Summary
Цель этого протокола состоит в том, чтобы показать, как использовать латетную световую микроскопию для четырехмерной визуализации динамики поверхностных рецепторов в живых клетках. Здесь показаны Т-клеточные рецепторы на CD4и первичных Т-клетках.
Abstract
Сигнализация и функция клетки диктуются динамическими структурами и взаимодействиями ее поверхностных рецепторов. Чтобы по-настоящему понять структурно-функциональную связь этих рецепторов на месте, нам нужно визуализировать и отслеживать их на поверхности живой клетки с достаточным пространственно-временное разрешение. Здесь мы покажем, как использовать недавно разработанную решетку светолистной микроскопии (LLSM) для изображения Т-клеточных рецепторов (TCRs) четырехмерно (4D, пространство и время) на мембране живых клеток. Т-клетки являются одним из основных эффекторов клеток адаптивной иммунной системы, и здесь мы использовали Т-клетки в качестве примера, чтобы показать, что сигнализация и функция этих клеток обусловлены динамикой и взаимодействия ТКК. LLSM позволяет 4D-изображения с беспрецедентным пространственно-временное разрешение. Этот метод микроскопии поэтому может быть обычно применяется к широкому спектру поверхностных или внутриклеточных молекул различных клеток в биологии.
Introduction
Точная динамика торговли молекулами и распространения на трехмерной поверхности клеток в режиме реального времени была загадкой для решения. Микроскопия всегда была балансом скорости, чувствительности и разрешения; если один или два максимизированы, третий сводится к минимуму. Поэтому из-за небольшого размера и огромной скорости, с которой движутся поверхностные рецепторы, отслеживание их динамики остается серьезной технологической проблемой в области клеточной биологии. Например, многие исследования были проведены с использованием общей внутренней флуоресценции (TIRF) микроскопии1,2 ,3,который имеет высокое временное разрешение, но может только изображение очень тонкий кусочек Мембраны Т-клеток (100 нм), и, следовательно, пропускает события, происходящие дальше в клетке. Эти изображения TIRF также показывают только двумерную часть ячейки. В отличие от этого, супер-разрешение методов, таких как стохастические оптической реконструкции микроскопии (STORM)4, фотоактивированной микроскопии локализации (PALM)5, и стимулировали истощение выбросов микроскопии (STED)6, может преодолеть предел дифракции аббата света. Эти методы имеют высокое пространственное разрешение (разрешение 20 нм)4,5,6,7, но они часто занимают много минут, чтобы приобрести полное двумерное (2D) или трехмерное (3D) изображение, и поэтому временное разрешение теряется. Кроме того, такие методы, как STORM и PALM, которые полагаются на мигающие сигналы могут иметь неточности в подсчете8,9. Электронная микроскопия имеет на сегодняшний день самое высокое разрешение (до 50 вечера резолюции)10; она может быть даже проведена трехмерно с целенаправленной ионного луча сканирования электронной микроскопии (FIB-SEM), в результате чего до 3 нм XY и 500 нм с разрешением11. Тем не менее, любая форма электронной микроскопии требует жесткой подготовки образца и может быть проведена только с фиксированными клетками или тканями, исключая возможность визуализации живых образцов с течением времени.
Методы получения высокого пространственно-временного разрешения, необходимые для определения динамики поверхностных и внутриклеточных молекул в живых клетках в их истинной физиологической 3D природе, только недавно разрабатываются. Одним из таких методов является решетка световой лист микроскопии (LLSM)12, который использует структурированный световой лист, чтобы резко снизить фотоотбеление. Разработанный в 2014 году лауреатом Нобелевской премии Эриком Бетзигом, высокое осевое разрешение, низкое фотоотбеление и фоновый шум, а также способность одновременно изображения сотен самолетов на поле зрения делают микроскопы LLS превосходящими широкоугольные, TIRF и конфокальные микроскопы12,13,14,15,16,17,18,19. Этот четырехмерный (x, y, z и time) метод визуализации, в то же время дифракция ограничена (разрешение XY) в 200 нм, имеет невероятное временное разрешение (мы достигли частоты кадров около 100 кадров в секунду, в результате чего 3D реконструированное изображение ячейки с 0,85 секунды на кадр) для 3D пространственного приобретения.
