Summary

Визуализация поверхности T-клеточного рецептора динамики четыре-Dimensionally использование решетки светлист микроскопии

Published: January 30, 2020
doi:

Summary

Цель этого протокола состоит в том, чтобы показать, как использовать латетную световую микроскопию для четырехмерной визуализации динамики поверхностных рецепторов в живых клетках. Здесь показаны Т-клеточные рецепторы на CD4и первичных Т-клетках.

Abstract

Сигнализация и функция клетки диктуются динамическими структурами и взаимодействиями ее поверхностных рецепторов. Чтобы по-настоящему понять структурно-функциональную связь этих рецепторов на месте, нам нужно визуализировать и отслеживать их на поверхности живой клетки с достаточным пространственно-временное разрешение. Здесь мы покажем, как использовать недавно разработанную решетку светолистной микроскопии (LLSM) для изображения Т-клеточных рецепторов (TCRs) четырехмерно (4D, пространство и время) на мембране живых клеток. Т-клетки являются одним из основных эффекторов клеток адаптивной иммунной системы, и здесь мы использовали Т-клетки в качестве примера, чтобы показать, что сигнализация и функция этих клеток обусловлены динамикой и взаимодействия ТКК. LLSM позволяет 4D-изображения с беспрецедентным пространственно-временное разрешение. Этот метод микроскопии поэтому может быть обычно применяется к широкому спектру поверхностных или внутриклеточных молекул различных клеток в биологии.

Introduction

Точная динамика торговли молекулами и распространения на трехмерной поверхности клеток в режиме реального времени была загадкой для решения. Микроскопия всегда была балансом скорости, чувствительности и разрешения; если один или два максимизированы, третий сводится к минимуму. Поэтому из-за небольшого размера и огромной скорости, с которой движутся поверхностные рецепторы, отслеживание их динамики остается серьезной технологической проблемой в области клеточной биологии. Например, многие исследования были проведены с использованием общей внутренней флуоресценции (TIRF) микроскопии1,2 ,3,который имеет высокое временное разрешение, но может только изображение очень тонкий кусочек Мембраны Т-клеток (100 нм), и, следовательно, пропускает события, происходящие дальше в клетке. Эти изображения TIRF также показывают только двумерную часть ячейки. В отличие от этого, супер-разрешение методов, таких как стохастические оптической реконструкции микроскопии (STORM)4, фотоактивированной микроскопии локализации (PALM)5, и стимулировали истощение выбросов микроскопии (STED)6, может преодолеть предел дифракции аббата света. Эти методы имеют высокое пространственное разрешение (разрешение 20 нм)4,5,6,7, но они часто занимают много минут, чтобы приобрести полное двумерное (2D) или трехмерное (3D) изображение, и поэтому временное разрешение теряется. Кроме того, такие методы, как STORM и PALM, которые полагаются на мигающие сигналы могут иметь неточности в подсчете8,9. Электронная микроскопия имеет на сегодняшний день самое высокое разрешение (до 50 вечера резолюции)10; она может быть даже проведена трехмерно с целенаправленной ионного луча сканирования электронной микроскопии (FIB-SEM), в результате чего до 3 нм XY и 500 нм с разрешением11. Тем не менее, любая форма электронной микроскопии требует жесткой подготовки образца и может быть проведена только с фиксированными клетками или тканями, исключая возможность визуализации живых образцов с течением времени.

Методы получения высокого пространственно-временного разрешения, необходимые для определения динамики поверхностных и внутриклеточных молекул в живых клетках в их истинной физиологической 3D природе, только недавно разрабатываются. Одним из таких методов является решетка световой лист микроскопии (LLSM)12, который использует структурированный световой лист, чтобы резко снизить фотоотбеление. Разработанный в 2014 году лауреатом Нобелевской премии Эриком Бетзигом, высокое осевое разрешение, низкое фотоотбеление и фоновый шум, а также способность одновременно изображения сотен самолетов на поле зрения делают микроскопы LLS превосходящими широкоугольные, TIRF и конфокальные микроскопы12,13,14,15,16,17,18,19. Этот четырехмерный (x, y, z и time) метод визуализации, в то же время дифракция ограничена (разрешение XY) в 200 нм, имеет невероятное временное разрешение (мы достигли частоты кадров около 100 кадров в секунду, в результате чего 3D реконструированное изображение ячейки с 0,85 секунды на кадр) для 3D пространственного приобретения.

