignés si l'analyse objective et z galvo ont été bien réglés, mais si des ajustements sont nécessaires, ils seront principalement effectués avec le miroir de galvo. Il est important de noter que pendant cet alignement, chaque fois que le collier et le galvo sont ajustés, la mise au point (micromètre au-dessus de l'objectif d'émission) devra également être ajustée.

En utilisant ce protocole, nous pouvons voir la dynamique en quatre dimensions des TCR sur une surface de cellule T (Figure 1, Film 1). Le principal avantage de ce microscope réside dans la capacité de suivre les unités de surface visualisées des TCR, et d'obtenir des données quantifiées de leur taille, mouvement, intensité du signal, etc. (voir Tableau des matériaux). Movie 2 montre un exemple des pistes obtenues.

Figure 1
Figure 1 : Imagerie en 4 dimensions de synapse lymphocyte T- APC. (A) Un exemple représentatif d'images LLSM en timelapse 3D montrant une cellule T interagissant avec un APC. Sont montrés la dynamique TCR (verte, étiquetée par anti-TCR-AF488) dans la reconnaissance des antigènes présentés à la surface d'un APC (rouge, cytosolique mCherry). Barre d'échelle de 5 m. Voir aussi Movie 1. (B) Orthogonal XY tranche de (A). L'enset est un cadre de référence d'une cellule entière. Barre d'échelle de 5 m. (C) Orthogonal YZ tranche de (A). L'enset est un cadre de référence d'une cellule entière. Barre d'échelle de 5 m. (D) Double tranche orthogonale de (A). L'enset est le cadre de référence de la cellule entière. Barre d'échelle de 5 m. Voir aussi Movie 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : alignement LLSM. (A) Modèle de faisceau désiré pour l'expérience d'imagerie LLSM. (B) Capture d'écran du processus d'alignement des faisceaux; sur la gauche est la fenêtre de mise au point montrant le faisceau rétréci et focalisé; en haut à droite est un graphique montrant que le faisceau est centré dans la fenêtre; en bas à droite se trouve la caméra de recherche, qui devrait également être un faisceau mince et focalisé. (C) Projections d'intensité maximale (PMI) d'une perle par balayage objectif. (D) Projections d'intensité maximale (PMI) d'une perle par z-galvo scan. (E) Projections d'intensité maximale (PMI) d'une perle par balayage z-objectif. (F) Projections d'intensité maximale (PMI) d'une perle par balayage d'échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Movie 1
Film 1 : Formation de synapse de cellules T. Rendu de volume bicolore de l'interaction d'une cellule T étiquetée avec le TCR-AF488 (vert) avec un APC cible exprimant mCherry cytosolique (rouge) sur 70 points de temps à l'intervalle de 1,54 s. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 2
Film 2 : Suivi du mouvement dynamique TCR. Comparez avec le film 1. Les grappes correspondant aux structures visibles de TCR ont été suivies en 3D au fil du temps avec le logiciel d'imagerie. Les queues de dragon montrant les positions des clusters sur les quatre images précédentes sont codées par longueur de déplacement. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 3
Film 3: Tranches orthogonales de synapse de cellule T. Comparez avec le film 1 et la figure 1B-D. Double tranche orthogonale du film 1, montrant que le Fab TCR-AF488 est en effet l'étiquetage de la surface cellulaire TCRs. Inset est un cadre de référence de la cellule entière. Barre d'échelle de 5 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

Le protocole présenté a été optimisé pour l'utilisation des cellules CD4et T isolées de 5C. Les souris transgéniques C7 sur l'instrument LLSM utilisé, et donc d'autres systèmes cellulaires et LLSM peuvent avoir besoin d'être optimisés différemment. Cependant, ce protocole montre la puissance de l'imagerie 4D, car il peut être utilisé pour quantifier la dynamique d'un récepteur de surface sur une cellule entière avec le moins de distorsion dans les conditions physiologiques. Par conséquent, il existe de nombreuses applications futures possibles de cette technique.

Une étape critique est de permettre aux cellules de s'installer à une concentration appropriée. Si trop d'APC s'installent sur le coverslip et deviennent trop denses, il est difficile de trouver une cellule T qui interagit avec un seul APC. Lorsqu'une cellule T possède plusieurs synapses, le suivi et l'interprétation des données peuvent devenir très compliqués. De même, si trop peu d'APC sont présents, trouver une cellule T formant une synapse est également difficile. Dans nos mains, permettre à 50.000 cellules de se contenter de 10 min atteint une densité optimale. Cependant, ce problème peut être évité si vous utilisez un système avec des cellules adhérentes. Les cellules peuvent être cultivées dans l'incubateur avec les couvertures à une confluence désirée.