LLSM обычно используется для отслеживания динамики в реальном времени любых молекул в любой клетке на одномолекуляционном и одноклеточном уровне, особенно в высокомотыльных клетках, таких как иммунные клетки. Например, мы показываем здесь, как использовать LLSM для визуализации динамики Т-клеточных рецепторов (TCR). Т-клетки являются эффекторными клетками адаптивной иммунной системы. TCRs отвечают за распознавание лигандов пептида-MHC (pMHC), отображаемых на поверхности антиген-представляющих клеток (APC), который определяет отбор, развитие, дифференциацию, судьбу и функцию Т-клетки. Это признание происходит на стыке Т-клеток и БТР, в результате чего локализованные кластеризации рецепторов, чтобы сформировать то, что называется иммунологического синапса. Хотя известно, что ТЦР в иммунологическом синапсе необходимы для функции Т-клеточного эффектора, до сих пор неизвестны основные механизмы оборота ТКР в реальном времени в синапсе. LLSM позволилнам визуализировать в режиме реального времени динамику ТЦР до и после оборота в синапс с результирующей pMHC-TCR взаимодействия (Рисунок 1). LLSM поэтому может быть использован для решения текущих вопросов формирующей динамики TCRs и обеспечить понимание того, как клетка различает себя и иностранных антигенов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
5С. C7 TCR-трансгенных RAG2 нокаут мышей в B10. Справочная информация была использована в этом исследовании в соответствии с протоколом, утвержденным институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Чикагского университета.
1. Урожай и активация Т-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола основана на предыдущих протоколах. Подробнее о цитатах можно узнать20,21.
- Euthanize 10-12 недель 5C. C7 трансгенной мыши любого пола (20-25 г) в соответствии с утвержденным протоколом IACUC (т.е. CO2 камеры следуют вывихшей шейки матки).
- Спрей туши мыши тщательно с 70% этанола, чтобы замочить мех и принести в BSL-2 безопасности кабинета.
- Поверните мышь на правую сторону и сделайте небольшой разрез в полости тела хирургическими ножницами. Удалите селезенку с помощью хирургических щипцы. Отрежьте соединительную ткань по мере необходимости хирургическими ножницами.
- Поместите селезенку в 70 мкм-пор сетки сетки сетки ситечко и пюре с задней 1 мл шприц поршень. Тщательно промыть ситечко с полным RPMI (RPMI с 10% сыворотки плода бычьей крупной коровки (FBS), 2 мМ L-глютамина, 1% пенициллина/стрептомицина, 50 мкм 2-меркаптоэтанола).
- Центрифуга одноклеточной подвески спленоцитов при 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы в этой точке будут красными. - Отрежь спленоциты в 5 мл люизис буфера РБК. Инкубировать в течение 5 минут, затем утолить 5 мл полного RPMI.
- Центрифуга одноклеточной подвески спленоцитов при 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы в этой точке должны быть белыми, а не красными. - Отрежь гранулу в 5 мл полного RPMI.
- Перенесите в колбу Т-25 и добавьте 10 мкм моли цитохром-C (MCC, последовательность ANERADLIAYLK-ATK). Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за одну ночь.
- На следующий день добавьте рекомбинантную мышь Ил-2 к конечной концентрации 100 U/mL.
- Обратите внимание на следующие дни, добавляя свежие носители, поскольку текущие носители желтеют. Т-клетки погибнут, если оставить в желтых носителях без присмотра более 48 ч. Клетки готовы использовать через 6-10 дней после сбора урожая.