LLSM обычно используется для отслеживания динамики в реальном времени любых молекул в любой клетке на одномолекуляционном и одноклеточном уровне, особенно в высокомотыльных клетках, таких как иммунные клетки. Например, мы показываем здесь, как использовать LLSM для визуализации динамики Т-клеточных рецепторов (TCR). Т-клетки являются эффекторными клетками адаптивной иммунной системы. TCRs отвечают за распознавание лигандов пептида-MHC (pMHC), отображаемых на поверхности антиген-представляющих клеток (APC), который определяет отбор, развитие, дифференциацию, судьбу и функцию Т-клетки. Это признание происходит на стыке Т-клеток и БТР, в результате чего локализованные кластеризации рецепторов, чтобы сформировать то, что называется иммунологического синапса. Хотя известно, что ТЦР в иммунологическом синапсе необходимы для функции Т-клеточного эффектора, до сих пор неизвестны основные механизмы оборота ТКР в реальном времени в синапсе. LLSM позволилнам визуализировать в режиме реального времени динамику ТЦР до и после оборота в синапс с результирующей pMHC-TCR взаимодействия (Рисунок 1). LLSM поэтому может быть использован для решения текущих вопросов формирующей динамики TCRs и обеспечить понимание того, как клетка различает себя и иностранных антигенов.

Protocol

5С. C7 TCR-трансгенных RAG2 нокаут мышей в B10. Справочная информация была использована в этом исследовании в соответствии с протоколом, утвержденным институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Чикагского университета. 1. Урожай и активация Т-клеток <p class…

Representative Results

Здесь мы описываем изоляцию, подготовку и визуализацию первичной мыши 5C. C7 T-клетки с помощью решетчатого светового листового микроскопа. Во время раздела 3, необходимо выровнять микроскоп правильно, и собрать PSF ежедневно, с которым deconvolve данные после сбора. На рисунке 2м…

Discussion

Представленный протокол был оптимизирован для использования CD4и Т-клеток, изолированных от 5C. C7 трансгенных мышей на используемом инструменте LLSM, и поэтому другие клеточные системы и LLSMs, возможно, должны быть оптимизированы по-разному. Тем не менее, этот протокол показывает силу 4…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы отметить советы и рекомендации доктора Витаса Биндокаса из Чикагского университета. Мы благодарим комплексную световую микроскопию ВШЭ в Чикагском университете за поддержку и поддержание латисового светового листового микроскопа. Эта работа была поддержана NIH New Innovator Award 1DP2AI144245 и NSF Career Award 1653782 (To J.H.). J.R. поддерживается Программой стипендий для аспирантов NSF.

Materials

1 mL Syringe BD 309659 For T cell harvest
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-25ML For T cell culture
5 mm round coverslips World Precision Instruments 502040 For Imaging
70um Sterile Cell Strainer Corning 7201431 For T cell harvest
Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody BioLegend 109215 For Imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) X&Y Cell Culture FBS-500 For T cell culture
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 Denisty gradient reagent for T cell harvest
Fluorescein sodium salt Sigma-Aldrich F6377 For microscope alignment
FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres Thermo Fisher Scientific F8810 For microscope alignment
Imaris Bitplane N/A Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji).
Lattice Light-Sheet Microscope 3i N/A Microscope Used
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 21083027 For Imaging
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030-081 For T cell culture
LLSpy Janelia Research Campus N/A LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK Elimbio Custom Synthesis For T cell harvest
Penacillin/Streptamycin Life Technologies 15140122_3683884612 For T cell culture
Poly-L-Lysine Phenix Research Products P8920-100ML For Imaging
RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54 For T cell harvest
Recombinant mouse IL-2 Sigma-Aldrich I0523 For T cell culture
RPMI 1640 Medium Corning MT10040CV For T cell culture
Slidebook 3i N/A LLSM imaging software
Surgical Dissection Tools Nova-Tech International DSET10 For T cell harvest
T-25 Flasks Eppendorf 2231710126 For T cell culture
Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits Thermo Fisher Scientific 44685 For preparing Fab

References

  1. Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
  3. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  5. Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  6. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
  7. Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
  8. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  9. Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
  10. . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
  11. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
  12. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
  13. Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
  14. Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
  15. Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
  16. Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
  17. Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
  18. Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
  19. Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
  20. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
  21. Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
  22. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
  23. Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
  24. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).

Play Video

Cite This Article
Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e59914, doi:10.3791/59914 (2020).

View Video