De même, le nombre de lymphocytes T tombés dans le système dépend de la taille du bain et de la distance qu'elles peuvent disperser. Dans le système LLSM utilisé ici, il ya un bain de 12 ml et un bain de 2,5 ml, par opposition à la version précédente du système qui n'avait qu'un bain de 10 ml disponible. Nous utilisons le bain de 12 ml pour l'imagerie originale de fluorescein puis passons au bain de 2,5 ml pour l'imagerie des cellules. Cela permet un lavage moins complet du bain après l'étape de visualisation du faisceau, et réduit également le nombre de lymphocytes T requis pour chaque séance d'imagerie. À son tour, cela permettrait aux utilisateurs d'utiliser moins de cellules.

Trouver des cellules au bon point d'interaction est également un défi. Dans nos mains, les lymphocytes T prennent environ 2 min pour s'installer aux APC sur le bordereau de couverture, il est donc important de commencer à chercher le coverslip pour les lymphocytes T dynamiques à proximité des APC. Une amélioration majeure de ceci a été l'ajout récent de la lumière LED dans la caméra de recherche. Si vous utilisez un système construit à la maison, nous recommandons fortement d'inclure cette fonctionnalité dans la conception.

Enfin, les stratégies d'étiquetage fluorescent sont une autre considération importante. Chaque protéine ou colorant fluorescent a un rendement quantique différent et un taux de photoblanchiment. Les colorants fluorescents sont généralement plus brillants, mais si les cellules ont été stabilisées avec une molécule étiquetée protéine fluorescente, l'étiquette est réapprovisionnée au fur et à mesure que la cellule continue de produire la molécule. Par conséquent, la stratégie d'étiquetage est un facteur important à prendre en considération lors de la conception d'expériences.

Nous aimerions conclure par une discussion sur les orientations futures de la technologie. LLSM est également capable de microscopie d'éclairage structurée (SIM), qui se traduit par une résolution XY de 150 nm et une résolution de 280 nm Z, et est au moins 10 fois plus rapide que la carte SIM12. Par conséquent, alors que LLSM fournit une vitesse sans précédent de l'imagerie 4D, il ne peut pas atteindre la résolution spatiale des techniques actuelles de super-résolution4,5,6. Toutefois, cette résolution pourrait être améliorée si un STED LLSM pouvait être créé. Feuille de lumière STED et épuisement des émissions stimulées avec microscopie d'éclairage plan sélectif (STED-SPIM) ont été utilisés, mais n'ont pas la résolution temporelle de LLSM21,22,23,24. Si STED-SPIM était adapté pour incorporer un treillis, nous pourrions potentiellement obtenir une résolution axiale de 50 nm avec beaucoup moins de photoblanchiment, et une image plus rapide que les techniques actuellement disponibles. Néanmoins, avec les technologies actuelles disponibles, LLSM nous donne la résolution temporelle la plus rapide avec une haute résolution axiale.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous tenons à souligner les conseils et les conseils du Dr Vytas Bindokas de l'Université de Chicago. Nous remercions l'Integrated Light Microscopy Core Facility de l'Université de Chicago d'avoir soutenu et entretenu le microscope à feuilles de lumière en treillis. Ce travail a été soutenu par NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 et NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. est soutenu par le NSF Graduate Research Fellowships Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Syringe BD 309659 For T cell harvest
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-25ML For T cell culture
5 mm round coverslips World Precision Instruments 502040 For Imaging
70um Sterile Cell Strainer Corning 7201431 For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody BioLegend 109215 For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) X&Y Cell Culture FBS-500 For T cell culture
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377 For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres Thermo Fisher Scientific F8810 For microscope alignment
Imaris Bitplane N/A Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope 3i N/A Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 21083027 For Imaging
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-081 For T cell culture
LLSpy Janelia Research Campus N/A LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK Elimbio Custom Synthesis For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin Life Technologies 15140122_3683884612 For T cell culture
Poly-L-Lysine Phenix Research Products P8920-100ML For Imaging
RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54 For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2 Sigma-Aldrich I0523 For T cell culture
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T-25 Flasks Eppendorf 2231710126 For T cell culture
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References

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Biochimie numéro 155 microscopie de feuilles de lumière en treillis immunologie récepteur des lymphocytes T imagerie suivi dynamique
Visualisation de la dynamique des récepteurs T-Cell de surface à quatre dimensions à l'aide de microscopie à feuilles de lumière en treillis
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Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing … More

Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e59914, doi:10.3791/59914 (2020).

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