2. Подготовка клеток
- Инкубировать 5 мм круглые крышки с 0,1% поли-L-лизин в течение 10 мин. Аспирот и дайте высохнуть естественным путем.
- Используйте градиентный реагент плотности (см. таблицу материалов),чтобы отделить мертвые клетки и получить 1 х 106 Т-клеток и 1 х 106 ApCs (CH27 клетки21,22 трансумционированных с цитосоликом mCherry) отдельно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки учитываются с помощью гемоцитометра.- Добавьте 3 мл реагента градиента плотности в коническую трубку 15 мл и тщательно добавьте клетки к краю трубки. Не смешивайте. Центрифуга при 930 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия; использовать ускорение/замедление: SLOW/SLOW. Удалите тонкий средний слой клеток между полным и градиентной реагент плотности тщательно, положив каждый тип ячейки в отдельные конические трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо подготовить больше клеток, чем необходимо для визуализации, так как мы находим, что 50% теряется в среднем в процессе. Чем больше ячеек используется для процесса, тем легче собрать их из градиента плотности. Мы используем 4-8 мл обоих типов клеток для обеспечения избыточных ячеек. При желании ячейки можно пересчитать до этого шага, чтобы обеспечить необходимый объем. Любые дополнительные клетки помещаются обратно в свои колбы. - Вымойте обе трубки Т-клеток и CH27 клеток три раза с 5 мл полной RPMI (300 х г в течение 5 минут). Откажитесь от супернатанта каждый раз во время стирки. Переприим каждая трубка в 1 мл полной RPMI и рассчитывать клетки гемоситометра.
- Добавьте 3 мл реагента градиента плотности в коническую трубку 15 мл и тщательно добавьте клетки к краю трубки. Не смешивайте. Центрифуга при 930 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия; использовать ускорение/замедление: SLOW/SLOW. Удалите тонкий средний слой клеток между полным и градиентной реагент плотности тщательно, положив каждый тип ячейки в отдельные конические трубки.
- Resuspend 1 х 106 БТР в 500 Зл полный RPMI и добавить 10 мкм MCC. Инкубировать 3 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Вымойте клетки три раза с 500 Л полный RPMI (300 х г в течение 5 мин). Откажитесь от супернационтов.
- Resuspend 1 х 106 Т-клеток в 500 Л полного RPMI. Добавьте 2 мкг анти-ТКРЗ Alexa488-маркированной Fab (клон H57) до 500 л клеток. Инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия, 5% CO2. Вымойте клетки три раза с 500 л полного RPMI (300 х г в течение 5 мин). Откажитесь от супернатанта после каждой стирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Divalent анти-TCR антитела были разрезаны на моновалентный Fab с помощью комплекта подготовки Fab (см. Таблица материалов), чтобы избежать перекрестных Т-клеточных рецепторов divalent антитела (этот шаг является необязательным). - Повторное использование обоих типов клеток в 500 мл фоновых носителей (фенол без красного Лейбовица L-15 среды с 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамамин).
3. Проведение ежедневного выравнивания LLSM
ПРИМЕЧАНИЕ: (Важно) Этот протокол выравнивания основан на используемом инструменте LLSM (см. таблицу материалов). Каждый LLSM может быть разным и требует различных стратегий выравнивания, особенно тех, которые построены дома. Выполняй соответствующее обычное выравнивание и продолжайте раздел 4.
- Добавьте 10 мл воды плюс 30 флуоресцеина (1 мг/мл) в ванну LLSM (объем 10 мл), press Image (Home), чтобы переместить цель в положение изображения, и посмотрите на один шаблон лазерного луча Бесселя. Выровнять лазерный луч с помощью направляющих и заранее установленных области интереса (ROI), чтобы сделать луч тонкий узор сбалансированным во всех направлениях.
- Луч также должен отображаться сосредоточенным в камере-искателе. Используйте два зеркальных регуляторов наклона, верхний микрометр, фокус и объективный воротник для отвернения. См Рисунок 2A, B для правильно выровненного луча.
- Вымойте ванну и цели, по крайней мере 200 мл воды, чтобы полностью удалить флуоресцеин.
- Изображение стандартных флуоресцентных бусин в среде изображения (подготовлены при соблюдении бисера на 5 мм крышкой с поли-L-лизин, см. Таблица материалов; это может быть заранее подготовлены и повторно использованы) для физической функции распространения точки (PSF) в изображении средств массовой информации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там может быть только один бис в поле зрения для последующей обработки, так что постарайтесь найти бис, который сам по себе в зрителя или может быть легко обрезаны, чтобы получить одну бисо.- Включите смягчаться, установив до 3 в поле диапазона X Galvo. Нажмите В прямом эфире, чтобы просмотреть текущее поле. Перемещение вдоль направления к я, чтобы найти крышку скольжения и бисера. Найдите центр бисера, двигаясь вдоль кью, нажмите Стоп, чтобы приостановить лазер. Проверьте 3D, пресс-центр, а затем нажмите Выполнить. Это позволит собирать данные.
- Вручную отрегулируйте зеркало наклона, объективный воротник и сфокусируйте микрометр для самых высоких серых значений, затем отрегулируйте по мере необходимости для получения надлежащих моделей для объективного сканирования, z galvo, z'objective (totPSF) и режимов сканирования образца (образецPSF). См Рисунок 2C-F для правильно скорректированных прогнозов максимальной интенсивности (MIPs).
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные режимы захвата (объективное сканирование, z galvo, z'objective, и сканирование образца) меняют то, как световой лист перемещается по образцу. Все режимы сканирования должны использоваться для выравнивания. - Сканирование выборки показывает, как данные будут собираться в ходе эксперимента. Соберите образец PSF, нажав Выполнить в режиме сканирования образца для deskewing и deconvoltion (см. раздел 5). Измените лазеры на трехцветный режим (488, 560, 647) и нажмите «Снова».
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку изображения LLSM под углом (57,2"), изображения, снятые в режиме "сканирования образцов", собираются под этим углом и поэтому "перекошивают". Де-перекос является процесс коррекции для этого угла и "перевыравнивания" изображения на истинный z-стек. Эти данные должны быть собраны в средствах обработки изображений и во всех каналах, которые будут изображены в ходе эксперимента. Если это не будет собрано должным образом, данные не будут должным образом де-перекос. Аналогичным образом, убедитесь, что средства массовой информации были нагреваны до 37 градусов по Цельсию (или желаемой экспериментальной температуры).
4. Настройка ячеек с LLSM
- Добавьте 100 000 БТР (50 л) со ступени 2,5 до кругового покрытия диаметром 5 мм от ступени 2.1 и дайте им поселиться в течение 10 минут.
- Смазать образец держателя затем добавить coverslip ячейки-вверх к нему. Добавьте каплю средств изображения к задней части coverslip для того чтобы во избежание пузыри перед устанавливать в ванне. Винт образец держателя на пьезо, и нажмите изображение (главная).
- Найдите APC для изображения, чтобы убедиться, что LLSM и программное обеспечение для визуализации (см. Таблица материалов) функционируют должным образом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы изображение на 0,4 мкм размер шага с 60 z-шагов и 10 мс воздействия для двух цветов с dither набор 3, что приводит к 1,54 с на кадр 3D-изображения с разрешением 200 нм XY и 400 нм разрешение. Эти параметры, возможно, должны быть скорректированы на основе размера ячейки, желаемого z-разрешение, и сила сигнала от флуоресцентной техники маркировки используется. Лазерное использование энергии также будет варьироваться в зависимости от используемой метода флуоресцентной маркировки.- Нажмите в прямом эфире, чтобы просмотреть текущее изображение. Перемещение вдоль к, чтобы найти крышку скольжения и клеток.
- Найдите центр БТР, двигаясь в направлении Кью, а затем нажмите На остановку, чтобы приостановить лазер. Проверьте 3D и введийте нужные настройки (см. шаг 4.3.1), пресс-центр, а затем нажмите Execute. Это позволит собирать данные.
- Нижняя стадия для загрузки позиции и добавить 50 Л Т-клеток в среде визуализации (100 000 ячеек, со ступени 2.5) капля прямо над крышкой. Лучше всего, чтобы падение форме на конце кончика пипетки, а затем коснуться кончика к ванне жидкости. Поднимите этап назад, нажав "Изображение (Возвращение)".
- Начните визуализацию. Не забудьте установить желаемый размер стека и промежуток времени. Например, изображение 60 z-стеков при размере 0,4 мкм и ввод 500 временных рамок. (Обычно) прекратить запись до 500 кадров достигаются, чтобы избежать фотоотбеления. Используйте режим Live для поиска пар ячеек, и когда готовые и желаемые настройки были введены, нажмите Execute для сбора данных. Например, смотрите фильм 1 и рисунок 1.
5. Динамика поверхности трека
- Экспорт данных из программного обеспечения для визуализации (см. Таблицу материалов). Это позволит создать файлы z-stack TIF для каждого момента в каждом цвете.
- Первый deskew и deconvolve данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем конвейер LLSpy по лицензии исследовательского кампуса Janelia18компании HHMI, но деконволуция также доступны в нескольких программах визуализации (см. Таблица материалов). - Debleach данные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем фиджийской функции debleach с гистограммой соответствия (Фиджи Путь: Изображение Отрегулируйте (англ.) Коррекция отбеливателя Гистограмма Соответствие ОК). - Импорт в программное обеспечение для отслеживания (см. таблицу материалов). Отслеживайте кластеры в соответствии со спецификациями программного обеспечения. См Movie 2 можно например.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты отслеживания будут зависеть от используемого программного обеспечения для отслеживания, выбранного алгоритма, желаемых параметров вывода и т.д. Например, в программном обеспечении для отслеживания, которое мы использовали (см. таблицу материалов),мы решили позволить программному обеспечению отслеживать неправильные формы, а не назначать каждой функции одно место, так как кластеры TCR не организованы в идеальные сферы. Кроме того, мы решили собрать 35 параметров, включая скорость, направление, объем, интенсивность, площадь, местоположение и информацию о продолжительности трека. Тем не менее, различные методы или параметры будут полезны для ответа на различные вопросы.- Если отслеживание не желательно, используйте плагин ClearVolume для Фиджи для визуализации и создания фильмов из данных гиперстога.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы описываем изоляцию, подготовку и визуализацию первичной мыши 5C. C7 T-клетки с помощью решетчатого светового листового микроскопа. Во время раздела 3, необходимо выровнять микроскоп правильно, и собрать PSF ежедневно, с которым deconvolve данные после сбора. На рисунке 2мы показываем правильные изображения выравнивания, которые будут видны при выравнивании микроскопа. Рисунок 2А и рисунок 2B показывают правильный путь луча и выравнивание луча, соответственно, при изображении флуоресцеина. Объективное сканирование должно показать большую форму X в проекциях X и Y, которая максимально симметрична; это также должно быть скорректировано, чтобы быть как можно меньше X, как это возможно(Рисунок 2C). Это в основном достигается за счет корректировки ошейника объективного выброса. Сканирование z galvo должно показать овал в X' и XY с одной точкой с обеих сторон (выше и ниже для X, и влево и вправо для Y) (Рисунок 2D). Это в основном достигается за счет регулировки наклона зеркала гальво, либо вручную, либо с моторизованной регулировкой программного обеспечения. Наконец, как сканирование z'objective, так и сканирование образца должны отображать точки, которые выглядят как можно более круглыми(рисунок 2E и Рисунок 2F, соответственно). Они могут иметь небольшой X, но это должно быть как dimished насколько это возможно. Они должны быть хорошо выровнены, если объективное сканирование и z galvo были установлены хорошо, но если корректировки необходимы, они будут в основном проводиться с зеркалом гальво. Важно отметить, что во время этого выравнивания, в любое время воротник и гальво корректируются, фокус (микрометр выше цели выбросов) также должны быть скорректированы.
Используя этот протокол, мы можем увидеть четырехмерную динамику TCRs на поверхности Т-клеток(рисунок 1, Фильм 1). Основное преимущество этого микроскопа заключается в способности отслеживать визуализированные поверхностные единицы ТКК, а также получать количественные данные об их размерах, движении, интенсивности сигнала и т.д. (см. Таблицу Материалов). Фильм 2 показывает пример треков, полученных.
Рисунок 1: 4-мерная визуализация Т-клеток-APC Synapse. (A) Репрезентативный пример 3D замедленного LLSM изображения, показывающие Т-ячейки, взаимодействующих с APC. Показана динамика TCR (зеленая, помеченная анти-TCR-AF488) в распознавании антигенов, представленных на поверхности APC (красный, цитосоликm mCherry). Шкала бар 5 мкм. Также смотрите фильм 1. (B) Orthogonal XY ломтик (A). Всет является эталонной рамкой целой ячейки. Шкала бар 5 мкм. (C) Orthogonal Y' ломтик (A). Всет является эталонной рамкой целой ячейки. Шкала бар 5 мкм. (D) Двойной ортогонал ломтик (A). Всет является эталонной рамкой всей ячейки. Шкала бар 5 мкм. Также смотрите фильм 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: выравнивание LLSM. (A) Желаемый образпучий для эксперимента по визуализации LLSM. (B) Скриншот процесса выравнивания луча; слева находится окно фокусировки, показывающее суженный, сфокусированный луч; в правом верхнем верхнем виде находится график, показывающий, что луч центрируется в окне; в правом нижнем углу находится камера-искатель, которая также должна быть тонким, сфокусированным лучом. (C) Максимальная интенсивность проекций (MIPs) биса путем объективного сканирования. (D) Максимальная интенсивность проекций (MIPs) из биса z-galvo сканирования. (E) Максимальная интенсивность проекций (MIPs) из биса по z'objective сканирования. (F) Максимальная интенсивность проекций (MIPs) биса по пробе сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Фильм 1: Формирование синапса Т-клеток. Двухцветная томная визуализация взаимодействия Т-клеточной с меткой ЗТКР-AF488 (зеленый) с целевым APC, выражающим цитосолико mCherry (красный) более 70 временных точек с интервалом 1,54. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Фильм 2: Отслеживание динамического движения TCR. Сравните с фильмом 1. Кластеры, соответствующие видимым структурам TCR, отслеживались в 3D с помощью программного обеспечения для визуализации. Хвосты дракона, показывающие места кластера на предыдущих четырех кадрах, закодированы по длине смещения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Фильм 3: Ортогональные ломтики синапса Т-клеток. Сравните с фильмом 1 и рисунком 1B-D. Двойной ортогонаальный кусочек фильма 1, показывающий, что «ТЦРЗ-AF488 Fab действительно маркировки поверхности клетки TCRs. Inset является эталонным каркасом всей ячейки. Шкала бар 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол был оптимизирован для использования CD4и Т-клеток, изолированных от 5C. C7 трансгенных мышей на используемом инструменте LLSM, и поэтому другие клеточные системы и LLSMs, возможно, должны быть оптимизированы по-разному. Тем не менее, этот протокол показывает силу 4D-изображения, так как он может быть использован для количественной оценки динамики поверхностного рецептора на всей клетке с наименьшим искажением в физиологических условиях. Таким образом, Есть много возможных будущих применений этой техники.
Критический шаг позволяет клеткам осесть в соответствующей концентрации. Если слишком много БТР оседают на крышке и становятся слишком плотными, трудно найти Т-клетку, которая взаимодействует только с одним APC. Когда Т-клетка имеет несколько синапсов, отслеживание и интерпретация данных может стать очень сложным. Аналогичным образом, если слишком мало БТР присутствуют, найти Т-клетки формирования синапса также трудно. В наших руках, позволяя 50000 клеток, чтобы поселиться в течение 10 минут достигает оптимальной плотности. Однако этой проблемы можно избежать при использовании системы с клетками адептов. Клетки можно выращивать в инкубаторе с обложек до желаемой сплава.
Аналогичным образом, количество Т-клеток, выброшенных в систему, зависит от размера ванны и расстояния, которое они могут разойтись. В системе LLSM, используемой здесь, есть ванна 12 мл и 2,5 мл ванны, в отличие от предыдущей версии системы, которая была доступна только 10 мл ванны доступны. Мы используем ванну 12 мл для оригинальной визуализации флуоресцеина, а затем переключаемся на ванну 2,5 мл для визуализации клеток. Это позволяет менее тщательно мыть ванну после шага визуализации пучка, а также снижает количество Т-клеток, необходимых для каждого сеанса визуализации. В свою очередь, это позволит пользователям использовать меньше ячеек.
Поиск ячеек в нужной точке взаимодействия также является сложной задачей. В наших руках, Т-клетки занять около 2 минут, чтобы успокоиться до БТР на coverslip, поэтому важно, чтобы начать поиск coverslip для динамических Т-клеток близко к БТР. Основным улучшением этого было недавнее добавление светодиодного света в камере-искателе. При использовании домашней системы, мы настоятельно рекомендуем включить эту функцию в дизайн.
Наконец, стратегии флуоресцентной маркировки являются еще одним важным соображением. Каждый флуоресцентный белок или краситель имеет различный квантовый выход и скорость фотоотбеления. Флуоресцентные красители, как правило, ярче, но если клетки были устойчиво трансумцированных с флуоресцентным протеином помечены молекулы, этикетка пополняется, как клетка продолжает производить молекулы. Поэтому стратегия маркировки является важным фактором, который следует учитывать при разработке экспериментов.
Мы хотели бы завершить обсуждение будущих направлений технологии. LLSM также способен к структурированной микроскопии освещения (SIM), которая приводит к разрешению 150 нм XY и 280 нм, и по крайней мере в 10 раз быстрее, чем широкоугольное SIM12. Таким образом, в то время как LLSM обеспечивает беспрецедентную скорость 4D-изображения, он не может достичь пространственного разрешения текущих методов супер-разрешения4,5,6. Однако, это разрешение может быть улучшено, если STED LLSM может быть создан. Легкий лист STED и стимулируемое истощение выбросов с селективной микроскопией освещения самолета (STED-SPIM) были использованы, но не имеют временного разрешения LLSM21,22,23,24. Если бы STED-SPIM был адаптирован для включения решетки, мы потенциально могли бы получить разрешение осевой осевой 50 нм с гораздо меньшим отбеливанием и изображением быстрее, чем имеющиеся в настоящее время методы. Тем не менее, с современными технологиями, LLSM дает нам самое быстрое временное разрешение с высоким осевым разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить советы и рекомендации доктора Витаса Биндокаса из Чикагского университета. Мы благодарим комплексную световую микроскопию ВШЭ в Чикагском университете за поддержку и поддержание латисового светового листового микроскопа. Эта работа была поддержана NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 и NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. поддерживается Программой стипендий для аспирантов NSF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
References
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, Pt 21 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, Chapter 7 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- Erni, R., Rossell, M. D., Kisielowski, C., Dahmen, U. Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe. , Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019).
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), New York, N.Y. 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), New York, N.Y. 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
